一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法

1.本发明涉及一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法，属于生物信息检测技术领域。


背景技术：

2.近年来，肥胖成为一个主要公共卫生问题，它被定义为足以损害健康的脂肪组织积累，脂肪细胞成为治疗肥胖的新靶点。然而大多数研究都使用破坏性技术来单方面评估组织或细胞特性。同时，脂滴是脂肪细胞内脂质储存器官，在糖尿病、肥胖症和动脉粥样硬化等脂质积聚疾病中起关键作用，但脂滴生物学的许多方面仍是未知的。这是由于目前使用外源性标记物通过侵入性成像方法监测其形成和重塑，因此，可靠的非侵入性、无标记和非破坏性技术对于表征脂肪细胞的形态和功能具有重要价值。
3.在脂肪的检测方法中，正电子发射断层扫描-计算机断层扫描、核磁共振成像、红外热成像、原子力纳米检测技术、拉曼光谱检测等技术取得了显著进展，但其各自存在一定的局限性。例如正电子发射断层扫描-计算机断层扫描检测技术是一种昂贵、耗时且具有相对侵入性的技术；核磁共振成像只能在脂肪组织水平进行检测，造成检测层次无法向细胞迈进的特点，红外热成像对身体更深区域的脂肪检测不明显。
4.拉曼光谱是探究生化系统中样品结构和功能的强大探针，它可以提供定量信息，具有高灵敏度和特异性，而且不需要使用标记来研究生物相关分子。与红外光谱相比，拉曼光谱呈现出另一个重要的优点，即不受水的干扰，因此生物学研究可以在体内条件下进行。与此同时，原子力显微镜不仅仅可以进行细胞的成像检测，还能获得细胞力学特性参数，这一技术扩大了脂肪细胞的生物信息检测角度。我们可以通过利用光谱的形状或者强度的变化来探究关于核酸、脂质、蛋白质和其他组成物质及其结构的细胞内信息，利用原子力纳米检测系统能够从单细胞形貌和力学的角度检测出样品间的差异。
5.目前国内外尚没有将生物内化学检测与生物力学检测结合起来的检测手段，将拉曼光谱与原子力纳米检测技术相结合的脂肪检测方法还没有被应用和推广，但两种技术单独检测脂肪细胞的研究现状也不断发展，它们将检测从组织向细胞水平推进了一步，因此对这种联用手段提出了新的技术需求。


