含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品中氨基酸的检测方法与流程

1.本发明属于口腔清洁护理用品(牙膏、凝胶、漱口水等)检测方法技术领域，尤其是含美洲大蠊的口腔清洁护理用品中氨基酸含量的检测方法。


背景技术：

2.美洲大蠊是一种具有代表性的动物药，成分中含有较多的药效成分，如氨基酸、蛋白质、多肽以及小分子化合物，其中大部分物质为内源性化合物(体内存在)，有少部分为外源性化合物(体内向外释放)。据现代药理学研究，美洲大蠊提取物具有抗炎抗菌、促进组织修复、抑制肿瘤生长、保肝、愈合创伤等作用。美洲大蠊提取物被应用于康复新液中，可外敷也可内服，有促进组织修复、调节免疫功能、修复骨缺损、肺纤维化、抗菌消炎、去腐生肌的妙用。近几年，其修复组织、愈合创伤的功效被研究者发掘用于口腔护理用品领域，以起到对口腔黏膜的修复、促进口腔溃疡的愈合、减轻牙龈炎症等作用。据qb/t 2966-2014《功效型牙膏》要求，功效牙膏中功效成分应进行定性或定量检测，但目前尚未有相关标准能够对其在口腔清洁护理用品中的含量进行检测，因此建立口腔清洁护理用品尤其是牙膏中美洲大蠊提取物含量的检测方法，对于保证牙膏产品质量，保障消费者权益和健康，以及完善牙膏产品检验技术体系，都有积极意义。氨基酸是美洲大蠊提取物所含各种活性成分中的一类，通过检测氨基酸含量可间接监测美洲大蠊提取物含量。
3.多肽也是美洲大蠊提取物所含的活性成分中的一类，目前qbt 5287-2018《口腔清洁护理用品牙膏用美洲大蠊提取物》中采用的是福林酚法检测多肽，但福林酚试剂在碱性条件下可与酚羟基发生颜色反应，而牙膏、凝胶、漱口水中黄原胶、多元醇等原料均易与福林酚发生反应带来干扰，故该法只适用于美洲大蠊提取物原料的检测而不适用于添加到口腔清洁护理品体系中的美洲大蠊提取物多肽成分的检测。氨基酸是美洲大蠊提取物的重要活性成分之一，美洲大蠊中氨基酸的检测方法有分光光度法、化学发光法、液相色谱法、气相色谱法、荧光光谱法、毛细管电泳法等，它们各有优缺点。采用氨基酸分析仪直接检测简单快捷，但氨基酸分析仪专一性强，仪器昂贵，具有不普遍、成本高等缺点。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)是目前对于氨基酸分析检测用得最多的方法，也是氨基酸研究的热点方法，大多数氨基酸几乎无紫外吸收、无荧光发射，故分光光度法、气相色谱法、液相色谱法等联用紫外或荧光检测器时都需要对氨基酸进行衍生，衍生方法可分为柱前衍生与柱后衍生。柱前衍生能够相对自由的选择反应条件、有较多的衍生试剂可选择，不需要复杂的仪器，但其衍生后的副产物可能会对色谱的分离造成困难，也容易损失样品或是引入杂质；柱后衍生则引入杂质少，重现性好，分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用已有的分析方法，但是柱后衍生对溶剂和反应时间有较高要求，目前只有有限的反应可供选择，而且可能会存在扩散问题。据文献报道，目前常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛(opa)、芴甲氧羰酰氯(fmoc-cl)、异硫氰酸苯酯(pitc)、丹磺酰氯(dansyl-cl)、6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(aqc)，以及一些合成的新型衍生试剂。opa反应速度快，但不能同时衍生一、二级氨基酸，且衍生产物不稳定；fmoc-cl速度快，
产物稳定，但试剂本身和水解产物会干扰分析；dansyl-cl产物稳定，但反应活性差、速度慢；aqc的衍生产物虽稳定，操作简单，但衍生分离度不高，需要用超高效液相色谱进行分析；pitc遇水易产生结晶、毒性大、对色谱柱有损伤。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种通过优化前处理条件、衍生化反应条件、色谱条件等来建立可检测含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品中游离氨基酸含量的方法，以完善和规范口腔清洁护理用品的检测体系，保证口腔护理产品的有效性和安全性，维护消费者权益，并为相关部门的市场监管提供技术支撑和依据。
5.本发明采取的技术方案如下：
6.含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品中游离氨基酸的检测方法，方法步骤如下：
7.(1)取含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品试样和萃取剂，试样和萃取剂的质量比为1:2～1:50，同时加入试样质量2～40％的无机盐，依序通过涡旋、超声、离心方式对试样进行辅助萃取；；所述萃取剂为体积浓度25～100％的甲醇-水溶液、体积浓度25～100％的乙醇-水溶液、体积浓度25～100％的乙腈-水溶液、100％去离子水中的一种；所述无机盐为硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、氯化钾、碳酸钠中的一种；
