玻尿酸用于制备治疗急性呼吸窘迫症药剂的用途的制作方法

1.本发明涉及玻尿酸用于治疗急性呼吸窘迫症的用途。


背景技术：

2.急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome，简称ards)，是一种复杂且多个因素都会导致的疾病。根据柏林定义(berlin definition)，病患暴露在危险因子七天之内，产生急性肺部弥漫性发炎、低血氧、与呼吸衰竭等现象(mattay et al.,2012)。是一种急性肺损伤的症状，是具有生命威胁性的疾病。急性呼吸窘迫症会破坏肺部结构，病人会因呼吸衰竭、以及多重器官衰竭，而住进加护病房，造成耗费巨大的医护人力及医疗资源。在目前临床医学上，没有药物可以治疗急性呼吸窘迫症，只有支持性的疗法，因此致死率极高，所以，ards在重症医学界原本就已经是一个相当令人头痛的疾病。
3.2020年，更因为新冠肺炎的大流行，导致ards病患大量的增加。根据统计，有高达31％-42％新冠肺炎住院的病人会有ards，而其中又有61-81％的病患需要住进加护病房(wu et al.,2020)(gibson et al.,2020).这些新冠病毒感染的重症患者，在急性期都有严重的肺部发炎反应，在恢复期也有不同程度的肺脏纤维化现象，造成肺功能永久性的退化、甚至导致其他器官的终生损害。因此，针对急性呼吸窘迫症发展药物，不仅可以减轻急性呼吸窘迫症病情的严重程度、降低急性呼吸窘迫症病人的死亡率、也可以避免后续肺脏或其他器官的损伤情况、更可以缓解医院重症加护病房的压力。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome,简称ards)新的治疗方向。
5.一方面，本发明提供玻尿酸用于制造治疗急性呼吸窘迫症药剂的用途。
6.另一方面，本发明提供一种用于治疗急性呼吸窘迫症的药剂或医药组合物，其包含治疗有效量的玻尿酸。
7.再一方面，本发明提供了一种治疗急性呼吸窘迫症的方法，包含对有此需要的个体施用包含治疗有效量的玻尿酸的药剂或医药组合物。
8.根据本发明，本发明方法特别适用于严重的急性呼吸窘迫症。
9.根据本发明，本发明可使用分子量10kda-2mda的玻尿酸。
10.根据本发明实施例，对于ards模型的大白鼠施打玻尿酸，可有效改善ards的症状，可减缓因ards明显上升的呼吸频率、使血氧浓度显著回升、改善肺脏体积与肺泡体积、降低肺泡上皮细胞变形、减少发炎反应减少胶原蛋白堆积、促使抗发炎的m2细胞生成、增加mmp(matrix-metallopeptidase)的活性以促进抗发炎反应与分解纤维化，并且可以刺激肺泡上皮细胞的再生。
11.根据本发明实施例，玻尿酸有效改善降低的血氧饱和度水平，缓解增加的呼吸速率和/或恢复肺泡功能。
12.在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从以下几个实施例的详细描述以及从所附的权利要求中，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。
附图说明
13.当结合附图阅读时，将更好地理解前面的概述以及以下对本发明的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前较佳的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的精确布置和手段。
14.在附图中：
15.图1显示诱发大白鼠产生严重的急性呼吸窘迫症、和施打玻尿酸的实验流程图，共分5组，每组于第0天注射blm入大白鼠左支气管，第7天给予药物治疗，第28天牺牲动物。
16.图2显示大白鼠在blm伤害后7天内，血氧指数的变化。图2中的a部分显示blm伤害后7天内，每天侦测大白鼠后肢的动脉血氧饱和度的照片。图2中的b部分为blm伤害后7天内，大白鼠每天动脉饱和度的定量图，其显示blm伤害第七天，动脉血氧饱和度降到最低。图2中的c部分为blm伤害后7天内，大白鼠的动脉血内氧分压指数定量图，其显示blm伤害后第七天，动脉血氧分压降到最低。图2中的d部分为blm伤害后7天内，大白鼠的动脉血内二氧化碳分压指数定量图，其显示blm伤害后第七天，动脉血二氧化碳分压上升到最高。根据动脉血氧指数，确认大白鼠严重的急性呼吸窘迫症动物模式成功建立。*：与第0天(day 0)相比，有统计差异，p《0.05。@：与第1天(day 1)相比，具统计差异显著性，p《0.05。与day 4相比，有统计差异，p《0.05。
