微生物在调节体重和胆固醇水平中的用途的制作方法

微生物在调节体重和胆固醇水平中的用途
相关申请
1.本技术要求2020年3月30日提交的美国临时专利申请第63/001,682号的优先权，将所述美国临时专利申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。发明背景
2.随着全球生活水平的不断提高，患有糖尿病和心血管疾病的个体的数量也在迅速增加。例如，世界卫生组织(who)估计到2030年，全世界患有糖尿病的人数将超过3.5亿。由于糖尿病和心血管疾病的发病率上升、其对健康的严重影响及其深远的经济后果，迫切需要新的且有效的手段来治疗高风险个体以降低或消除其随后患有糖尿病和/或心血管疾病的风险，所述个体尤其是已经表现出未来有高的疾病发展可能性的早期迹象的那些个体，如肥胖、高于正常的血液胆固醇或甘油三酯水平，包括高于正常的低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)血液水平和/或低于正常的高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)血液水平。本发明通过提供能够有效调节患者体重和血液胆固醇水平的新方法和组合物来满足这种需求和其它相关需求。发明概述
3.本发明涉及用于优化粪便微生物群移植(fmt)治疗，也称为肠道微生物群移植(imt)，尤其是用于使赋予fmt受体的健康益处最大化的新方法和组合物。特别地，本技术的发明人发现，当某些微生物物种(例如，细菌物种)存在，尤其是以升高的水平存在于用于fmt受体的移植材料中，随后存在于接受fmt治疗之后的受体的胃肠道(gi，尤其是肠道)中时，可以在fmt受体中实现显著的健康益处，如体重减轻、较高的胰岛素敏感性、血液中较低的总胆固醇(tc)、较低的血液低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、较高的血液高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和较低的血液甘油三酯(tg)。这些发现允许本技术的发明人设计出在这些健康益处方面可以改善fmt功效的方法和组合物。因此，本发明提供了用于鉴定fmt的合适供体的新方法，该供体在适当处理之后提供了用于fmt的粪便材料。所述方法包括测定从fmt供体的候选者获得的粪便样品中表2、3、4、5或6示出的一种或多种细菌物种的水平的步骤。
4.在第一方面，本发明提供了用于鉴定fmt的合适供体的方法，其包括测定从候选者获得的粪便样品中表2-6示出的一种或多种细菌物种的水平的步骤。在一些实施方案中，一种或多种细菌物种的水平是相对丰度百分比。在一些实施方案中，当发现表2-6中的一种或多种细菌物种的水平大于它们相应的截止值时，候选者被鉴定为fmt的合适供体。在一些实施方案中，所述方法还包括从合适的候选者获得粪便材料以用于fmt的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括测定粪便样品中的总细菌载量的步骤。
5.在一些实施方案中，在从第一候选者获得的第一粪便样品以及从第二候选者获得的第二粪便样品中测定表2-6中示出的一种或多种细菌物种的水平。在一些实施方案中，第一候选者具有比第二候选者更高水平的表2-6中示出的一种或多种细菌物种中的每一种，并且被认为是比第二候选者更合适的fmt供体。在一些实施方案中，第一候选者具有比第二候选者高一半以上的表2-6中示出的一种或多种细菌物种的水平，并且被认为是比第二候选者更合适的fmt供体。
6.在一个实例中，当筛选供体作为合适的fmt供体的潜能时，尤其是为了帮助受体减轻体重的目的，在其粪便样品中存在的有益细菌如普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)和绒毛提氏菌(alistipes onderdonkii)应达到或超过以下相对量的阈值：例如，对于普通拟杆菌，至少约1％或含有至少约0.1％的绒毛提氏菌。另一方面，如果候选供体的粪便样品中具有不足量的有益细菌(例如，对于普通拟杆菌，小于约1％，并且对于绒毛提氏菌，小于约0.1％)，则应排除将其用作供体，尤其是当在所提议的fmt方法中体重减轻是一个目标时。
7.在第二方面，提供了用于改善fmt功效的方法，所述方法包括在fmt之前，将有效量的表2-6中示出的一种或多种细菌物种引入旨在用于移植的组合物中。在一些实施方案中，在引入步骤之后，表2-6中示出的一种或多种细菌物种中的每一种的水平大于所述组合物中总细菌的某一百分比(例如，大于对应于每种细菌物种的截止值)。在一些实施方案中，所述方法还包括使用所述组合物进行fmt的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括使用所述组合物进行fmt的步骤。
8.在第三方面，提供了试剂盒，其包含(1)含有供体粪便的第一组合物；以及(2)含有有效量的表2-6中示出的一种或多种细菌物种的第二组合物。在一些实施方案中，第一组合物包含已经被干燥、冷冻并且被放置在用于口服摄入的胶囊中的供体粪便。在一些实施方案中，第一组合物包含供体粪便，其已经被配制成用于经由食道胃十二指肠镜检查(ogd)、乙状结肠镜检查或灌肠直接递送的溶液、悬浮液、半液体或糊剂的形式。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含印刷的说明书以指导使用者正确使用所述试剂盒。
9.在一些实施方案中，在上述方法中，通过定量聚合酶链式反应(pcr)测定表2-6中示出的一种或多种细菌物种的水平。
10.另外，提供了用于治疗应用的各种方法：例如，提供了用于阻抑对象中的血液ldl-c水平的方法，其包括将有效量的表3和5中示出的一种或多种细菌物种引入对象的胃肠道的步骤。在一些情况下，通过fmt(也称为imt)来进行引入步骤。任选地，在进行如通过fmt/imt引入有益细菌物种的步骤之前，进行对个体施用有效量的广谱抗菌剂如抗生素的步骤。
11.此外，提供了用于阻抑对象中的血液总胆固醇的方法，其包括将有效量的表4中示出的一种或多种细菌物种引入对象的胃肠道的步骤。在一些情况下，通过诸如imt的fmt来进行引入步骤。任选地，在进行如通过fmt或imt引入有益细菌物种的步骤之前，进行对个体施用有效量的广谱抗菌剂如抗生素的步骤。
