一种基于荧光分析和邻苯二酚的3-MCPD检测方法

一种基于荧光分析和邻苯二酚的3-mcpd检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种基于荧光分析和邻苯二酚的3-mcpd检测方法。


背景技术：

2.3-mcpd具有极其明显的肾毒性和高度的遗传毒性，已被联合国国际癌症组织(iarc)工作组严格归类为2b致癌物。众所周知，3-mcpd是脂肪类或含脂肪食品中三酰甘油、磷脂或甘油与盐酸反应的副产物，经加热形成的食品加工污染物。当甘油、卵磷脂和其他甘油或其他来源的3-mcpd酯存在时，在盐酸(hcl)存在下的高温长时间加热被认为是3-mcpd形成的原因，氯离子的存在对3-mcpd及其异构体的形成很重要。3-mcpd检测的常用方法中色谱法、质谱法等检测方法检测费用昂贵、检测时间长且操作复杂，无法进行实时快速监测调味品中氯丙醇含量。由于3-mcpd在多种食品中存在，因此建立一种简单、灵敏的3-mcpd分析方法势在必行。
3.荧光分析是指利用某些物质在紫外光的激发态下，与激发态的分子发生碰撞和发射激发。可以采用反映荧光材料特性的定性或定量分析方法。荧光分析已经引起了研究者的广泛关注。研究人员发现，荧光分析是一种很好的检测手段，与传统检测方法相比，荧光分析具有灵敏度高(比分光光度法高103-104倍)、线性宽等优点。与此同时，荧光分析得到了迅速的发展，应用日益广泛。荧光信号反应速度快是其主要优点之一，可用于实时检测。所建立的荧光分析方法已广泛应用于分析领域，如无机、有机和生物大分子的测定。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种基于荧光分析和邻苯二酚的3-mcpd检测方法，该方法检测灵敏度高，操作方便且成本低，不需要大型检测设备。
5.为了达到上述技术目的，本发明提供了一种基于荧光分析和邻苯二酚的简单3-mcpd检测方法，其特征在于具体步骤如下：
6.(1)邻苯二酚溶液制备：将固体邻苯二酚溶解于超纯水中，制成邻苯二酚溶液；
7.(2)聚乙烯亚胺溶液制备：将聚乙烯亚胺标准品溶于超纯水中，制成聚乙烯亚胺溶液；
8.(3)制作3-mcpd浓度c与荧光强度t的标准曲线方程：
9.a.配制不同浓度的3-mcpd标准溶液；
10.b.针对不同浓度的3-mcpd标准溶液分别加入步骤(2)中配制的邻苯二酚溶液，并加入步骤(3)中配制的聚乙烯亚胺溶液调节ph值至8～9，每个浓度的3-mcpd标准溶液中邻苯二酚的质量浓度为0.05～0.08mg/ml；
11.c.将步骤b中加入邻苯二酚的3-mcpd标准溶液置于55～65℃温度条件下反应10～15min待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其冷却至室温，并使用荧光分光光度计进行检测，测得不同浓度3-mcpd标准溶液的对应的吸光度值；
12.d.将测得的标准溶液对应的吸光度值和3-mcpd的浓度进行线性拟合，得到吸光度值t与3-mcpd浓度c对应关系的标准曲线方程；
13.(4)将待检测样品置于容器中，重复步骤(3)的步骤b加入邻苯二酚溶液和聚乙烯亚胺溶液配制成检测溶液，然后重复步骤(3)的步骤c进行加热反应后，冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测得到检测溶液的吸光度值t，并将检测的吸光度值t代入步骤(3)的步骤d中的标准曲线方程式中计算出待检测样品中3-mcpd的浓度。
14.本发明较优的技术方案：所述步骤(3)中配制6个3-mcpd标准溶液，其浓度分别为0、0.08、0.2、0.4、0.8、2mg
·
l-1；荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测6个3-mcpd标准溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，6个3-mcpd标准溶液对应的吸光度分别为3413、3011、2713、2455、2032、449.9，将测得的标准溶液对应的吸光度值和3-mcpd的浓度进行线性拟合，得到吸光度值t与3-mcpd浓度c对应关系的标准曲线方程式为：t＝-1369.2c 3139.8。
15.本发明进一步的技术方案：所述步骤(4)待检测样品为棕榈油、酱油或自来水。