17.图3显示大白鼠在blm伤害后7天内，呼吸速率的变化。图3中的a部分显示blm伤害后7天内，每天侦测大白鼠的呼吸速率记录图，撷取2秒的呼吸速率图。图3中的b部分为blm伤害后7天内，大白鼠每天每分钟的呼吸速率定量图，其显示blm伤害第七天，呼吸频率达到最高。根据每分钟的呼吸次数，确认大白鼠严重的急性呼吸窘迫症动物模式成功建立。*：与day 0相比，有统计差异，p《0.05。@：与day 1相比，具统计差异显著性，p《0.05。
18.图4显示大白鼠在blm伤害后不同天数，牺牲灌流后，肺部的巨观型态。由图中可观察到，在blm伤害第一天，左肺表面开始出现不平整的情形。在blm伤害第二天，左肺中央区域肺泡已经有局部不见。在blm伤害第七天，左肺萎缩、中央区域肺泡不见。根据左肺巨观型态，确定大白鼠严重的急性呼吸窘迫症动物模式成功建立。
19.图5显示大白鼠在blm伤害后不同天数，左肺的微观型态。图5中的a部分为大白鼠在不同天数，左肺组织切片经he染色的低倍图，其中白色空间为肺泡组织。图5中的b部分为大白鼠在不同天数，左肺中央区域(图5中的a部分中红框区域)组织切片经he染色的高倍图，其显示blm损伤之后，都呈现细胞浸润，肺泡逐渐减少。图5中的c部分为大白鼠在不同天数，左肺外周围区域(图5中的a部分中蓝框区域)组织切片经he染色的高倍图，其显示blm损伤之后，还有一些肺泡存在(白色空间)，只是随着伤害天数增加，肺泡逐渐减少。图5中的d部分为定量经过he染色后，伤害后不同天数的左肺总体积；图5中的e部分为左肺肺泡体积；图5中的f部分为左肺细胞浸润占比。图5中的d-f部分显示blm伤后左肺体积逐渐变小、肺泡变少、细胞浸润比例增加。根据左肺微观型态，确定大白鼠严重的急性呼吸窘迫症动物模式成功建立。*：与day 0的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
20.图6显示给予玻尿酸，可以增加ards病鼠的体重。*：与同日正常组的大白鼠相比，
具统计差异显著性，p《0.05。#：与同日blm伤害组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。与同日blm mix ha组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
◆
，与同日的blm lha组大白鼠相较，有统计差异显著性，p《0.05。
21.图7显示给予玻尿酸能增加ards病鼠动脉血的含氧饱和度。图7中的a部分为第28天，各组大白鼠进行脉冲式动脉血氧仪检测的照片，其中箭头所指为动脉血氧饱和度的数值。图7中的b部分为定量各组大白鼠，在不同时间里，动脉血氧饱和度的数值。*：与同日正常组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。#：与同日blm组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。与同日blm mix ha组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
◆
，与同日的blm lha组大白鼠相较，有统计差异显著性，p《0.05。
22.图8显示给予玻尿酸能减缓ards病鼠的呼吸急促。图8中的a-e部分为各组大白鼠在不同时间，呼吸频率的2秒撷取纪录图。图8中的f部分为定量各组大白鼠，在不同时间里，每分钟的呼吸速率。*：与同日正常组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。#：与同日blm组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。与同日blm mix ha组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
23.图9显示给予玻尿酸，能提升ards病鼠的左肺体积。图为各组大白鼠在第28天的肺脏外观图，上排为各组肺脏正面照，下排为各组肺脏的背面照。
24.图10显示给予玻尿酸能修复ards病鼠的肺泡结构。图10中的a部分为第28天的各组大白鼠左肺组织片，经过he染色的低倍率图片。图10中的b部分为第28天的各组左肺组织片经过he染色高倍率放大中央区域的照片。图10中的c部分为第28天的各组左肺组织片经过he染色高倍率放大左肺外周围的照片。图10中的d部分加总所有左肺组织切片定量左肺体积。图10中的e部分定量左肺的肺泡总体积。