12.另外，提供了用于阻抑对象中的血液甘油三酯的方法，其包括将有效量的表6中示出的一种或多种细菌物种引入对象的胃肠道的步骤。任选地，在进行如通过fmt/imt引入有益细菌物种的步骤之前，进行对个体施用有效量的广谱抗菌剂如抗生素的步骤。
13.此外，提供了用于提高对象中的血液hdl-c水平的方法，其包括例如通过fmt/imt将有效量的细菌物种阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)引入对象的胃肠道的步骤。任选地，在进行如通过fmt/imt的引入步骤之前，进行对个体施用有效量的广谱抗菌剂如抗生素的步骤。
14.最后，提供了减轻对象体重的方法，其包括将有效量的表2中示出的一种或多种细菌物种引入对象的胃肠道的步骤。任选地，在进行如通过fmt/imt引入表2中示出的有益细菌物种的步骤之前，进行对个体施用有效量的广谱抗菌剂如抗生素的步骤。
15.为了在这些方法的任一种中使用，提供了包含有效量的表2-6中示出的任一种、两
种或更多种的有益细菌物种的组合物，例如，这样的组合物可以完全由所需量的这样的细菌人工构成；或者所述组合物可以来源于供体粪便材料，其或者天然含有足够量的细菌，或者已经用添加量的在别处培养的细菌物种强化。供体来源的材料通常在使用前进行加工，例如干燥，冷冻，并且被放置在用于口服摄入的胶囊中。附图简述
16.图1：在imt之前、期间和之后供体和每个受体中的普通拟杆菌和绒毛提氏菌的相对丰度。
‘
ob’表示肥胖受体；
‘
w’表示imt的第n周，其中第1-4周表示1个月的imt周期，第5-16周表示imt后的时间周期。
‘
d’表示在指定周内的第n天。
17.图2：在一个月的imt周期期间，每个imt受体的十二指肠和结肠中的绒毛提氏菌的相对丰度。
‘
ob’表示肥胖受体；
‘
w’表示imt的第n周，其中第1-4周表示1个月的imt周期。
‘
d’表示在指定周内的第n天。
18.图3：肠道微生物群移植(imt)的随机安慰剂对照研究的示意图。
19.图4：在第一次imt之后的不同时间点，ldl胆固醇水平与基线相比的平均差异。每条线代表一个随机化组。在第12周，在接受第4次imt之前测量ldl胆固醇水平。在第1周停止imt。
20.图5：在第一次imt之后的不同时间点，总胆固醇水平与基线相比的平均差异。每条线代表一个随机化组。在第12周，在接受第4次imt之前测量总胆固醇水平。在第12周停止imt。
21.图6：粪拟杆菌(bacteroides caccae)的相对丰度与血液ldl-c和tc呈负相关(分别为r＝-0.39,p《0.01以及r＝-0.47,p《0.001)。
22.图7：随机对照试验中粪拟杆菌的相对丰度。在整个试验中ldl-c≤1.8mmol/l的患者被表征为正常(绿色)；在整个试验中ldl-c》1.8mmol/l的患者被表征为高的(蓝色)；在基线处ldl-c》1.8mmol/l的患者以及在干预之后ldl-c≤1.8mmol/l的患者被表征为下降(红色)。与具有正常ldl-c的患者相比，在基线(w0)处具有高ldl-c的患者具有显著较低的粪拟杆菌丰度。在干预之后，在ldl-c水平恢复正常的患者中粪拟杆菌的相对丰度增加，而在ldl-c水平保持较高的患者中粪拟杆菌保持在低水平。定义
23.术语“粪便微生物群移植(fmt)”或“粪便移植”是指这样的一种医疗程序，在该程序期间从健康个体获得的含有活的粪便微生物(细菌、真菌、病毒等)的粪便物质被转移到受体的胃肠道中以恢复已被各种医学病况中的任一种破坏或摧毁的健康肠道微生物群落。通常，来自健康供体的粪便物质首先被加工成用于移植的适当形式，所述移植可以通过直接沉积到下胃肠道中(如通过结肠镜检查、或通过鼻插管)或通过口服摄入包含加工的(例如，干燥且冷冻的)粪便物质的胶囊化材料来实现。fmt的一种特定形式是肠道微生物群移植或imt，其中移植的组合物通常通过食道胃十二指肠镜检查(ogd)、乙状结肠镜检查或灌肠来递送。fmt用于治疗多种医学病况，包括肥胖、代谢综合征、胃肠病症(如炎性肠病(ibd)，包括溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd))、抗生素抗性细菌感染(如艰难梭菌(clostridium difficile)感染(cdi)或由耐多药有机体，包括碳青霉烯抗性肠杆菌(cre)或万古霉素抗性肠球菌(vre)引起的病况)以及孤独症，抑郁症，肥胖，糖尿病，脱发，急性移植物抗宿主病(agvhd)，并且还包括某些神经病况，如多发性硬化和帕金森病。
24.本文使用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对目标生物过程(如靶基因的rna/蛋白质表达、靶蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖、有机体，尤其是微生物的存在/水平等)的任何可检测的负效应。通常，抑制反映在当与对照相比时，目标过程(例如，对象的体重或者对象中的总胆固醇、lcl-c或甘油三酯的血液水平)或上述下游参数中的任一个降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。“抑制”还包括100％减少，即完全除去、阻止或消除目标生物过程或信号。在本公开内容中以类似的方式使用其它相关术语如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“减少(reducing)”和“减少(reduction)”以指代目标生物过程或信号降低到不同的水平(例如，与对照水平相比降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)直到完全消除。另一方面，诸如“活化(activate)”、“活化(activating)”、“活化(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“增强(enhance)”、“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”的术语在本公开内容中用于涵盖目标过程或信号的不同水平的正变化(例如，与对照水平，例如表2-6中示出的一种或多种细菌物种的对照水平或者对象血液中hdl-c的对照水平，相比增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高，如3倍、5倍、8倍、10倍、20倍)。
