一种喜树碱修饰的胶原蛋白及其制备方法和应用

1.本发明涉及领域，尤其涉及方法。


背景技术：

2.喜树碱是一种主要用于治疗胃癌、结肠癌、直肠癌、头颈部癌及膀胱癌的有机生物碱类抗癌药物。喜树碱能直接破坏dna结构，其也可以与 dna结合，从而使dna更易受内切酶的攻击。喜树碱还可以抑制dna聚合酶而影响dna的复制。增殖细胞对喜树碱最为敏感，所以，其为细胞周期特异性药物，主要作用于s期，对g1、g2与m期细胞作用较弱。喜树碱对多种动物肿瘤有抑制作用，与常用抗肿瘤药无交叉耐药性。
3.喜树碱在静脉注射后大部分药物与血浆蛋白结合，在血浆、肾、肝内的半衰期为30分钟，胃肠、骨髓、肾脏含量最高，因此，其对黏膜刺激性较强，故毒性反应中以胃肠道反应及泌尿道刺激明显，骨髓抑制主要为白细胞及血小板减少。
4.有鉴于此，为了降低喜树碱的不良反应，需要提出一种新的技术方案来解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种不良反应少的喜树碱的给药方式，即使喜树碱修饰在胶原蛋白上，通过胶原蛋白进行给药。
6.本发明的第二个目的在于提供一种喜树碱修饰的胶原蛋白的制备方法。
7.本发明的第三个目的在于提供一种喜树碱修饰的胶原蛋白的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
9.一种修饰有喜树碱的琥珀酰化胶原蛋白，喜树碱与琥珀酰化胶原蛋白形成酯基而使喜树碱修饰在琥珀酰化胶原蛋白上。
10.所述胶原蛋白为ⅱ型胶原蛋白。
11.一种所述的胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
12.s1将喜树碱与琥珀酸酐于第一有机溶剂中混合，加入第一催化剂进行第一酯化反应，得到喜树碱琥珀酸酯；
13.s2将喜树碱琥珀酸酯与n-羟基琥珀酰亚胺于第二有机溶剂中混合，加入第二催化剂和脱水剂进行第二酯化反应，得到丁二酸喜树碱n-羟基琥珀酰亚胺酯；
14.s3将喜树碱琥珀酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与胶原蛋白于第三有机溶剂中混合，发生酰胺化反应即得修饰有喜树碱的琥珀酰化胶原蛋白。
15.具体的合成路线如下：
[0016][0017]
所述第一酯化反应的ph值为7.5-8.5；
[0018]
所述第一酯化反应的温度为0-30℃；
[0019]
所述第一有机溶剂包括二氯甲烷；
[0020]
所述第一催化剂包括dmap或dbu。
[0021]
所述第二酯化反应的ph值为7.5-8.5；
[0022]
所述第二酯化反应的温度为0-30℃；
[0023]
所述第二有机溶剂包括二甲基亚砜；
[0024]
所述第二催化剂包括dmap；
[0025]
所述脱水剂包括dcc。
[0026]
所述酰胺化反应的ph值为7.5-8.5；
[0027]
所述酰胺化反应的温度为0-30℃；
[0028]
所述第三有机溶剂为dmso和水的混合溶液。
[0029]
所述的修饰有喜树碱的琥珀酰化胶原蛋白的应用，应用于制备治疗癌症的药物。
[0030]
具体的，而在手术切除肿瘤组织时，不可能完全切除肿瘤细胞。因此，在术后的手术创面涂上修饰有喜树碱的琥珀酰化胶原蛋白一方面可以保护创面，另一方面，由于癌细胞的水解酶表达比正常细胞高，因此。修饰有喜树碱的琥珀酰化胶原蛋白会在水解酶高表达的癌细胞周围水解，得到喜树碱，从而靶向抑制癌细胞的生长。而由于正常细胞的水解酶表达较低，从而影响较小，不良反应少。
[0031][0032]
相比于现有技术，本发明带来以下技术效果：
[0033]
本发明提供的胶原蛋白与喜树碱连接后，可使喜树碱在递送时具有一定的靶向作用，同时不良反应相对较少。
[0034]
本发明提供的胶原蛋白与喜树碱连接后可提高喜树碱的生物利用度。
[0035]
本发明提供的胶原蛋白的制备方法简单，成本低，可工业化生产。
[0036]
本发明提供的胶原蛋白可以制备成多种剂型来治疗癌症。
附图说明
[0037]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0038]
图1示出了喜树碱修饰的胶原蛋白的uv-vis图谱。
[0039]
图2示出了喜树碱的浓度对肺癌nci-h460细胞抑制作用的关系图。
[0040]
图3示出了喜树碱修饰的胶原蛋白的浓度，对肺癌nci-h460细胞的抑制率的关系图。
[0041]
图4示出了喜树碱的浓度对肺癌a549细胞抑制作用的关系图。
[0042]
图5示出了喜树碱修饰的胶原蛋白的浓度，对肺癌a549细胞的抑制率的关系图。
[0043]
图6为采用流式细胞术检测喜树碱修饰的胶原蛋白和喜树碱单独用药及联合用药诱导nci-h460细胞凋亡的实验结果图。