16.本发明较优的技术方案：所述步骤(3)的步骤b中加入步骤(3)中配制的聚乙烯亚胺溶液调节ph值至8.5；步骤c中将加入邻苯二酚的3-mcpd标准溶液置于60℃砂浴中反应10min待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其置于冰浴冷却至室温。
17.本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中的邻苯二酚溶液的浓度为4～8mg/ml。
18.本发明较优的技术方案：所述步骤(2)中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为5～6mg/ml。
19.本发明较优的技术方案：所述待检测样品为棕榈油时，在进行检测前对棕榈油进行前处理，其处理过程如下：
20.(1)将棕榈油按照质量体积比0.1g:0.5ml溶于异辛烷中，然后入h2so4与正丙醇混合溶液，漩涡混匀后在45℃水浴下超声15min，随后加入浓度为0.5mol/l甲醇钠溶液快速水解3min，水解完成后迅速加入正庚烷和浓度3.3％的冰醋酸溶液终止反应；其中，所述h2so4和正丙醇的混合体积比为0.5％；浓度3.3％的冰醋酸溶液是将冰醋酸溶解于浓度为0.01g/ml nacl溶液中配制而成的冰醋酸溶液；所述棕榈油与浓度为0.5mol/l甲醇钠的质量体积比为0.1g:1ml；所述棕榈油与正庚烷的质量体积比为0.1g:3ml；所述棕榈油与浓度3.3％的冰醋酸的质量体积比为0.1g:3ml。
21.(2)在步骤(1)中充分反应后除去上层有机相，用正庚烷萃取两次，除去溶液中残留的非极性成分，取下层水相即为棕榈油的样品检测溶液；每次萃取时棕榈油与正庚烷的质量体积比为0.1g:3ml。
22.本发明较优的技术方案：所述待检测样品为酱油时，在进行检测前对酱油进行前处理，其处理过程如下：将成品酱油按照质量体积比2g:3ml的比例加入浓度5mol/l的nacl溶液混合，上样固相萃取柱，先用己烷-乙醚混合溶液洗脱，然后改用乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂，加水于离心管中振荡均匀即为酱油的样品检测溶液；其中所述己烷-乙醚混合溶液是按照体积比9:1的比例混合配制而成；酱油与己烷-乙醚混合溶液的质量体积比为1g:10ml；酱油与乙醚质量体积比为2g:75ml；酱油与水的质量体积比为1g:0.25ml。
23.本发明较优的技术方案：所述待检测样品为自来水时，在进行检测前对自来水样品高速离心，上清液用0.45um滤膜过滤即得到自来水的样品检测溶液。
24.本发明中，在空气含氧条件下，邻苯二酚基逐渐转化为邻醌中间体(λmax＝
425nm)，一旦被氧化，就不能回到邻苯二酚的结构，这个过程是不可逆的。邻醌类含有发色团，在紫外光照射下呈浅黄色，3-mcpd可在一定程度上影响邻醌的形成。利用荧光分析在不同温度和不同ph下有相应的吸光度；然后加入不同浓度的3-mcpd到邻苯二酚和聚乙烯亚胺的混合溶液中，事实上，3-mcpd在碱性溶液中通过取代氯原子，很容易与邻苯二酚的羟基官能团反应。因此，3-mcpd的浓度可以通过直接测量在碱性或氧化剂条件下产生的浅黄色氧化产物的光吸收来确定。实验表明，该方法对3-mcpd提取率高，可完成对3-氯-1,2-丙二醇的检测。
25.本发明利用邻苯二酚在聚乙烯亚胺碱性环境下形成邻醌类物质，然后加入3-mcpd使其对邻醌类物质有猝灭效果。总之，基于3-mcpd猝灭的邻醌类荧光信号，建立了一种简单、有效、方便、无毒、环保、高灵敏度的3-mcpd检测方法。
附图说明
26.图1是本发明中检测过程中反应原理图；
27.图2是试验一中相同浓度的pei下不同浓度邻苯二酚的荧光强度曲线；
28.图3是试验二中相同浓度的3-mcpd下不同ph值的荧光强度曲线
29.图4是试验三中相同浓度的3-mcpd下不同温度值的荧光强度曲线；
30.图5是试验四中温度60℃，ph 8.5的条件下，不同浓度的3-mcpd溶液的荧光强度曲线；
31.图6是实施例中荧光强度与3-mcpd浓度的对应关系曲线图。
具体实施方案