25.术语“抗菌剂”是指能够抑制、阻抑或防止细菌物种的生长或增殖的任何物质。具有抗菌活性的已知试剂包括通常阻抑广谱细菌物种增殖的各种抗生素以及可以抑制特定细菌物种增殖的试剂，如反义寡核苷酸、小的抑制性rna等。术语“抗菌剂”被类似地定义为涵盖具有杀死几乎所有细菌物种的广谱活性的试剂以及特异性阻抑目标细菌增殖的试剂。
[0026]“相对丰度百分比”当用于描述与存在于相同环境中的所有细菌物种相关的特定细菌物种(例如，表2-6中任一个所示的那些中的任一种)的存在的上下文中时，是指以百分比形式表示的细菌物种在所有细菌物种的量中的相对量。例如，一种特定细菌物种的相对丰度百分比可以通过将一个给定样品中对该物种具有特异性的dna的量(例如，通过定量聚合酶链式反应测定)与同一样品中所有细菌dna的量(例如，通过定量聚合酶链式反应(pcr)和基于16s rrna序列的测序测定)进行比较来测定。
[0027]“绝对丰度”当用于描述组合物(例如fmt供体粪便样品)中特定细菌物种(例如表2-6所示的那些中的任一种)的存在的上下文中时，是指来源于组合物中所有dna的量中的细菌物种的dna的量。例如，一种细菌的绝对丰度可以通过将一种给定样品中对该细菌物种具有特异性的dna的量(例如，通过定量pcr测定)与同一样品中所有粪便dna的量进行比较来测定。
[0028]
本文所用的组合物如粪便样品的“总细菌载量”是指组合物(如粪便样品)中所有dna的量中的所有细菌dna的量。例如，细菌的绝对丰度可以通过将一种给定样品中细菌特异性dna的量(例如，通过定量pcr测定的16s rrna)与同一样品中所有dna的量进行比较来测定。
[0029]
本文所用的术语“有效量”是指使用或施用物质(例如，表2-6中的一种或多种有益细菌物种)而产生所需效果(例如，对目标过程的抑制或阻抑效果，如对象体重的变化，总胆固醇、ldl-c或甘油三酯的水平)的物质的量。效果包括抑制或降低这些水平至任何可检测出的程度。确切的量将取决于物质(活性剂)的性质、使用/施用的方式和应用的目的，并且
将是本领域技术人员使用已知技术以及本文所述的那些技术可确定的。当将“有效量”的一种或多种有益细菌物种(例如，表2-6中示出的那些)人工引入旨在用于fmt的组合物中时，其意指所引入的相关细菌的量足以赋予fmt受体健康益处，如体重减轻、对胰岛素的敏感性提高、血液胆固醇/ldl-c/甘油三酯水平降低和/或hdl-c水平升高。
[0030]
本文所用的术语“约”表示指定值 /-10％的数值范围。例如，“约10”表示9至11(10 /-1)的数值范围。发明详述i.引言
[0031]
本发明提供了用于在进行程序之前评估有效fmt的可能性，以及用于提高fmt程序在赋予受体某些健康益处(如体重和胆固醇控制)的有效性的新方法。在他们的研究过程中，本技术的发明人发现受体的胃肠道和旨在用于fmt的组合物(如供体的粪便)中某些细菌物种的存在和相对丰度与fmt的结果直接相关。例如，发现表2-6中所示的细菌物种的存在，尤其是在升高的水平下，赋予fmt受体健康益处，如在受体中诱导体重减轻，降低血液胆固醇水平、ldl-c水平和/或甘油三酯水平，以及增加血液hldl-c水平。分析所提议的fmt供体粪便中这些相关细菌物种的水平可以确定该个体是否是适当的fmt供体或者两个或更多个候选供体中的哪个个体将作为fmt的最佳供体，以便优化治疗结果，尤其是上述健康益处。ii.fmt供体/受体选择和制备
[0032]
患有艰难梭菌感染(cdi)，尤其是复发性cdi的患者通常被认为是fmt治疗的受体。除了cdi之外，其它疾病和病况也适于fmt治疗，所述其它疾病和病况包括消化系统或神经系统的那些疾病和病况，如结肠炎、肠易激综合征(ibs)、克罗恩病、急性移植物抗宿主病(agvhd)、由耐多药细菌如cre或vre引起的感染、多发性硬化、帕金森病、糖尿病和肥胖。
[0033]
fmt中使用的粪便物质是从健康供体获得的，然后被加工成用于在即将到来的fmt程序中的预期递送手段的适当形式。直到最近，fmt供体的一般标准已经仅仅为供体是健康的个体，没有任何已知的疾病或病症，尤其是在消化道中的疾病或病症，尽管通常同一家庭的成员作为受体给予一些优先权。
[0034]
本技术的发明人在他们的研究中已经发现，在受体的胃肠道或供体粪便(其在加工之后用于移植中)中的一种或多种“有益”细菌物种(如表2-6中所示的那些)的升高的存在可以在患者的fmt治疗之后赋予显著的健康益处，如在受体中体重减轻、改善的胰岛素敏感性、降低的血液/血清/血浆胆固醇(尤其是ldl-c)或甘油三酯水平以及增加的血液/血清/血浆胆固醇hdl-c水平。
[0035]
这种启示使得对作为适当的fmt供体的个体的初始筛选以及作为成功和有益的fmt治疗的可能候选者的患者的初始筛选成为可能，尤其是在治疗肥胖或代谢综合征(包括胰岛素不敏感性和/或ii型糖尿病)的情况下：如果候选供体的粪便含有最小或升高水平的表2-6中所示的任何一种或多种细菌物种(例如，每种大于总细菌的约0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.0075％、0.0078％、0.008％、0.01％、0.012％、0.1％、0.115％、0.147％、0.2％、0.25％、0.255％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.021％、2.5％、2.8％、2.864％或3％的截止值)，则该候选者被认为是适合作为fmt供体，并且可以立即取回他的粪便进行处理以及随后用于fmt；另一方面，如果候选者的粪便样品
没有显示这些有益细菌物种或仅显示低水平的这些有益细菌物种(例如，每种不大于总细菌的约0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.0075％、0.0078％、0.008％、0.01％、0.012％、0.1％、0.115％、0.147％、0.2％、0.25％、0.255％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.021％、2.5％、2.8％、2.864％或3％的截止值)，则该候选者不被认为是直接适当的fmt供体，并且在潜在使用之前不应取出他的粪便材料用于fmt中而没有必要的修饰。在加工用于fmt之前改善供体粪便材料的一种可能手段是人工引入一种或多种有益的细菌物种(例如表2-6中的那些)，其可以已经经过人工培养，然后浓缩、分离、富集或纯化，以便增加用于fmt的粪便材料中这样的细菌物种的存在(例如每种物种大于总细菌的约0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.0075％、0.0078％、0.008％、0.01％、0.012％、0.1％、0.115％、0.147％、0.2％、0.25％、0.255％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.021％、2.5％、2.8％、2.864％或3％的截止值)。