8.(2)收集萃取后的上清液，在50～100℃条件下进行浓缩复溶；
9.(3)向浓缩复溶溶液中加入浓缩复溶溶液质量0.2～1.0％的碱性乙腈溶液和浓缩复溶溶液质量0.2～1.0％的衍生试剂异硫氰酸苯酯进行涡旋混合，在碱性条件下于20～50℃反应5～240min，得到衍生化溶液；所述碱性乙腈溶液是指含氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钡、三乙醇胺中任一种的乙腈溶液；
10.(4)用有机溶剂对衍生化溶液进行反萃取，去除过量的衍生试剂异硫氰酸苯酯；所述有机溶剂为环己烷、正己烷、庚烷、己烷、戊烷中的一种；
11.(5)将反萃取后的溶液离心，弃去上层液，取下层液，采用高效液相色谱法，在梯度洗脱条件下进样检测254nm处的峰面积，通过保留时间定性、外标一点法定量。
12.进一步地，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
13.a.色谱柱：氨基酸专用c18色谱柱或其他等效色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
14.b.流动相a：0.1mol/l且ph值6.5的乙酸钠溶液：乙腈(v/v)＝93.0:7.0；
15.流动相b：乙腈：水(v/v)＝80.0:20.0；
16.c.流速：1ml/min；
17.d.检测波长：254nm；
18.e.柱温：40℃；
19.f.进样量：5μl；
20.梯度洗脱进样过程如下：
21.在第0.01分钟时，流动相a进样100％，流动相b进样0；
22.在第11分钟时，流动相a进样93.0％，流动相b进样7.0％；
23.在第13.9分钟时，流动相a进样88.0％，流动相b进样12.0％；
24.在第14分钟时，流动相a进样85.0％，流动相b进样15.0％；
25.在第29分钟时，流动相a进样66.0％，流动相b进样34.0％；
26.在第32分钟时，流动相a进样30.0％，流动相b进样70.0％；
27.在第35分钟时，流动相a进样0％，流动相b进样100.0％；
28.在第42分钟时，流动相a进样0％，流动相b进样100.0％；
29.在第45分钟时，流动相a进样100.0％，流动相b进样0％；
30.在第60分钟时，流动相a进样100.0％，流动相b进样0％。
31.进一步地，上述步骤(1)中，所述涡旋方式的旋涡转速为200～3000rpm，旋涡时间1～20min；所述超声方式的超声波频率10～60hz，超声时间1～50min；所述离心方式的离心转速为500～100000rpm,离心时间1～20min；辅助萃取次数为1～5次。
32.进一步地，所述浓缩复溶，是将上清液倒入蒸发皿中重复萃取一次，然后蒸干，冷却至室温，再加入甲醇复溶。
33.本发明具有如下有益效果：
34.本发明通过无机盐辅助萃取，减少了二氧化硅团聚效应对前处理效率的影响，使本方法适用于几乎所有市售磷钙和二氧化硅基质的口腔清洁护理品，如牙膏、凝胶、漱口水等。通过涡旋加速膏体在萃取剂中的分散，通过超声辅助提高萃取率，通过离心加速萃取液与半固体相分离，然后复溶浓缩，缩短了萃取时间，提高了萃取率。本发明采用在适当的碱性条件下进行衍生化，加速了衍生化反应进程。通过采用适宜的有机溶剂进行反萃，减少了pitc对色谱柱的损伤。通过选择不同ph范围不同无机盐缓冲溶液体系、不同极性有机溶剂，以及在同一个分析周期中，在一定程度不断改变流动相的浓度配比，优化了梯度洗脱程序，减少了口腔清洁护理品基质的干扰且大大提高了分离效率。本发明方法简单易操作、过程可控、灵敏度高，易于推广。本发明通过回收率及精密度实验验证，证明本发明方法适用于含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品中氨基酸含量的检测和进行质量控制。
附图说明
35.图1是空白(水)衍生色谱图；
36.图2是五种氨基酸标准溶液衍生色谱图；
37.图3是牙膏样品溶液衍生色谱图。
具体实施方式
38.下面结合实施例进一步阐述本发明的内容。
39.含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品中氨基酸的检测方法，方法如下：
40.(1)牙膏样品前处理：精密称取4.0000g含美洲大蠊提取物的牙膏,置于50ml离心管中，加入0.5gnacl和体积浓度50％的甲醇-水溶液20ml，涡旋1min，涡旋转速≥2000rpm，然后放入超声清洗器中35hz超声30min，再放入离心机中6000rmp离心5min。之后收集萃取后的上清液，重复萃取一次，合并两次萃取的上清液，进行浓缩复溶。浓缩复溶的过程是：将上清液倒入蒸发皿中，置于80-85℃水浴锅上蒸干，冷却至室温，加入少量甲醇复溶于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，放置待用。
41.(2)样品衍生化：取上述牙膏样品前处理后的溶液800μl，置于ep管中，加入配置好的pitc-乙腈溶液和tea-乙腈溶液各400μl，充分涡旋混匀，于30℃静置衍生60min；然后加
入1600μl正己烷，涡旋，用滴管将上层液取出弃去，再加正己烷重复反萃一次，弃去上层液，取下层液800μl用适量超纯水稀释，0.22μm滤头过滤，取续滤液待测。