[0044]
图7示出了肿瘤组织体积与给药时间关系图。
[0045]
图8示出了实施例8中裸鼠肿瘤大小与给药时间关系图。
[0046]
图9示出了实施例9中对照组、喜树碱修饰的胶原蛋白组和喜树碱组中的裸鼠肝重对比图。
[0047]
图10示出了实施例9中对照组、喜树碱修饰的胶原蛋白组和喜树碱组中的裸鼠肌酸酐对比图。
[0048]
图11示出了实施例9中对照组、喜树碱修饰的胶原蛋白组和喜树碱组中的裸鼠肾重对比图
[0049]
图12示出了实施例9中对照组、喜树碱修饰的胶原蛋白组和喜树碱组中的谷丙转氨酶对比图。
具体实施方式
[0050]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0051]
实施例1
[0052]
在50ml的圆底烧瓶中依次加入喜树碱(1mmol,1eq)、琥珀酸酐 (1.5mmol,1.5eq.)和dmap(0.5mmol,0.5eq)，然后在n2的保护下，加入二氯甲烷(10.0ml)，常温下反应约6h，反应完毕后，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，得到喜树碱琥珀酸酯。
[0053]
喜树碱琥珀酸酯：白色晶体，收率97.9％。
[0054]
实施例2
[0055]
在50ml的圆底烧瓶中依次加入实施例1制备得到的喜树碱琥珀酸酯 (1mmol,1eq)、n-羟基琥珀酰亚胺(1.5mmol,1.5eq.)、dcc(1.5mmol,1.5eq) 和dmap(0.5mmol,0.5eq)，然后在n2的保护下，加入二甲基亚砜(10.0ml)，常温下反应约6h，反应完毕后，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得丁二酸喜树碱n-羟基琥珀酰亚胺酯。
[0056]
所得丁二酸喜树碱n-羟基琥珀酰亚胺酯：白色晶体，收率96.2％。
[0057]
实施例3
[0058]
在50ml的圆底烧瓶中依次加入实施例2制备得到的丁二酸喜树碱n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺酯(1mmol,1eq)、ⅱ型胶原蛋白(含1.5mmol胺基,1.5eq.)、dcc(1.5mmol,1.5eq)和dmap(0.5mmol,0.5eq)，然后在n2的保护下，加入二甲基亚砜(10.0ml)，在25℃下反应约6h，反应完毕后，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得喜树碱修饰的胶原蛋白。
[0059]
所得喜树碱修饰的胶原蛋白：白色固体，收率92.2％。图1示出了喜树碱修饰的胶原蛋白的uv-vis图谱。从图中可以看出，喜树碱修饰在了胶原蛋白上。
[0060]
实施例4
[0061]
在50ml的圆底烧瓶中依次加入实施例2制备得到的丁二酸喜树碱n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺酯(1.5mmol,1eq)、ⅱ型胶原蛋白(含1.5mmol胺基,1.5eq.)、 dcc(1.5mmol,1.5eq)和dmap(0.5mmol,0.5eq)，然后在n2的保护下，加入二甲基亚砜(10.0ml)，在25℃下反应约6h，反应完毕后，抽滤，将滤饼依次使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗涤后，干燥，即得喜树碱修饰的胶原蛋白。
[0062]
实施例5
[0063]
喜树碱修饰的胶原蛋白用药48h对肺癌nci-h460细胞增殖的抑制作用
[0064]
将肺癌nci-h460细胞接种于无菌96孔板中，培养48h后，加入浓度为0-100μm的喜树碱修饰的胶原蛋白或0-50μm的喜树碱形成两组对比组。对照组加入等体积的1640培养液，每个浓度设置5个复孔。培养48h 后，每孔加入5μg/ml mtt，继续培养4h。加入150μl dmso，缓慢振荡 10min，使其溶解生成的蓝紫色结晶formazan。在570nm处检测每个孔对应的吸光度a值，并利用以下公式来计算细胞抑制率：
[0065]
抑制率＝(1-给药组平均a值/对照组平均a值)
×
100％
[0066]
由图2可知，喜树碱对肺癌nci-h460细胞表现出一定的抑制作用。由图3可知，喜树碱修饰的胶原蛋白，可以有效提升其对肺癌nci-h460细胞的抑制率，并伴随剂量依赖性。
[0067]
实施例6
[0068]
喜树碱修饰的胶原蛋白用药48h对肺癌a549细胞增殖的抑制作用
[0069]