[0036]
理想地，由供体粪便材料制备并且旨在用于fmt以治疗肥胖或代谢综合征或ii型糖尿病或者升高/不健康的高水平的胆固醇、ldl-c和甘油三酯的可取的fmt组合物具有高水平的一种或多种有益细菌物种(例如，表2-6中所示的那些)。因此，虽然可以对旨在用于fmt的组合物进行修饰以解决有益细菌水平不足，但一种可能的修饰是增加一种或多种有益细菌物种(例如表2-6中所示的那些)的水平，例如通过补充旨在用于fmt的转移材料或通过将足够量的这样的有益细菌物种直接引入受体的胃肠道中，任选地同时阻抑一种或多种有害细菌物种(例如表1b中所示的那些)的水平以使受体可以从fmt程序得到的潜在健康益处最大化。
[0037]
在文献中已经报道了用于测定样品中所有细菌物种水平的各种方法，例如，利用通常共有的16s rdna细菌序列中的序列相似性来对细菌多核苷酸序列进行扩增(例如，通过pcr)和测序。另一方面，任何给定细菌物种的水平可以通过其独特的基因组序列的扩增和测序来确定。丰度百分比通常用作表示给定环境中细菌物种的相对水平的参数。iii.使用有益微生物的治疗方法
[0038]
本技术的发明人的发现揭示了(1)在个体的粪便或胃肠道中或者在来源于用于fmt的供者粪便的转移材料中的某些“有益的”细菌物种与(2)存在/不存在通过fmt治疗赋予fmt受体的显著健康益处(如体重减轻、改善的胰岛素敏感性、降低的血液胆固醇/ldl-c/甘油三酯水平和增加的hdl-c水平)之间的直接相关性。该发现不仅允许设计初始筛选方法来鉴定适当的供体和受体以确保来自fmt程序的治疗功效和/或健康益处，而且还通过调节(增加或降低)供体粪便材料和在fmt治疗之前受体中本文表2-6中示出的一种或多种有益细菌物种的水平使得增强或优化fmt程序赋予的潜在健康益处的不同方法成为可能。
[0039]
如以上部分中所论述的，当所提议的fmt供体的粪便经测试且发现含有不足水平的一种或多种有益细菌物种，如表2-6中所示的那些时(例如，粪便样品中每种小于总细菌的约0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.0075％、0.0078％、0.008％、0.01％、0.012％、0.1％、0.115％、0.147％、0.2％、0.25％、0.255％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.021％、2.5％、2.8％、2.864％或3％的相应截止值)，所提议的供体被认为是用于旨在赋予健康益处，如降低的体重、对胰岛素的致敏反应、降低的血液胆固醇/ldl-c/甘油三酯水平和升高的hdl-c水平的fmt的不合适的供体，他可能作为有利于粪便样品表现出更有利的细菌分布的另一个个体的供体是不合格的，并且他的粪便材料由于缺乏赋予这
样的有益健康效果的前景而不应立即用于fmt，除非粪便材料被适当地改变。鉴于本技术的发明人的发现，在预期缺乏来自fmt治疗的健康益处可以容易改善的这些情况下，例如，可以将表2-6中所示的一种或多种细菌物种从外源引入供体粪便材料中，使得粪便材料中细菌物种的水平增加(例如，至少达到粪便材料中总细菌的约0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.0075％、0.0078％、0.008％、0.01％、0.012％、0.1％、0.115％、0.147％、0.2％、0.25％、0.255％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.021％、2.5％、2.8％、2.864％或3％的相应截止值)，然后将其加工用于fmt中以治疗肥胖、代谢综合征、ii型糖尿病或不健康的高水平的胆固醇/ldl-c/甘油三酯。具有类似预期目标的预处理方案可以用于准备不久将接受fmt治疗的患者，以便使其接受诸如上文和本文所述的那些健康益处的潜能最大化。
[0040]
在完成fmt程序后，立即可以通过每天连续测试粪便样品中的有益细菌物种的水平直到fmt后5天来进一步监测受体，同时还监测所治疗的病况的临床症状以及预期的健康益处(例如，体重、血液胆固醇、ldl-c、甘油三酯或hdl-c水平)，以便评估fmt结果和受体的胃肠道中相关细菌的相应水平：在治疗肥胖/患者体重控制的情况下，表2-6中示出的细菌物种的水平可以结合所获得的健康益处的观察来监测，所述健康益处如体重减轻、胰岛素敏感性改善、血液胆固醇/ldl-c/甘油三酯降低和提高血液hdl-c水平。iv.用于改进的fmt的试剂盒和组合物
[0041]
本发明还提供了新的试剂盒和组合物，其可以用于改善通过涉及fmt的各种治疗性和/或预防性治疗方案递送的治疗功效和健康益处。例如，在用于治疗需要fmt的患者(例如，用于肥胖/体重控制、降低血液胆固醇/ldl-c/甘油三酯水平、提高血液hdl-c水平)的试剂盒中，第一组合物旨在移植到患者或fmt受体中，第二组合物用于提高一种或多种有益细菌物种(如表2-6中所示的那些)的水平，该组合物可以倾向于加入到第一组合物中或者可以将其预期施用至受体，例如直接沉积在胃肠道中，如通过食道胃十二指肠镜检查(ogd)、乙状结肠镜检查或灌肠递送在肠道中。第一组合物包含来自供体的粪便材料，其可以直接沉积在受体的下胃肠道中(例如，湿或半湿形式)或通过口服摄入(例如，冷冻干燥封装的)，所述粪便材料已经按照fmt程序中的递送手段进行加工、配制和包装成适当的形式。在一些情况下，第二组合物可以包含足够或有效量的一种或多种有益细菌物种(如表2-6中所示的那些)，使得可以在fmt之前将其加入到第一组合物中，目的是优化实现治疗功效和/或赋予受体健康益处的前景。将组合物配制用于预期的递送方法，例如通过口服摄入或通过局部沉积(例如栓剂)。第一组合物和第二组合物通常分别保存在试剂盒的两个不同容器中。在一些情况下，除了用于增加有益细菌物种的组合物之外，还有包含广谱抗菌剂的另外的组合物，并且它们作为试剂盒的第二组分和第三组分提供在单独的容器中。通常，试剂盒还将包含为试剂盒的使用者提供详细说明的印刷材料，如提供用于向受体施用第一组合物和第二组合物(和任选地第三组合物)的时间表和给药安排的信息。