25.图11显示给予玻尿酸能降低ards病鼠肺脏内的发炎反应、与肺泡上皮细胞的变形反应。图11中的a部分为定量各组大白鼠左肺，在第28天时，肺泡冲洗液内的细胞数量，以代表发炎情形。blm组大白鼠的左肺的肺泡冲洗液内的细胞数量明显增加。图11中的b部分为第28天的各组大白鼠左肺，以西方墨点法定量左肺n-钙粘蛋白(n-cadherin)的浓度，来代表肺泡上皮细胞的变形。*：与正常组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。#：与blm组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。与同日blm mix ha组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
26.图12显示给予玻尿酸能促进ards病鼠左肺内第二型巨噬细胞、减少第一型巨噬细胞，以降低发炎反应。图12中的a部分为第28天的各组大白鼠左肺，以anti-ed1抗体进行组织免疫染色，标定巨噬细胞。显示，blm组的吞噬细胞多为较小型态。而blm mix ha组的吞噬细胞多为较大型态。图12中的b部分为第28天的各组大白鼠左肺组织，以anti-cd86抗体进行西方墨点法染色，以定量m1巨噬细胞的变化情形。图12中的c部分为第28天的各组大白鼠左肺组织，以anti-cd206抗体进行西方墨点法染色，以定量m2巨噬细胞的变化情形。*：与正常组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。#：与blm组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
27.图13显示给予玻尿酸能促进ards病鼠左肺内mmp的合成，降低发炎反应。图13中的a部分为第28天的各组大白鼠左肺组织，以anti-mmp9抗体进行西方墨点法染色，以定量mmp9蛋白质含量。图13中的b部分为第28天的各组大白鼠左肺组织，以anti-mmp2抗体进行
西方墨点法染色，以定量mmp2蛋白质含量。*：与正常组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。#：与blm组的大白鼠相比，具统计差异显著性，p《0.05。
28.图14显示给予玻尿酸能促进ards病鼠左肺内tlr4的合成，以刺激肺泡上皮细胞的再生。图为第28天的各组大白鼠左肺组织，以anti-tlr4抗体进行西方墨点法染色，以定量tlr蛋白质含量。*：与正常组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。#：与blm组的大白鼠相比，有统计差异，p《0.05。
具体实施方式
29.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
30.如本文所使用的，冠词“一”和“一个”是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
31.术语“包括”或“包含”通常以包括/包括允许存在一个或多个特征，成分或组分的意义来使用。术语“包括”或“包含”涵盖术语“由...组成”或“由......组成”。
32.如本文所使用，“急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome，简称ards)”乙辞是病患的肺部变化源于广泛性的肺泡微血管受损，使得内皮细胞间通透性增加，引发肺泡出血及水肿等现象，最后导致肺内死腔及分流增大，肺顺应性与氧合状况变差，而造成临床上的呼吸窘迫病症。
33.如本文所使用，“玻尿酸(hyaluronan或hyaluronic acid)，简称ha)”，又称透明质酸或醣醛酸，存在于人体的结缔组织及真皮层中，是一种透明的胶状物质。玻尿酸依照分子量，可以区分为低分子量玻尿酸(mw 10kda-100kda)、中分子量玻尿酸(mw 100kda-1mda)、与高分子量玻尿酸(》mw 1mda)(tavianatou et al.,2019)。本发明使用的玻尿酸可包括以上不同分子量的玻尿酸或其盐，及其混合，分子量范围为10kda-2mda。
34.如本文所用，如本文所述的与肺功能有关的指数或与疾病症状的降低或升高的水平是参照其对照(或正常)水平。如本文所使用的，术语“正常水平”或“对照水平”是描述本领域普通技术人员和/或医疗专业人员预期一个健康的个体或具有类似身体特征和病史的人群具有的值。例如，升高的水平表示高于对照(或正常)水平5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％，500％或更多，与对照(或正常)水平比较而言；而降低的水平是指低于对照(或正常)水平5％，10％，20％，30％，50％，70％，90％，100％，200％，300％，500％或更多，与对照(或正常)水平相比而言。