32.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下对在附图中的展现的技术方案为本发明的实施例的具体方案，并非旨在限制要求保护的本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本发明提供的一种基于荧光分析和邻苯二酚的3-mcpd检测方法；依次包括邻苯二酚溶液制备，聚乙烯亚胺溶液制备，3-mcpd浓度c与荧光强度t的标准曲线方程的制作，使用荧光分光光度计进行检测得到检测溶液的吸光度值t，并将检测的吸光度值t代入上述标准曲线方程式中计算出待检测样品溶液中3-mcpd的浓度。
34.本发明的检测原理如图1所示：在空气含氧条件下，邻苯二酚基逐渐转化为邻醌中间体，邻醌类含有发色团，在紫外光照射下呈浅黄色。同时3-mcpd在碱性溶液中通过取代氯原子，很容易与邻苯二酚的羟基官能团反应。因此，3-mcpd的浓度可以通过直接测量在碱性或氧化剂条件下产生的氧化产物的荧光强度来确定。
35.针对上述检测方法，本技术的发明人进行了以下试验，试验之前先配制邻苯二酚溶液、聚乙烯亚胺溶液和3-mcpd溶液；其中，所述邻苯二酚溶液制备是通过称取40～80mg邻苯二酚固体于离心管中，加入10ml超纯水溶解，配制成4～8mg/ml的邻苯二酚溶液；聚乙烯亚胺溶液是称取55mg的聚乙烯亚胺标准品溶于离心管中，加入10ml超纯水溶解，配制成5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液；3-mcpd溶液是称取不同质量的3-mcpd标准品于离心管中，加入10ml超纯水溶解，配制成不同浓度的3-mcpd溶液。
36.试验一、选取最佳邻苯二酚浓度：取5只离心管，将其编号1，2，3，4，5，分别向编号1，2，3，4，5的离心管加入40ul，60ul，80ul，100ul，120ul的上述配制好的邻苯二酚溶液，用100ul的移液枪吸取5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液于5只离心管中，并用ph计检测，使ph达到8.5，最后向5只离心管中加入超纯水滴定至3ml。将5只离心管放置60℃砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测，荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，其检测结果如图2所示，从图2可以看出来邻苯二酚溶液浓度为0.05～0.08mg/ml时，荧光强度最强，随着浓度的增加其荧光强度降低。所以最佳的邻苯二酚浓度为0.05～0.08mg/ml。
37.试验二、选取3-mcpd猝灭邻醌类化合物的最佳ph：取5只离心管，将其编号1，2，3，4，5，用100ul的移液枪吸取20～40ul的上述配合好的浓度为4～8mg/ml邻苯二酚溶液置于5只离心管中，再分别向编号1，2，3，4，5的离心管加入不同含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使其ph为7、7.5、8、8.5、9，然后向5只离心管中分别加入30ul的浓度40ug/ml 3-mcpd溶液，最后向5只离心管中加入超纯水滴定至3ml。将5只离心管放置60℃砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测，荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，其检测结果如图3所示，从图3可以看出来一开始随着检测溶液ph的增加，其荧光强度逐渐增加，当ph达到8.5时，其荧光强度最强，超过8.5就呈直线下降。所以可以看出最佳的ph为8.5。
38.试验三、选取3-mcpd猝灭邻醌类化合物的最佳温度：取5只离心管，将其编号1，2，3，4，5，用40ul的移液枪吸取20-40ul的上述配合好的浓度为4～8mg/ml邻苯二酚溶液于5只离心管中，再向离心管中加入一定含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使其ph达到最佳ph值8.5，然后向5只离心管中分别加入30ul的浓度40ug/ml 3-mcpd溶液，最后向5只离心管中加入超纯水滴定至3ml。将5只离心管放置砂浴中，分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃条件下反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测，荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，其检测结果如图4所示，从图4可以看出来一开始随着温度增加荧光强度呈直线下降，温度40℃时，其荧光强度最低，之后随着温度增加，荧光强度呈直线上升，当温度上升至60℃时，其荧光强度最强，超过60℃又开始下降。所以可以看出最佳的反应温度为60℃。