[0042]
在本发明的另一个方面，可以设计可用于具有改善功效的fmt的替代性组合物以含有至少这两种组分：(1)含有活的粪便微生物的供体粪便材料，以及(2)通常阻抑几乎所有细菌物种的生长或增殖的抗菌剂。这样的广谱抗菌剂可以用于阻抑准备fmt治疗的fmt之前的患者的胃肠道中的所有细菌物种，从而优化表2-6中示出的一种或多种细菌物种的有益健康效果。
实施例
[0043]
以下实施例仅通过示例方式而非通过限制性方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或类似的结果。引言
[0044]
本发明的目的是确定人的肠道真菌组(fungome)和病毒组如何与高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)相关，并且如何可能影响与低hdl-c相关的疾病。hdl-c是有利的胆固醇，并且较高水平与心血管疾病的较低风险相关。本发明的实际应用包括通过调节人的肠道真菌组和病毒组来改善人的健康和与低hdl-c相关的相对疾病风险，如肥胖、心血管疾病、高血压和糖尿病。这些措施可以包括具有优化方案的粪便微生物群移植(fmt)、合成真菌和/或病毒物种补充、清除微生物以减少或治疗低hdl-c相关疾病的对策。这将促进微生物产品的开发，以及增加建立粪便库及其衍生产品在诊断和治疗中的一套标准。实施例1肥胖患者中imt的开放标签临床试验方法研究设计
[0045]
在肥胖对象中进行肠道微生物群移植的开放标签临床试验(nct03789461)。招募年龄为18-75岁，体重指数(bmi)≥28kg/m2且《45kg/m2以及获得知情同意的对象。在研究期间，对象接受强化的imt，持续总计20天。在治疗期间的每周，对象接受5天的imt(进行5天和停止2天)。在同一时期，对象还接受饮食和生活方式建议。在imt之后，在第6周、第8周、第12周、第16周对对象进行随访。收集对象的粪便样品。另外，在imt期间从对象获取十二指肠和结肠活检。肠道微生物群移植(imt)
[0046]
在接受imt之前，对象接受5天的由每天3次的万古霉素500mg，每天3次的甲硝哒唑500mg和每天3次的阿莫西林500mg组成的抗生素，以增强来自imt的微生物群的植入。然后，对象接受20天的imt。将100-200ml的imt溶液在住院病人或门诊病人背景中经由标准程序(包括食道胃十二指肠镜检查(ogd)、乙状结肠镜检查或灌肠)输注至患者。1.经由ogd：在2-3分钟内经由ogd将100-200ml的imt溶液输注至远端十二指肠或空肠中。在输注之后，在排出之前监测对象1小时。2.经由乙状结肠镜检查：在2-3分钟内经由乙状结肠镜检查将100-200ml的imt溶液输注至远端结肠中。在输注之后，在排出之前监测对象1小时。3.经由灌肠：将100-150ml的imt溶液经由灌肠自施用或在研究团队的帮助下经由灌肠施用。指示对象保留灌肠剂20-30分钟。在每次灌肠之前给予4mg洛哌丁胺以增强imt溶液的保留。香港中文大学的粪便库的粪便供体
[0047]
供体(bmi《23kg/m2)是来自一般人群的志愿者，包括配偶或合作伙伴、一级亲属、其它亲属、朋友和潜在对象已知或未知的其它人。邀请符合合格标准的潜在供体进行筛选实验室测试。进行了感染性疾病的一系列实验室测试和访谈。在本研究中使用来自合格供体的粪便。在本研究中，所有对象接受来自单个供体的粪便。饮食和生活方式建议
[0048]
在每次治疗访问中由研究营养师和受过培训的研究人员联系对象。根据对象的饮
食习惯、身体活动模式和其它生活方式习惯来指导对象。在最初的评估和随访中收集饮食历史。对于前4周，对象完成24小时的饮食回忆；此后，每隔一周记录3天的饮食，直到26周。这些是面对面进行的或通过电话进行的。每隔一周直到第26周以及对于剩余的研究期每26周进行电话随访。对象还接受膳食补充剂如metamucil(车前子壳(psyllium husk))。人口统计学和病史
[0049]
通过查阅对象病历以及由医生和研究人员与对象进行面谈，获得了诸如性别、年龄、吸烟和饮酒状况、疾病发作、共病疾病、药物史、临床测试结果的人口统计学和病史。肥胖测量
[0050]
测量体重、身高、bmi、腰臀围、腰臀比、血压和心率。常规血液测试
[0051]
收集血液样品用于全血细胞计数(cbc)、肾功能检验(rft)、肝功能检验(lft)、c反应蛋白(crp)和镁。测量葡萄糖、胰岛素(仅在基线和第4周)、总胆固醇、低密度脂蛋白(ldl)胆固醇、高密度脂蛋白(hdl)胆固醇、甘油三酯和血红蛋白a1c(hba1c)的空腹血清浓度。对于基线，在第一次imt之前的7天内收集血液样品。临床实验室测试
[0052]
在imt之前和在第4周、第12周、第16周、第20周和第24周收集空腹血液样品，测试全血细胞计数(cbc)、肾功能检验(rft)、肝功能检验(lft),c反应蛋白(crp)、镁、葡萄糖、胰岛素(仅在imt之前和第24周)、总胆固醇、低密度脂蛋白(ldl)胆固醇、高密度脂蛋白(hdl)胆固醇、甘油三酯和血红蛋白a1c(hba1c)。统计方法
[0053]
使用spss进行统计分析。重复测量anova用于确定三个治疗组内基线、第12周、第16周、第20周和第24周随访之间的差异。计算基线和每个时间点之间的差值。使用bonferroni检验进行事后分析。p值《0.05被认为是显著的。dna提取
[0054]
通过使用rsc purefood gmo and authentication kit(promega)提取粪便和粘膜dna。将大约100mg粪便样品或粘膜活检物悬浮于补充有1.6μl 2-巯基乙醇和500u裂解酶(sigma)的800μl te缓冲液(ph 7.5)中，并在37℃孵育60分钟。然后将样品以13,000
×
g离心2分钟，并弃去上清液。在该预处理之后，随后使用rsc purefood gmo and authentication kit(promega)根据制造商的说明从沉淀中提取dna。简而言之，将1ml ctab缓冲液加入到沉淀中并涡旋30s，然后将溶液在95℃加热5分钟。之后，用珠子(biospec，对于真菌，0.5mm；以及对于细菌，0.1mm，1:1)以最大速度充分涡旋样品15分钟。然后，加入40μl蛋白酶k和20μl rna酶a，并将混合物在70℃孵育10分钟。然后通过以13,000