将肺癌a549细胞接种于无菌96孔板中，培养48h后，加入浓度为0-100 μm喜树碱修饰的胶原蛋白，或0-50μm喜树碱。对照组加入等体积的1640 培养液，每个浓度设置5个复孔。培养48h后，每孔加入5μg/ml mtt，继续培养4h。加入150μl dmso，缓慢振荡10min，使其溶解生成的蓝紫色结晶formazan。在570nm处检测每个孔对应的吸光度a值，并利用以下公式来计算细胞抑制率：
[0070]
抑制率＝(1-给药组平均a值/对照组平均a值)
×
100％
[0071]
由图4可知，喜树碱对肺癌a549细胞表现出一定的抑制作用。由图5 可知，喜树碱修饰的胶原蛋白可以有效提升其对肺癌a549细胞的抑制率，并伴随剂量依赖性。
[0072]
实施例7
[0073]
喜树碱修饰的胶原蛋白对肺癌nci-h460细胞诱导凋亡作用
[0074]
将肺癌nci-h460细胞接种于无菌6孔板中，培养24h后，加入浓度为 0-50μm的喜树碱修饰的胶原蛋白，或0-25μm喜树碱。对照组加入等体积的1640培养液，每个浓度设置5个复孔。继续培养48h后，加入冰冷的pbs 洗涤2-3次，加入1
×
binding buffer缓冲液，吹打均匀，滴加适量的av/pi 混合染液，避光孵育15min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。
[0075]
图6为采用流式细胞术检测喜树碱修饰的胶原蛋白和喜树碱单独用药及联合用药诱导nci-h460细胞凋亡的实验结果图，得到由四个象限组成细胞直方图，区域q1表示实验操作过程中出现机械损伤的细胞，区域q2表示发生晚期凋亡的细胞，区域q3表示功能形态正常的细胞，区域q4表示发生早期凋亡的细胞。由图3可知，喜树碱能够诱导肺癌nci-h460细胞发生一定的凋亡作用，区域q4所代表的发生凋亡的细胞百分率呈现缓慢增加的趋势，喜树碱修饰的胶原蛋白促使肺癌凋亡细胞的百分率显著提升。当喜树碱浓度为25μm时，nci-h460细胞的早期凋亡率为14.12％(对照组的早期凋亡率为3.12％)；当喜树碱浓度为50μm时，nci-h460细胞早期凋亡率为17.45％(对照组的早期凋亡率为3.67％)；当喜树碱修饰的胶原蛋白浓度为50μm时，nci-h460细胞早期凋亡率为45.38％(对照组的早期凋亡率为3.63％)，进一步证明喜树碱修饰的胶原蛋白可促使肺癌细胞加速凋亡，从而起到治疗肺癌的作用。
[0076]
实施例8
[0077]
喜树碱修饰的胶原蛋白用药对肺癌移植瘤模型的抑制作用
[0078]
将雄性balb/c裸鼠于室温下饲养，待其适应环境后，向其接种 nci-h460细胞，每只裸鼠注射3-4
×
106个细胞。接种7天后，观察裸鼠左腋窝皮下，发现裸鼠接种部位有米粒大小的结节生成。继续饲养，肿瘤尺寸超过100mm3时，剔除肿瘤尺寸和体重差异较大的裸鼠，并将剩余的荷瘤裸鼠进行随机分组。本实验将所有荷瘤裸鼠分为以下3组：(1)模型组； (2)40mg/kg喜树碱；(3)15mg/kg喜树碱修饰的胶原蛋白。模型组给予聚乙二醇和水的混合液(体积比为1:1)。其余组均按照荷瘤裸鼠的体重灌胃给药，每天给药一次。每隔7天测量荷瘤裸鼠的体重、肿瘤体积及饮食变化，并及时观察记录。等到35天以后，停止给药，处死所有小鼠，剥离肿瘤块，逐一称重、记录并收集。
[0079]
由图7可知，和模型组相比，给药35天时，喜树碱组对肺癌裸鼠移植瘤的抑制率为21.22％，表明喜树碱单独用药对肺癌裸鼠移植瘤具有一定的抑制作用。喜树碱修饰的胶原蛋白组可减慢裸鼠肿瘤体积的增长，相应的抑瘤率为67.31％，具有显著效果。和模型组相比，喜树碱组裸鼠体重呈现减少趋势，喜树碱修饰的胶原蛋白组裸鼠体重没有明显差异，表明其对裸鼠的安全性较高。综上所述，喜树碱修饰的胶原蛋白组能够明显阻碍肺癌裸鼠移植瘤的生长，其抑制率显著高于喜树碱组，并对裸鼠表现出低毒副作用。
[0080]
实施例9
[0081]
喜树碱修饰的胶原蛋白用药的体内安全性评价
[0082]
将雄性健康icr小鼠饲养于室温环境中，自由饮食，相对湿度为 50-60％，12h白天/12h黑夜。饲养1周，待其适应环境后，禁食12h。12h 后，将小鼠随机分为3组：(1)对照组；(2)40mg/kg喜树碱修饰的胶原蛋白组(3)40mg/kg喜树碱。以上3组均以灌胃方式给药。给药6h后，取消禁食，正常喂养小鼠14天。观察小鼠饮水、摄食、体重及肝肾功能变化。
[0083]
和对照组相比，喜树碱修饰的胶原蛋白组小鼠的肝脏重量、肾脏重量、血清中谷丙转氨酶含量及血清中肌氨酸酐含量均未发生明显改变，喜树碱组小鼠的肝脏重量、肾脏重量、血清中谷丙转氨酶含量及血清中肌氨酸酐含量均发生轻微改变。由此可见，喜树碱修饰的胶原蛋白对健康小鼠表现出一定的安全性。
[0084]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。