42.本发明采用pitc作为衍生化试剂。pitc虽遇水产生结晶、毒性大、对色谱柱有损伤，但是由于其在本发明方法中反应条件不高、反应迅速、产物稳定，并且可以通过将衍生试剂反萃出来的方法保护色谱柱。
43.(3)设定色谱条件并进行检测：
44.色谱柱：采用月旭uitimate aa氨基酸专用柱。流动相a为0.1mol/l的醋酸钠溶液(ph＝6.5)：乙腈＝93.0:7.0(v/v)。准确称取13.60g三水合醋酸钠置于1000ml水中，搅拌至溶解充分，用冰醋酸或氢氧化钠将ph调为6.50，准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液930ml和乙腈70ml，混合均匀，抽滤后超声30min。流动相b为乙腈：水＝80.0:20.0(v/v)。用量筒准确量取800ml乙腈和200ml水，有机滤膜抽滤，超声30min。柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1ml/min；进样量：5μl。
45.采用高效液相色谱法，按表1的梯度洗脱程序表进样检测254nm处的峰面积，通过保留时间定性，采用现有技术的外标一点法定量。
46.表1.梯度洗脱程序表
47.时间(min)a％b％0.01100.00.01193.07.013.988.012.01485.015.02966.034.03230.070.0350.0100.0420.0100.045100.00.060100.00.0
48.检测结果见图3的牙膏样品溶液衍生色谱图。由色谱图可看出各氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸)衍生物对应的保留时间/色谱峰，根据峰面积可计算出各氨基酸含量。
49.图1为空白(水)衍生色谱图，hplc进样样品为超纯水，没有进行前处理萃取。
50.(4)验证：
51.a.方法重复性:取同一批号的含美洲大蠊提取物的牙膏样品，按上述步骤(1)的牙膏前处理方法制备6份样品，再按步骤(2)的方法进行衍生，进样测定，测得甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸的含量平均值为4.40、16.82、6.88、9.62、13.75mg/100g，rsd分别为4.83％、4.40％、5.29％、4.68％、4.35％(n＝6)，结果表明样品重复性良好。
52.b.线性关系、检出限及定量限:见表2
53.表2. 5种氨基酸的标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限
[0054][0055]
图2是五种氨基酸标准溶液衍生色谱图，由图2可以看到，五种氨基酸衍生产物得到充分分离，分离度均大于1.5。
[0056]
c.衍生产物的稳定性：取同一份衍生化后的样品及混合标准溶液，分别在0，2，6，10，16、24h进样测定，样品溶液中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸峰面积的rsd分别为0.35％、2.11％、2.33％、0.97％、1.56％(n＝6)，混合标准溶液中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸峰面积的rsd分别为0.29％、1.11％、0.38％、0.74％、2.26％(n＝6)，结果显示样品及标准品溶液在24h内稳定性良好。
[0057]
d.样品加标回收率及精密度：见表3
[0058]
表3. 5种氨基酸在牙膏样品中的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)
[0059][0060]
上述实施例只是本发明的一个典型实施例，并非对本发明保护范围的限制。本发明方法步骤中的具体物料比例和技术参数并不仅限于上述实施例。本发明方法中，取含美洲大蠊提取物的口腔清洁护理品试样和萃取剂时，试样和萃取剂的质量比可以在1:2～1:50范围内，加入的无机盐可以为试样质量的2～40％。萃取剂可以为体积浓度25～100％的甲醇-水溶液、体积浓度25～100％的乙醇-水溶液、体积浓度25～100％的乙腈-水溶液、100％去离子水中的任意一种。所用无机盐可以为硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、氯化钾、碳酸钠中的任意一种。上清液浓缩复溶的温度可以为50～100℃。浓缩复溶溶液中加入的碱性乙腈溶液和衍生试剂异硫氰酸苯酯的加入量均可以为浓缩复溶溶液质量的0.2～1.0％，并可在碱性条件下于20～50℃反应5～240min，碱性乙腈溶液是指含氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化
钡、三乙醇胺中任一种的乙腈溶液。所述涡旋方式的旋涡转速可以为200～3000rpm，旋涡时间为1～20min。所述超声方式的超声波频率可以为10～60hz，超声时间1～50min。所述离心方式的离心转速可以为500～100000rpm,离心时间1～20min。辅助萃取的次数可以为1～5次。