×
g离心5分钟获得上清液，并将其置于用于dna提取的rsc仪器中。经由ilumina novoseq 6000(novogen,beijing,china)将提取的粪便dna用于超深度的宏基因组测序。质量过滤宏基因组序列数据
[0055]
如下使用trimmomatic v0.361过滤和质量修整原始序列读数：1)修整低质量碱基(质量得分《20)；2)去除短于50bp的读数；3)去除长度小于50bp的序列；4)跟踪和切掉测序
适配子。使用具有默认参数的kneaddata(参考数据库：grch38 p12)过滤污染的人类读数。从宏基因组数据集中对细菌微生物组进行分布分析
[0056]
通过将读数映射到分支特异性标志物2经由metaphlan2进行细菌微生物组(细菌组(bacteriome))的分布分析，下载通过bowtie2的物种泛基因组的注释，并将其用作参照，以使用bowtie23对齐干净的序列读数。通过斯皮尔曼相关性估计(spearsman’s correlation estimation)分析imt后患者体重减轻与细菌微生物组组成之间的相关性。16s rrna测序和质量控制
[0057]
将提取的粘膜dna样品在illumina hiseq 2500平台(v3-v4区，2
×
250bp)上测序。如前所述，质量控制和数据分析在mothur(v1.38.0)中实施。去除具有模糊碱基和长于275bp的任何序列，并使用nast算法与非冗余greengenes数据库(v 13.8)比对。丢弃未能与v3-4区对齐的任何序列。将剩余的序列修整到与它们完全重叠的相同对齐坐标，然后去除均聚物并通过uchime检测嵌合体的存在。16s rrna测序数据分析
[0058]
将所得序列针对greengenes数据库进行分类，并用最深水平的分类群进行注释，所述最深水平的分类群由在朴素贝叶斯分类器(naive bayesian classifier)的1,000次迭代中平均至少80％的伪自举置信度评分(pseudo-bootstrap confidence score)表示。去除被分类为源自古菌、真核生物、叶绿体、线粒体或未知界的任何序列。根据与至少80％的序列达成一致的共有分类，将注释的序列分配到系统型(phylotype)。结果体重减轻
[0059]
招募9名对象。所有9名对象在imt之后均显示出体重减轻(表1)。在imt后的随访期间，对象imt5、imt6和imt7在所有imt受体中均显示出最显著的体重减轻。imt1在imt之后显示出适度和可持续的体重减轻。imt后的体重减轻与粪便细菌分布之间的相关性分析将普通拟杆菌和绒毛提氏菌鉴定为与体重减轻相关的主要物种(图1)。它们与体重减轻的相应相关系数是-25.89和-96.34。因此，相对于其它受体，普通拟杆菌在imt5、imt6和imt7(其具有最显著的体重减轻)的imt后的粪便中显示出较高的存在(图1)。相对于其它受体，绒毛提氏菌在imt1和imt5的imt后的粪便中显示出较高的存在(图1)。另外，相对于其它受体，绒毛提氏菌在imt6和imt7的粘膜(十二指肠和结肠两者)处显示出较高的存在(图2)。这些数据表明，普通拟杆菌(ncbi分类单元id 821)和绒毛提氏菌(ncbi分类单元id328813)在减少肥胖中起重要作用。表1在接受肠道微生物群移植(imt)之后肥胖对象的体重变化
表2用于减轻体重的细菌物种细菌物种ncbi分类单元id截止值(相对丰度)普通拟杆菌8211％绒毛提氏菌3288130.1％降低低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平
[0060]
最佳总胆固醇水平是约150mg/dl(3.8mmol/l)，对应于约100mg/dl(2.6mmol/l)的ldl-c水平4。在基线处具有3.6mmol/l的升高水平的ldl-c的两名对象(imt003和imt007)在接受20天的imt之后显示出ldl-c的显著降低。imt003是一名42岁女性。与基线相比，imt003的ldl-c水平在第3周和第6周均降低8.33％，在第16周降低11.11％。imt007是一名34岁的女性，与基线相比，她的ldl-c水平在第3周和第6周分别显示出5.56％和19.44％的降低。实施例2健康中国人的横断面研究(cross-sectional study)方法群组描述和研究对象
[0061]
招募总计942名健康的中国人。本研究由合办的香港中文大学-新界东方集群临床研究伦理委员会(joint chinese university of hong kong,new territories,east cluster clinical research ethics committee)(合办的cuhk-ntec crec,crec ref.no:2016.407)，以及昆明医学院第一附属医院的制度审查委员会(irb)和研究伦理委员会(ref.no:2017.l.14)批准。所有对象同意捐献粪便样品以及血液样品和同意问卷调查，其中获得书面知情同意。将来自研究对象的粪便样品储存在-80℃用于下游微生物分析。粪便dna提取和dna测序
[0062]
通过使用rsc purefood gmo and authentication kit(promega)提取粪便dna。将大约100mg的每个粪便样品用1ml ddh2o预洗涤，并通过在13,000
×
g离心1分钟进行沉淀。将沉淀重悬于补充有1.6μl 2-巯基乙醇和500u裂解酶(sigma)的800μl te缓冲液(ph 7.5)中，并在37℃孵育60分钟，这增加真菌细胞的裂解功效。然后将样品以13,000
×
g离心2分钟，并弃去上清液。在该预处理之后，随后使用rsc purefood gmo and authentication kit(promega)根据制造商的说明从沉淀中提取dna。简而言之，将1ml ctab缓冲液加入到沉淀中并涡旋30s，然后将溶液在95℃加热5分钟。之后，用珠子(biospec，对于真菌，0.5mm；以及对于细菌，0.1mm，1:1)以最大速度充分涡旋样品15分钟。
然后，加入40μl蛋白酶k和20μl rna酶a，并将混合物在70℃孵育10分钟。然后通过以13,000
×
