利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法

利用金纳米花增强信号的双酚s竞争elisa试剂盒与方法
技术领域
1.本发明属于环境检测领域，具体涉及一种利用金纳米花增强信号的双酚s竞争elisa试剂盒与方法。


背景技术：

2.双酚s (bisphenol s, bps)是一种双酚a(bisphenol a, bpa)的替代品，因为与bpa相比具有更高的热稳定性和光稳定性，被广泛用于生产聚碳酸酯塑料和树脂。但是随着bps在“bpa-free”产品中的使用越来越多，其进入环境的潜力也越来越大，导致bps在各种环境基质和生物样品中时有检出。如太湖水体中bps的浓度均值为16 ng/l；中国成人尿液样本(n=160)中bps的检出浓度为0.24
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g/l。研究表明bps具有激素活性会干扰生物体正常的内分泌功能。如环境浓度的bps暴露会对斑马鱼发育和生殖产生毒性效应。另外，母体在低浓度的bps暴露下会导致子代神经和内分泌系统受损。鉴于bps在环境中具有较高的浓度和毒性效应，因此亟需建立bps的检测方法。
3.目前bps的检测方法以高效液相色谱和气相色谱-质谱法为主，上述方法虽然具有较高的精度和准确性，但是其复杂的样品前处理过程和昂贵的设备等问题使上述方法难以普及，限制了bps的检测工作。免疫学检测方法是利用抗体对抗原的识别作用对bps进行检测，其中酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, elisa)因为具有快速，灵敏，对设备要求低，成本小等特点，是应用最广泛的免疫学检测方法。虽然已有关于bps竞争elisa，但是主要用于食品中bps的检测工作，且灵敏度有限。而环境样本中，bps含量较低，检测难度较大，因此需要具有更高灵敏度的bps检测方法。选择合适的信号放大策略和制备具有高亲和力的抗体是提高elisa灵敏度的关键。其中金纳米花因为具有金纳米材料相同的生物可利用性、稳定性和纳米酶活性，同时其花状结构能有效增加比表面积，是一种性能优越的信号放大元件。因此本发明通过制备了bps高亲和力和高特异性的单克隆抗体，并将该抗体依次与金纳米花和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, hrp)偶联进一步放大检测信号，建立了bps的竞争elisa。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种利用金纳米花增强信号的双酚s竞争elisa试剂盒与方法，利用金纳米花作为信号放大原件，从而建立一种检测bps的竞争elisa试剂盒，以弥补现有竞争elisa检测灵敏度不高的缺点。
5.一种利用金纳米花增强信号的双酚s竞争elisa试剂盒，其特征在于该试剂盒包含bps完全抗原、金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体；所述bps完全抗原使用5-溴戊酸甲酯作为连接臂；所述bps完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或明胶。
6.所述金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体中的bps单克隆抗体，由所述bps完全抗原制得。
7.所述的试剂盒中，所述bps完全抗原通过以下方法制得：首先称取0.25 g bps加入50 ml乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5-溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后将得到的固体过柱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，即获得bps的半抗原；称取10 mg bps半抗原、8.9 mg碳酰二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, edc)、6.2 mg n-羟基琥珀酰亚胺(1-hydroxy-5-pyrrolidinedione, nhs)溶于4 ml n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide, dmf)中，室温下避光反应2 h；将上述溶液逐滴加入到2 ml 含有20 mg卵清蛋白(ovalbumin, ova)或者15 mg 牛血清白蛋白(bovine albumin, bsa)的磷酸缓冲液中，4 ℃反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 m pbs中透析32 h，每8 h更换一次透析液；所得溶液再次离心获得上清液即为bps-完全抗原，其中加入卵清蛋白时产物记为bps-bsa，作为免疫抗原；加入牛血清白蛋白时产物记为bps-ova作为包被抗原。