39.试验四、3-mcpd浓度对荧光强度的影响：取6只离心管，将其编号1，2，3，4，5，6，用100ul的移液枪吸取最佳浓度0.05mg/ml的邻苯二酚溶液于6只离心管中，再向离心管中加入一定含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使ph为最佳ph值8.5，然后向6只离心管中分别加入0ul，6ul，15ul，30ul，60ul，150ul的40ug/ml 3-mcpd溶液，最后向6只离心管中加入超纯水滴定至3ml。将砂浴锅温度设置为上述最佳温度60℃，将6只离心管放置砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测，荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，其检测结果如图5所示，从图5可以看出随着3-mcpd溶液浓度的增加，其荧光度逐渐下降，表明3-mcpd对邻醌类物质有猝灭效果，可以看出3-mcpd溶液浓度与荧
光度之间的成反比。
40.下面结合实施例对本发明进一步说明，实施例中使用按照上述试验中的方法配置的邻苯二酚溶液、聚乙烯亚胺溶液和3-mcpd溶液；以下实施例中的3-mcpd浓度与荧光强度的线性关系的标准曲线制作如下：
41.a.首先配制6个3-mcpd标准溶液，其浓度分别为0、0.08、0.2、0.4、0.8、2mg
·
l-1
；
42.b.将六个不同浓度的3-mcpd标准溶液分别置于离心管中，加入上述配制好的邻苯二酚溶液，并加入上述配制好的聚乙烯亚胺溶液调节ph值至8.5，每个浓度的3-mcpd标准溶液中邻苯二酚的质量浓度为0.05mg/ml；
43.c.将步骤b中加入邻苯二酚的3-mcpd标准溶液置于60℃的砂浴加热反应10min待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其置于冰浴冷却至室温，并使用荧光分光光度计进行检测，荧光分光光度计激发光谱的波长为370nm，检测6个3-mcpd标准溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，6个3-mcpd标准溶液对应的吸光度分别为3413、3011、2713、2455、2032、449.9；
44.d.将测得的标准溶液对应的吸光度值和3-mcpd的浓度进行线性拟合，如图6所示，最终得到吸光度值t与3-mcpd浓度c对应关系的标准曲线方程式为：t＝-1369.2c 3139.8。
45.实施例一：称取0.1g棕榈油溶于500ul异辛烷中，加入0.5ml h2so4/正丙醇(v/v,0.5％)溶液，漩涡混匀后在45℃水浴下超声15min，随后加入1ml 0.5mol/l甲醇钠溶液快速水解3min；水解完成后迅速加入3ml正庚烷和3ml 3.3％的冰醋酸(溶解于0.01g/ml nacl中)终止反应；充分萃取后除去上层有机相，用3ml正庚烷萃取两次，除去溶液中残留的非极性成分，取下层水相1ml于离心管，用40ul的移液枪吸取40ul的4mg/ml邻苯二酚于离心管中，再向离心管中加入一定含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使其ph为8.5。最后向离心管中加入超纯水滴定至3ml。将离心管放置60℃砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测。使用荧光分光光度计扫描发射光谱，激发光谱的波长为370nm，样品溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，样品溶液的吸光度值为1988.62，通过标准曲线确定样品溶液中3-mcpd浓度，由公式t＝-1369.2c 3139.8经换算得出样品中3-mcpd的浓度约为0.84mg