g离心5分钟获得上清液，并将其置于用于dna提取的rsc仪器中。经由ilumina novoseq 6000(novogen,beijing,china)将提取的粪便dna用于超深度的宏基因组测序。获得每个样品的平均52
±
6.3百万个读数(12g干净数据)。原始序列的质量修整
[0063]
如下使用trimmomatic v0.361过滤和质量修整原始序列读数：1)修整低质量碱基(质量得分《20)；2)去除短于50bp的读数；3)去除长度小于50bp的序列；3)跟踪和切掉测序适配子。使用具有默认参数的kneaddata(参考数据库：grch38 p12)过滤污染的人类读数。微生物组的分布分析
[0064]
通过将读数映射到分支特异性标志物2以及通过bowtie2的物种泛基因组的注释3，经由metaphlan2进行细菌微生物组(细菌组)的分布分析。所得细菌物种丰度表用于与血液参数相关。皮尔森相关性和斯皮尔曼相关性以及p值使用r中的cor和cor.test函数计算，并使用ggplot2可视化。结果肠道细菌与人类血液参数相关
[0065]
研究了人类肠道细菌的组成，并将细菌物种的丰度与所有健康对象的血液参数相关联。在所有探测的血液参数中，脂质代谢相关参数，如甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇(hdl)、低密度脂蛋白-胆固醇(ldl-c)和葡萄糖是特别感兴趣的，因为它们的水平与代谢疾病的风险密切相关。
[0066]
发现物种产液阿德勒克罗伊茨菌(adlercreutzia equolifaciens)、产气柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、食窦魏斯氏菌(weissella cibaria)、融合魏斯氏菌(weissella confusa)、格氏乳球菌(lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、穗状丁酸弧菌(butyrivibrio crossotus)、人罗斯拜瑞氏菌(roseburia hominis)和伶俐瘤胃球菌(ruminococcus callidus)与脂质代谢参数(总胆固醇、甘油三酯、ldl-c)呈负相关，表明这些物种是保护宿主免受代谢疾病和心血管疾病的推定有益微生物。另外，物种阴沟肠杆菌显示出与总胆固醇、ldl-c和甘油三酯呈负相关，以及与hdl-c呈正相关(表3)，表明该物种也是一种保护免受代谢疾病和心血管疾病的有用微生物。表3用于降低低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的细菌物种细菌物种ncbi分类单元id截止值(相对丰度)产液阿德勒克罗伊茨菌4466600.147％产气柯林斯菌744262.864％食窦魏斯氏菌1375910.01％融合魏斯氏菌15830.01％格氏乳球菌13630.01％乳酸乳球菌13580.01％穗状丁酸弧菌458510.01％人罗斯拜瑞氏菌3013010.078％伶俐瘤胃球菌405190.01％阴沟肠杆菌5500.01％
实施例3：患有肥胖和糖尿病的对象中肠道微生物群移植的随机安慰剂对照试验方法研究设计
[0067]
在患有2型糖尿病(nct03127696)的肥胖对象中进行肠道微生物群移植(imt)的随机安慰剂对照研究。招募符合威尔斯亲王医院(prince of wales hospital)合格标准的同意对象。纳入标准包括年龄是18-70岁，bmi≥28kg/m2且《45kg/m2；以及诊断为2型糖尿病≥3个月。排除标准包括当前妊娠，在前1年中使用任何体重减轻药物，已知病史或伴随的显著胃肠病症(包括炎性肠病、当前结肠直肠癌、当前gi感染)，已知病史或伴随的显著食物过敏，免疫抑制对象，已知的严重器官衰竭(包括失代偿期肝硬化)病史，炎性肠病，肾衰竭，癫痫，获得性免疫缺陷综合征，当前的活动性脓毒病，近2年的活动性恶性疾病，食道胃十二指肠镜检查(ogd)的已知禁忌症，近3个月使用益生菌或抗生素，随机化的服用钠-葡萄糖共转运蛋白-2抑制剂或胰高血糖素样肽-1受体激动剂，或随机化的服用质子-泵抑制剂。将对象以1:1:1的比例随机分成3个组(组1：imt和生活方式改变计划，组2：单独的imt，组3：对照剂(sham)和生活方式改变计划)(图2)。禁止用药
[0068]
在研究期间不允许使用抗生素、益生菌或益生元制剂、钠-葡萄糖共转运蛋白-2(sglt2)抑制剂、胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂或质子泵抑制剂(ppi)。肠道微生物群移植(imt)/对照剂输注
[0069]
在第0周、第4周、第8周和第12周，对象接受4次imt/对照剂输注并随访直到第24周。每次，在2-3分钟内，将100-200ml imt/对照剂溶液经由ogd输注到远端十二指肠或空肠中。如下制备imt和对照剂溶液。
[0070]
imt：使用来自粪便库供体的冷冻粪便。对于每次imt，使用来自单个供体的粪便或混合来自多个供体的粪便输注imt溶液。通过用无菌盐水(0.9％)稀释粪便来制备imt溶液。将该溶液混合并用过滤器过滤。然后将所得上清液储存为冷冻的imt溶液以供以后使用。
[0071]
对照剂：将无菌盐水(0.9％)用作对照剂。香港中文大学的粪便库的粪便供体
[0072]
供体(bmi《23kg/m2)是来自一般人群的志愿者，包括配偶或合作伙伴、一级亲属、其它亲属、朋友和潜在对象已知或未知的其它人。邀请符合合格标准的潜在供体进行筛选实验室测试。进行了感染性疾病的一系列实验室测试和访谈。在本研究中使用来自合格供体的粪便。对象可以接受来自单个或多个供体的粪便，所述供体的身份对于对象是不可获得的。结果
[0073]
招募61名对象并将其随机分配到imt和生活方式改变计划(lsm,n＝21)，单独的imt(n＝20)以及对照剂和生活方式改变计划(lsm,n＝20)。四名对象退出本研究。结果显示在三个治疗组之间治疗之后三个月ldl胆固醇水平的显著差异(p＝0.001，重复测量anova)。事后分析显示，imt和生活方式改变计划的组中的ldl胆固醇水平显著低于单独的imt(p＝0.003)以及对照剂和生活方式改变计划(p＝0.003)的ldl胆固醇水平。在第12周(3次imt之后)观察到imt和生活方式改变计划的组中ldl胆固醇水平降低，并且甚至在停止imt之后保持在基线以下的水平。观察到这样的效果直到在第24周最后一次随访(图4)。
[0074]