8.所述的试剂盒中，所述bps单克隆抗体，是通过以下步骤实现金纳米花和hrp对bps单克隆抗体的联合标记：首先采用高碘酸钠法将hrp标记于bps单克隆抗体上，具体方法为将1 ml 5 mg/l hrp溶液与0.2 ml 0.1 m naio4溶液充分混合后，室温下震荡20 min；随后放入1 mm 醋酸缓冲液(ph 4.4)中4
°
c透析过夜；液体取出后加入0.5 ml 0.16 m乙二醇溶液，室温摇晃30 min；加入1 mg bps单克隆抗体混匀，低温摇晃30 min后，放入0.05 m碳酸盐缓冲液(ph 9.5)中透析过夜；液体取出后加入0.1 ml 5 mg/ml nabh4溶液于4
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c条件下摇晃2 h；随后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀后于4
°
c摇晃30 min，3000 rpm离心30 min，去除上清液，将沉淀物溶于0.15 m ph=7.4的pbs中并装入透析袋于pbs中4
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c透析除盐；液体取出后3000 rpm离心30 min，去除沉淀物，收集上清液即为hrp标记的bps单克隆抗体；随后取8 μg hrp标记的bps单克隆抗体加入1 ml金纳米花溶液中，摇晃1 h后，12000 r/min离心10 min，之后使用0.02 m tris-hcl溶液复溶沉淀，获得金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体。
9.利用上述试剂盒的bps间接竞争elisa检测方法，其特征在于包括下列步骤：步骤1、将根据权利要求1所述试剂盒中的bps完全抗原用包被液包被于酶标板；步骤2、用封闭液将酶标板封闭；步骤3、将酶标的金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体与待测样本混合加入酶标板中，使得步骤1中包被的bps完全抗原与待测样本混合，当样本中存在bps时，样本中的bps竞争性地结合bps单克隆抗体。
10.发明优点目前，通常采用高效液相色谱法和气相色谱法对bps进行检测，但是这些方法通常需要较昂贵的设备和复杂的样品前处理过程。常规的elisa方法与化学方法相比虽然具有操作简单，设备要求低，检测速度快的优点，但是其灵敏度较低。目前主要是通过增加信号放大策略和制备具有更高亲和力的抗体来提高检测方法的灵敏度。因此本发明使用5-溴戊酸甲酯为连接产物制备了bps半抗原，由于5-溴戊酸甲酯具有更长的碳链，可以使抗原决定簇暴露的更充分，从而制备具有更高亲和力和特异性的bps单克隆抗体。然后，使用金纳米花进一步的放大信号，使更多的hrp标记后的抗体结合其上，在增加结合抗体浓度的同时，金纳米花本身具有纳米酶活性，能增加检测elisa信号，提高本发明建立的竞争elisa的灵
敏度。利用金纳米花和hrp双重信号增强试剂盒，为bps的检测工作提供一种快捷和灵敏的检测方法。
11.附图说明：图1为bps半抗原合成图。
12.图2为bps完全抗原合成图，其中图2a为bps免疫抗原合成图，图2b为bps包被抗原合成图。
13.图3为bps完全抗原红外光谱鉴定结果图。
14.图4为bps完全抗原聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
15.图5为bps竞争elisa试剂盒标准曲线。
16.具体实施方式：利用金纳米花增强信号的双酚s竞争elisa试剂盒，包括一个盒体和盒体内常规的酶标抗体、包被液、洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液，其特征在于还包括bps完全抗原、金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体。
17.下面通过具体实施和附图对本发明作进一步的阐述。
18.实施例1、bps半抗原和单克隆抗体的制备(1) bps半抗原的合成首先，按照图1所示制备bps半抗原，称取0.25 g bps加入50 ml乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5-溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后，将得到的固体过柱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，即可获得bps的半抗原。