技术实现要素：

6.本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法，具有准确、高效、无标记、非入侵性的特点，将检测水平从脂肪组织向活的单脂肪细胞更近了一步，并且达到了原子力纳米技术实现细胞外部和拉曼技术实现细胞内部同时实时检测的技术，得到的生物检测信息更为全面。
7.本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法，其特征在于，包括样品模块(1)，压电陶瓷纳米位移平台(2)，压电陶瓷纳米位移平台控制模块(3)，原子力显微检测模块(4)，原子力四象限光电检测数据采集模块
(5)，拉曼系统检测模块(6)，拉曼光谱数据采集模块(7)，拉曼系统位移平台控制模块(8)，光学显微镜模块(9)，计算机控制系统(10)；
8.压点陶瓷纳米位移平台控制模块(3)控制压电陶瓷纳米位移平台(2)使样品模块(1)发生精确移动；
9.原子力显微检测模块(4)与原子力四象限光电检测数据采集模块(5)构成原子力显微装置的检测和数据采集过程；
10.拉曼系统位移平台控制模块(8)控制拉曼系统检测模块(6)以一定的角度倾斜介入原子力显微装置中，拉曼光谱数据采集模块(7)用来采集脂肪细胞样品的拉曼光谱信号；
11.光学显微镜模块(9)用来辅助调节原子力显微检测模块(4)、拉曼系统检测模块(6)与样品模块(1)之间的位置关系；
12.计算机控制系统(10)参与压电陶瓷纳米位移平台控制模块(3)和拉曼系统位移平台控制模块(8)的控制工作，将原子力四象限光电检测数据采集模块(5)和拉曼光谱数据采集模块(7)采集到的信息收集起来，反应出光学显微镜模块(9)下的样品状态和位置，设定原子力显微检测模块(4)和拉曼系统检测模块(6)的参数；
13.所述样品模块(1)，包括脂肪细胞，样品台，基底；
14.所述原子力显微镜检测模块(4)，包括原子力显微镜探针，悬臂梁，激光器；
15.所述拉曼系统检测模块(6)，包括波长为532nm的he-ne激光器；
16.所述拉曼光谱数据采集模块(7)，包括光谱ccd，光谱仪；
17.检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法如下所述：利用拉曼原子力显微镜在恒力接触模式下测量脂肪细胞外部形貌和内部脂质拉曼光谱，包括以下步骤：
18.(1)将标准样品硅片放置于样品台上，使拉曼光源聚焦在标准样品硅片上并进行校准，并用脂肪细胞替换掉标准样品硅片；
19.(2)控制纳米位移平台在x、y、z轴方向进行移动，移动拉曼原子力显微装置探针，将探针和拉曼光源精确定位到目标脂肪细胞上；
20.(3)设定系统参数，使拉曼原子力显微装置探针与脂肪细胞膜在恒力模式下接触，同时测量脂肪细胞的形貌图和拉曼光谱数据。
21.所述拉曼原子力显微装置探针为硅材质探针，针尖为四锥形，针尖的曲率半径为6nm。
22.所述纳米位移平台为压电陶瓷，位移范围为100μm
×
100μm
×
100μm，移动精度为2nm，能够实现精确定位。
23.所述拉曼光源为532nm激光器的激发光源，最大的激光功率为50mw。
24.所述步骤(3)中的系统参数设定通过软件编程实现，拉曼原子力显微装置探针粗进针以30-40nm的步长逐渐接近待测单个脂肪细胞，待针尖与脂肪细胞膜接触后，停止进针，使用接触扫描模式获得脂肪细胞的形貌图。
25.所述步骤(3)中的系统参数设定通过软件编程实现，拉曼激光器积分时间为30s，激发功率100％，接收的数据波长范围设定为2700～3200cm-1
，获得脂肪细胞内部脂质大分子的拉曼光谱图。
26.通过设定测量参数，根据原子力显微成像系统和拉曼反馈系统，原子力探针与单个脂肪细胞之间以恒定力接触，使得拉曼原子力装置探针与单个脂肪细胞膜表面的接触稳
定，从而在纳米尺度上获取单个脂肪细胞的外部形貌和内部脂质拉曼光谱。
27.本发明与现有方法和系统相比有以下优点：
28.(1)结合测量脂肪细胞的生理特性，通过原子力显微测力原理及力反馈信息，能够实现精确测量，操作具有高度灵活性、精确性，能够实现在纳米尺度上对样品形貌的精细观察分析，有利于对细胞尺寸、形状、结构和功能的研究。
29.(2)拉曼系统作为测量脂肪细胞内部脂质信息的工具，能够获得较高精度的脂质拉曼光谱数值。
30.(3)传统医学技术无法对活细胞进行观测，对生物样品损伤极大，染料的保护则破坏了样品本身的形态。通过拉曼原子力显微装置能够精确定位待测脂肪细胞，对脂肪细胞进行无损、实时测量，获得稳定的反馈信号。
31.(4)通过软件可以设定两种测量模式：先进行原子力显微镜形貌和力学检测再进行拉曼光谱检测，同时进行原子力显微镜和拉曼光谱检测，能够对比该检测方法的时效性。
32.(5)可测量分子尺度的物理属性并在亚微米尺度上实现化学结构的分析，拉曼和afm同步测量确保了图像之间的真实相关性，同时集成了拉曼光谱仪和原子力显微镜的功能，可在同一个样品上，以相同的位置，相同的时间采集拉曼光谱和afm数据，可在纳米尺度上研究材料的组成，结构和特性，且能消除因样品表面特性随着时间而发生变化对检测结果造成的影响。原位测量，无需在不同仪器之间移动样品，节约时间，保证正确的分析区域。
附图说明
33.图1为本发明系统示意图；
34.图2为本发明拉曼原子力显微装置检测脂肪细胞原理示意图；
35.图3为本发明在光学显微镜下脂肪细胞的光学图像；
36.图4为本发明原子力显微镜下脂肪细胞形貌图，其中(a)为原子力显微镜下脂肪细胞的平面形貌图，(b)为原子力显微镜下脂肪细胞的3d形貌图；
37.图5为本发明在拉曼光源下2700～3200cm-1
波长范围的的脂质拉曼光谱；
具体实施方式
38.下面结合附图，对本发明例子做进一步详细说明。