三个治疗组之间总胆固醇水平也有显著差异(p＝0.021，重复测量anova)。事后分析显示，当与单独的imt的组相比时，接受imt和生活方式改变计划的组中总胆固醇显著降低(p＝0.029)。与ldl胆固醇水平类似，自第12周开始，观察到imt和生活方式改变计划的组中的总胆固醇水平降低。尽管在第16周和第20周，imt和生活方式改变计划的组中的总胆固醇增加，但总体趋势仍低于基线(图5)。在随机化组之间hdl胆固醇和甘油三酯没有显著差异。
[0075]
在imt和生活方式改变的组中，ldl胆固醇水平在第12周、第16周、第20周和第24周分别降低了14.4％、8.7％、5.9％和10.1％。在单独的imt的组(没有生活方式改变)中，接受的3名对象(fdm017、fdm026和fdm060)显示出ldl-c降低。与基线相比，fdm017(59岁的男性)在第24周显示出ldl胆固醇水平降低28％。fdm026(36岁男性)在第24周显示出ldl-c降低18％。fdm060(45岁女性)在第24周显示出ldl胆固醇降低13％。
[0076]
发现物种微核巨球形菌(megasphaera micronuciformis)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia)与ldl呈负相关，粘膜乳杆菌(lactobacillus mucosae)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)与tc呈负相关，而粪拟杆菌(在西方个体的微生物组中常见的纤维降解共生体)与tc和ldl呈负相关，表明这些物种是保护宿主免受代谢疾病和心血管疾病的推定的有用微生物(表4和5)。
[0077]
另外，物种粪拟杆菌显示出与总胆固醇、ldl-c和甘油三酯呈负相关以及与hdl-c呈正相关(图6)，表明该物种也是一种保护免受代谢疾病和心血管疾病的有用微生物。
[0078]
对于2型糖尿病患者，建议将血液ldl-c水平保持在1.8mmol/l以下。与具有高ldl-c(》1.8mmol/l)的患者相比，在具有正常ldl-c(《＝1.8mmol/l)的患者中，粪拟杆菌的相对丰度显著更高(图7)。在干预之后，在ldl-c水平恢复正常的患者中，粪拟杆菌的相对丰度增加，而在ldl-c水平保持较高的患者中，粪拟杆菌的相对丰度保持在低水平(图7)。
[0079]
在干预后的样品中，副血链球菌(streptococcus parasanguinis)与tc呈负相关，梭状芽孢杆菌细菌(clostridiales bacterium)1_7_47faa与tc和ldl呈负相关，毛螺菌科杆菌(lachnospiraceae bacterium)_3_1_57faa_ct1、假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)、鼠李糖乳杆菌、卵瘤胃球菌(ruminococcus obeum)、内脏臭气杆菌(odoribacter splanchnicus)、氢营养布劳特氏菌(blautia hydrogenotrophica)、埃氏拟杆菌(bacteroides eggerthii)、大肠厌氧杆菌(anaerotruncus colihominis)与tg呈负相关(表4-6)。表4用于降低总胆固醇(tc)的细菌物种细菌物种ncbi分类单元id截止值(相对丰度)粘膜乳杆菌974780.01％鼠李糖乳杆菌477150.01％粪拟杆菌476780.012％副血链球菌13180.115％梭状芽孢杆菌细菌1_7_47faa4574210.01％表5用于降低低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的细菌物种细菌物种ncbi分类单元id截止值(相对丰度)微核巨球形菌1873260.01％
肺炎克雷伯菌5730.008％粪拟杆菌476780.012％梭状芽孢杆菌细菌1_7_47faa4574210.01％表6用于降低甘油三酯(tg)的细菌物种细菌物种ncbi分类单元id截止值(相对丰度)粪拟杆菌476780.012％毛螺菌科杆菌_3_1_57faa_ct180260.01％假小链双歧杆菌477150.255％鼠李糖乳杆菌405200.01％卵瘤胃球菌281182.021％内脏臭气杆菌534430.01％氢营养布劳特氏菌281110.01％埃氏拟杆菌1694350.01％大肠厌氧杆菌80260.004％
[0080]
本技术中引用的所有专利、专利申请和其它出版物(包括genbank登录号或等同物)出于所有目的通过引用整体并入。参考文献1.bolger am,lohse m,usadel b.trimmomatic:a flexible trimmer for illumina sequence data.bioinformatics 2014；30:2114-2120.2.segata n,izard j,waldron l,et al.metagenomic biomarker discovery and explanation.genome biology 2011；12:r60.3.langmead b,salzberg sl.fast gapped-read alignment with bowtie 2.nature methods 2012；9:357.4.grundy sm,stone nj,bailey al,et al.2018aha/acc/aacvpr/aapa/abc/acpm/ada/ags/apha/aspc/nla/pcna guideline on the management of blood cholesterol:executive summary:a report of the american college of cardiology/american heart association task force on clinical practice guidelines.circulation 2019；139:e1046-e1081.5.magnusdottir s,heinken a,kutt l,et al.generation of genome-scale metabolic reconstructions for 773members of the human gut microbiota.nat biotechnol 2017；35:81-89.