19.(2) 完全抗原的合成按照图2所示制备bps完全抗原，称取10 mg bps半抗原、8.9 mg edc、6.2 mg nhs溶于4 ml dmf中，室温下避光反应2 h。将上述溶液逐滴加入到2 ml 含有20 mg ova或者15 mg bsa的磷酸缓冲液中，4
°
c反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 m pbs中透析32 h，每8 h更换一次透析液。所得溶液再次离心获得上清液即为完全抗原(bps-ova/bps-bsa)。其中bps-bsa为免疫抗原，bps-ova为包被抗原。将制备的完全抗原进行红外光谱扫描，结果如图3所示，与bsa、ova偶联后的完全抗原红外吸收峰出现了明显的特征峰，图4的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果也显示，完全抗原分子量明显大于bsa或ova，以上结果均证实本发明制备了bps的完全抗原。
20.(3) bps特异性抗体的制备选取3只健康balb/c小鼠作为实验生物，将100
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g的bps-bsa和等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射小鼠腹腔。每间隔14天，使用相同剂量的bps-bsa与弗氏不完全佐剂充分乳化之后对小鼠进行免疫。第4次免疫结束后3天，将小鼠处死取脾脏备用。然后复苏小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾脏细胞按照1：5的比例进行混合后，加入1 ml聚乙二醇1500，静置90 s后，1000 r/min离心10 min，将上清弃去，加入培养基重悬，并转入96孔板进行培养后，使用有限稀释法获得能分泌bps抗体的细胞株，将细胞株注射入小鼠体内后获得腹水，使用protein g亲和层析柱对抗体进行纯化，获得bps特异性抗体。
21.(4) 金纳米花的制备首先制备胶体金，将100 ml含有0.01%氯金酸的水溶液加热至沸腾后，快速加入5 ml 1%的柠檬酸钠，待溶液变为酒红色停止加热，冷却至室温备用。然后取70 ml 超纯水，加
热至55 ℃后加入0.8 ml胶体金溶液，1 ml 1%氯金酸，2.7 ml 1%柠檬酸钠溶液，搅拌均匀，迅速加入30 ml含33 mg的对苯二酚，溶液变为蓝色后继续搅拌10 min获得金纳米花。
22.(5) 酶标抗体的制备首先采用高碘酸钠法将hrp标记于bps单克隆抗体上，具体方法为将1 ml 5 mg/l hrp溶液与0.2 ml 0.1 m naio4溶液充分混合后，室温下震荡20 min。随后放入1 mm 醋酸缓冲液(ph 4.4)中4
°
c透析过夜；液体取出后加入0.5 ml 0.16 m乙二醇溶液，室温摇晃30 min；加入1 mg bps单克隆抗体混匀，低温摇晃30 min后，放入0.05 m碳酸盐缓冲液(ph 9.5)中透析过夜；再加入0.1 ml 5 mg/ml nabh4溶液于4
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c条件下摇晃2 h；随后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀后于4
°
c摇晃30 min，3000 rpm离心30 min，去除上清液，将沉淀物溶于少量0.15 m ph=7.4的pbs中并装入透析袋于pbs中4
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c透析除盐；取出液体3000 rpm离心30 min，去除沉淀物，收集上清液即为hrp标记的bps单克隆抗体。随后取8 mg hrp标记的bps单克隆抗体加入1 ml制备的金纳米花溶液中，摇晃1 h后，12000 r/min离心10 min后使用0.02 m tris-hcl溶液复溶沉淀，获得金纳米花和hrp联合标记的bps单克隆抗体。
23.实验例2、检测bps竞争elisa试剂盒的建立（1）包被抗原和酶标抗体最佳稀释倍数的确定采用棋盘滴定法来测定包被抗原和酶标抗体的最佳稀释倍数。首先，将bps-ova即包被抗原按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000的比例进行稀释。按照100 μl/孔的量加入酶标板中，4
°
c孵育过夜；第二天倾去包被液，使用洗涤液清洗3次后，加入200 μl封闭液(含2% bsa、0.1% tween-20的pbs)，37