39.如图1所示，为本发明原理框图，其中包括样品模块1，压电陶瓷纳米位移平台2，压电陶瓷纳米位移平台控制模块3，原子力显微检测模块4，原子力四象限光电检测数据采集模块5，拉曼系统检测模块6，拉曼光谱数据采集模块7，拉曼系统位移平台控制模块8，光学显微镜模块9，计算机控制系统10；
40.压点陶瓷纳米位移平台控制模块3控制压电陶瓷纳米位移平台2使样品模块1发生精确移动；原子力显微检测模块4与原子力四象限光电检测数据采集模块5构成原子力显微装置的检测和数据采集过程；拉曼系统位移平台控制模块8控制拉曼系统检测模块6以一定的角度倾斜介入原子力显微装置中，拉曼光谱数据采集模块7用来采集脂肪细胞样品的拉曼光谱信号；光学显微镜模块9用来辅助调节原子力显微检测模块4、拉曼系统检测模块6与样品模块1之间的位置关系；计算机控制系统10参与压电陶瓷纳米位移平台控制模块3和拉曼系统位移平台控制模块8的控制工作，将原子力四象限光电检测数据采集模块5和拉曼光
谱数据采集模块7采集到的信息收集起来，反应出光学显微镜模块9下的样品状态和位置，设定原子力显微检测模块4和拉曼系统检测模块6的参数；
41.所述样品模块1，包括脂肪细胞，样品台，基底；
42.所述原子力显微镜检测模块4，包括原子力显微镜探针，悬臂梁，激光器；
43.所述拉曼系统检测模块6，包括波长为532nm的he-ne激光器；
44.所述拉曼光谱数据采集模块7，包括光谱ccd，光谱仪；
45.如图2所示，为本发明拉曼原子力显微装置检测脂肪细胞原理图，其中包括原子力显微装置激光器11，四象限光电探测器12，原子力显微装置探针13，样品台14，脂肪细胞15，拉曼532nm激光器16。
46.图1和图2所示，本发明实现为：
47.在光学显微镜9下，将标准样品硅片放置于样品台1上，使拉曼光源6聚焦在标准样品硅片上并进行校准，用脂肪细胞15替换掉标准样品硅片；控制纳米位移平台2在x、y、z轴方向进行移动，移动原子力显微镜探针4，将原子力显微镜探4和拉曼光源6精确定位到目标脂肪细胞15上；在光学显微镜下9，观察脂肪细胞15状态，移动原子力显微镜探针4将其尖端放到待测细胞15的正上方；设定软件参数，使原子力显微镜探针4与脂肪细胞15膜在恒力模式下接触，同时测量脂肪细胞15的形貌图和拉曼光谱数据。
48.所述原子力显微镜探针4为硅材质探针，针尖为四锥形，针尖的曲率半径为6nm。
49.所述纳米位移平台2为压电陶瓷，位移范围为100μm
×
100μm
×
100μm，移动精度为2nm，能够实现精确定位。
50.所述拉曼光源为532nm激光器6的激发光源，最大的激光功率为50mw。
51.所述中的软件参数设定通过软件编程实现，设定原子力探针4进针精度为原子力探针粗进针以30-40nm的步长逐渐接近待测单个脂肪细胞15，待针尖4与脂肪细胞膜接触后，停止进针，使用接触扫描模式获得脂肪细胞15的形貌图。
52.所述中的软件参数设定通过软件编程实现，设定拉曼激光器6积分时间30s，激发功率100％，接收的数据波长范围设定为2700～3200cm-1
，从而获得脂肪细胞15内部脂质大分子的拉曼光谱图。
53.根据原子力显微成像系统5和拉曼反馈系统7，原子力探针4与单个脂肪细胞15之间以恒定力接触，使得原子力探针4与单个脂肪细胞膜表面的接触稳定，从而利用计算机10在纳米尺度上获取单个脂肪细胞15的外部形貌和内部脂质拉曼光谱。
54.实施例1:
55.如图2所示，为本发明拉曼原子力显微装置检测脂肪细胞原理图，原子力显微镜探针定位到待测脂肪细胞；通过软件控制压电陶瓷纳米位移平台，将目标细胞移动到探针下，开启原子力显微装置激光器使激光聚焦在探针的针尖上，此时四象限光电探测器将采集到的检测信息发送给计算机，通过软件编程最终将活脂肪细胞的平面图在软件中显示出来。如图3所示，为本发明在光学显微镜下的活脂肪细胞平面图。
56.如图4所示，为利用图1和图2所示的拉曼原子力显微装置得到的活脂肪细胞平面形貌图和3d形貌图。首先，将探针定位到待测脂肪细胞之上，手动进针，使得探针与细胞膜轻微接触，保持探针及压电陶瓷纳米位移平台不动，进行脂肪细胞的形貌检测。如图4中(a)所示，脂肪细胞由于内部脂滴的分布造成凹凸不平的表面，图4中的(b)为脂肪细胞的3d形
貌图，可以反映出该脂肪细胞的最高高度大概为5.19μm左右。
57.实施例2:
58.如图2所示，为本发明原子力显微镜和拉曼系统检测脂肪细胞原理图，拉曼系统位移平台控制模块使拉曼532nm激光器发出拉曼入射光打在原子力显微装置探针针尖和脂肪细胞上，此时拉曼光谱数据采集模块将采集到的拉曼数据反馈到计算机中，通过软件编程最终将活脂肪细胞的拉曼光谱图在软件中显示出来。
59.如图5所示，为利用图1和图2所示的拉曼原子力显微装置得到的脂肪细胞内部脂质生物大分子的拉曼光谱图。其中包括无脂肪细胞样品的对照组，由于脂质拉曼光谱特征峰在2900cm-1
附近，接收的数据波长范围选定定为2700～3200cm-1
，经过数据分析可以得到该脂肪样品的内部脂质拉曼光谱特征峰在2936cm-1
。
60.总之，本发明使用原子力显微镜和拉曼系统相结合实现了在单细胞水平上对活脂肪细胞进行内部和外部同时的检测目的，检测手段高效、无入侵性，检测结果准确、低干扰，检测内容丰富、多维，实现了对活脂肪细胞样品的外部形貌内部脂质拉曼光谱的生物信息检测，同时验证了本检测方法的有效性。
61.以上对本发明提供的一种检测活脂肪细胞的拉曼原子力显微装置及方法进行了详细介绍，提供以上实例仅仅是为了帮助理解本发明的方法，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定，不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。