·
l-1
。
46.实施例二：称取4g酱油，用6ml的5mol/l nacl溶液混合，上样固相萃取柱，先用40ml己烷-乙醚(90:10,v/v)洗脱，然后改用150ml乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂，加水1ml于离心管中振荡均匀，用40ul的移液枪吸取32ul的5mg/ml邻苯二酚于离心管中，再向离心管中加入一定含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使其ph为8.5。最后向离心管中加入超纯水滴定至3ml。将离心管放置60℃砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测。使用荧光分光光度计扫描发射光谱，激发光谱的波长为370nm，样品溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，样品溶液的吸光度值为1876.32，通过标准曲线确定样品溶液中3-mcpd浓度，由公式t＝-1369.2c 3139.8经换算得出样品中3-mcpd的浓度约为0.92mg
·
l-1
。
47.实施例三：取自来水样并高速离心，上清液用0.45um滤膜过滤，量取1ml处理后的水样于离心管中，用40ul的移液枪吸取20ul的8mg/ml邻苯二酚于离心管中，再向离心管中加入一定含量的5.5mg/ml聚乙烯亚胺溶液，并用ph计检测，使其ph为8.5。最后向离心管中加入超纯水滴定至3ml。将离心管放置60℃砂浴中反应10min，待其溶液出现浅黄色，停止加
热，随后将其放冰浴冷却至室温，使用荧光分光光度计进行检测。使用荧光分光光度计扫描发射光谱，激发光谱的波长为370nm，样品溶液在发射光谱波长为480nm处的荧光强度，样品溶液的吸光度值为2038.54，通过标准曲线确定样品溶液中3-mcpd浓度，由公式t＝-1369.2c 3139.8经换算得出样品中3-mcpd的浓度约为0.80mg
·
l-1
。
48.对比试验：将上述实施例一和实施例二中的棕榈油样品、酱油样品分别按照以下方式进行处理后采用进行气相色谱-质谱(gc-ms)分析，其处理过程如下：在10ml的试管中，将0.1g的油样溶于200μl的异辛烷中；加入含90u/ml脂肪酶的30％溴化钠水溶液(用柠檬酸和磷酸氢二钠水溶液调至该溶液ph为5.0)3ml后，在室温25℃下用高速振动筛垂直振荡30min，使酯水解；试管在80℃水浴中加热10min，将试管冷却至室温，加入2.0μg/ml内标液3-mcpd-d
5 50μl。接下来，加入3ml己烷，摇匀10秒，产生的水层被转移到一个新的试管中，再加入3ml己烷，摇管10秒，所得到的己烷层随后被除去。在水层中加入20μl pba溶液，用旋涡混合器搅拌10秒，进行衍生化，接下来，加入3ml己烷，摇匀10秒提取衍生物；生成的有机层被转移到一个新的试管中，并使用氮气流浓缩到大约0.5-0.8ml(用氮气喷雾器)得到检测样品。检测样品经0.2μm滤膜过滤后，进行气相色谱-质谱(gc-ms)分析，其分析结果显示样品中的3-mcpd浓度和计算的浓度几乎相同，其误差范围在
±
0.04。
49.将实施例三中自来水样品分别采用与实施例三中相同的方式进行前处理后，进行气相色谱-质谱(gc-ms)分析，其检测结果显示样品中的3-mcpd浓度和计算的浓度几乎相同，其误差范围在
±
0.04。
50.通过上述对比试验可以看出，本技术中的方法检测结果准确。
51.本发明基于3-mcpd猝灭的邻醌类荧光信号，建立了一种简单、有效、方便、无毒、环保、高灵敏度的3-mcpd检测方法。3-mcpd浓度与荧光强度呈线性关系。在0.08-2.0mg
·
l-1
范围内，线性相关系数f＝-1369.16
·
c 3139.76。相关系数为0.9930。当3-mcpd浓度在0.08mg
·
l-1-2.0mg
·
l-1
之间时，荧光强度与3-mcpd浓度呈高度线性关系(r2＝0.97792)。
52.以上所述，只是本发明的一个实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。