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c孵育1 h后；将酶标抗体按照1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400进行稀释，按照100 μl/孔加入96孔板，37
°
c恒温培养箱下孵育1 h；随后每孔加入100 μl tmb显色液，37℃显色10 min后，加入100 μl 2 m h2so4终止显色反应；使用酶标仪测定每孔在450 nm处的od值，结果如表1所示，当联合标记的bps单克隆抗体的稀释度为1: 200，bps完全抗原稀释倍数为1: 1000时，竞争elisa的od
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为1.215，为最佳的稀释倍数。
24.表1为bps竞争elisa包被抗原和标记抗体最佳稀释倍数结果（2）竞争elisa标准曲线的确定将包被抗原用pbs稀释1000倍后，加入到96孔酶标板中。在4℃孵育过夜后，加入200 μl封闭液，37℃封闭1 h；加入100 μl标准品和100 μl的酶标抗体，37
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c下孵育1 h后进
行显色。结果如图5所示，当bps浓度为15.625~2000 ng/ml时，竞争elisa具有良好的线性关系，其检出限为15.625 ng/ml，可以用于bps的检测工作。
25.（3）竞争elisa特异性的确定将不同浓度的bpa、双酚f、双酚p、双酚z、双酚ap和双酚af分别作为标准品使用本发明建立的竞争elisa试剂盒进行检测，结果如表2所示，发现本发明建立的竞争elisa能特异性识别bps。
26.表2为竞争elisa特异性结果实施例3、bps竞争elisa试剂盒的使用bps直接竞争elisa试剂盒具体组成如下：(1) 空白酶标板1块；(2) bps完全抗原1支，使用前稀释1000倍；(3) bps纯品1支，使用前用抗体(抗原)稀释液稀释至所需浓度；(4) 金纳米花和hrp联合标记抗体1支，使用前用抗体(抗原)稀释液稀释200倍；(5) 包被液、封闭液、洗涤液、抗体(抗原)稀释液、显色液和终止液各1支，其中所述包被液为50 mm ph 9.6碳酸盐缓冲液：1.59 g na2co3，2 .93g nahco3，加蒸馏水至1000 ml；封闭液为含2% ova的ph 7.4磷酸盐缓冲液：0.2 g ova溶于10 ml ph7.4的磷酸缓冲液；洗涤液为含0.05%tween-20的150 mm ph7.4磷酸盐缓冲液：8.0 g nacl，0.2 g kcl，2.9 g na2hpo4·
12h2o，0.2 g kh2po
4 , 0.5 ml tween-20，加蒸馏水至1000 ml；抗体(抗原)稀释液为含0.05% tween-20、1% ova的150 mm 磷酸盐缓冲液，ph7.4；显色液为北京诺博莱德科技有限公司生产的tmb单组分显色液；终止液为2 m的h2so4水溶液。
27.本发明的检测bps的竞争elisa试剂盒，可用于样品中bps的检测工作。使用时可分为以下几个步骤：(1) 使用试剂盒内的包被液将bps完全抗原稀释1000倍，每孔加入100 μl，4
°
c包被过夜后，弃去包被液并洗涤3次；(2) 每孔加入200 μl封闭液，37
°
c孵育1 h后，弃去封闭液并洗涤3次；(3) 用抗体(抗原)稀释液将bps纯品稀释至7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000 ng/ml；将酶标抗体稀释200倍后与标准品或待测样品混合后加入96孔酶标板中，每孔100 μl，标准品或待测样品与酶标抗原各50 μl，37
°
c下孵育1小时，弃去孔
内溶液，洗涤5次；(4) 在96孔酶标板中加入100 μl显色液，于暗处37
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c反应10 min；(5) 每孔加入100 μl终止液；(6) 用酶标仪测定450 nm波长下各孔的吸光值，测定在加终止液后10分钟以内进行；(7) 计算：以标准物的浓度的对数值为横坐标，od
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值为纵坐标作标准曲线，用标准物的浓度与od
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值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的od
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值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中bps的实际浓度。