35.如本文所用的术语“需要治疗方法的个体”是表示需要治疗ards的人类或非人类动物。
36.在一些具体实施态样中，需要本发明治疗方法的个体有以下列症状诊断为患有ards：(1)急性发作；(2)氧合指数(pao2/fio2)降低；(3)胸部x光呈现两侧肺浸润；(4)肺动脉楔压若有测量，小或等于18毫米汞柱，若无资料，则以临床上无左心房高压现象。
37.在此使用的术语“个体”或“主体”包括人类和非人类动物，如伴侣动物(如狗，猫等)，农场动物(如牛，绵羊，猪，马等)，或实验动物(如大鼠，小鼠，豚鼠等)。
38.如本文所用的术语“治疗”是指将包含一种或多种有效活性剂的组合物施用或施用于患有疾病，疾病病症或疾病症状或疾病进展(恶化)的对象，目的是治愈，治愈，缓解，舒
解，改变，改善，改良，增进或影响该疾病，该疾病的病症或症状，疾病诱发的障碍或障碍的进展。
39.本文使用的术语“治疗有效量”是指活性成分在治疗对像中提供所需的治疗或生物作用的量。例如，用于治疗ards的有效量。
40.治疗有效量可以根据各种原因而改变，例如给药途径和频率，接受所述药物的个体的体重和种类，以及给药目的。本领域技术人员可以根据本文的公开内容，确定的方法和他们自己的经验确定每种情况下的剂量。
41.根据本发明，可以通过本领域已知的各种程序来施用，可以全身给药，例如，经由注射通过静脉内，动脉内给药，或皮下注射给药，或以鼻腔吸入，或鼻腔或口腔伸入气管给药、或气切给药。
42.为实施本发明的方法，可以将含玻尿酸以本发明领域习用的方法将其送至肺，其中一具体实施例是以注射经血液传送至肺，或可以直接由呼吸道、口腔(例如鼻、口、或气管)递送至肺。另一具体实施例，系通过直接注射递送至期望的区域。作为活性成分的玻尿酸可与药学上可接受的载体一起配制成适当形式的医药组合物或医疗器材用于递送。基于不同的给药方式，本发明的医药组合物或医疗器材可包含约0.1重量％至约100重量％的活性成分，其中基于整个组合物的重量计算重量百分比。“医药上可接受的载体”在所采用的剂量和浓度下对个体是无毒的，并且与玻尿酸和包含玻尿酸的任何制剂的任何其他成分兼容。
43.在一些具体实施态样中，可以在合适的等渗液体，例如，磷酸盐缓冲盐水，生理盐水，葡萄糖水溶液和/或其混合物以及本领域技术人员已知的其它合适的液体中制备。应该保护最终的治疗形式免受污染，并应该能够抑制微生物如细菌或真菌的生长。其中一具体实施例是以施用单一的剂量。或者，可以使用缓慢的长期输注或多个短期的每日输注。如果需要，也可以使用每隔几天交替一天或一次给药。
44.通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅用于说明而不是限制。根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
45.实施例
46.1.材料与方法
47.1.材料与方法
48.1.1严重的急性呼吸窘迫症动物模式的建立
49.取雄性大白鼠(sd rats，230-250g)以舒泰50(zoletil 50)及盐酸二甲苯胺噻嗪(xylazine hydrochlotide)(sigma 23076359)腹腔注射，确定大白鼠深层麻醉之后，将5mg博来霉素(bleomycin，简称blm)溶在200μl的无菌生理食盐水(1unit activity/1mg blm,nippon kayaku co.,ltd.)，以30g针头，打入大白鼠的支气管内，接着，大白鼠左侧卧60度、90分钟，造成严重的、可重复性的、左肺损伤的动物模式(chu et al.,2019)。
50.1.2玻尿酸的给予
51.玻尿酸依照分子量，可以区分为低分子量玻尿酸(mw 10kda-100kda)、中分子量玻尿酸(mw 100kda-1mda)、与高分子量玻尿酸(》mw 1mda)(tavianatou et al.,2019)，本实施例使用不同分子量玻尿酸的混合、高分子量玻尿酸、及低分子量玻尿酸。在blm注射后第7
天开始，即第二周给予三次玻尿酸，第三周、和第四周都给予两次玻尿酸，也就是分别在blm伤害后第7、9、11、14、17、21、24天给予玻尿酸(图1)。均经由气管内打入麻醉中的老鼠体内。
52.1.3实验分组
53.本实验动物共分五组：
54.第一组为正常组，即在第0天，大白鼠气管内接受200μl生理食盐水注射的正常大白鼠，在第7天开始，经气管内只注射200μl生理食盐水(图1)。
55.第二组为blm组，即在第0天，大白鼠气管内接受5mg blm注射的病鼠组。在blm注射后第7天开始，经气管内只给予200μl生理食盐水，不给予任何治疗(图1)。
56.第三组为blm lha组，即在第0天，大白鼠气管内接受5mg blm注射。在blm伤害后第7天开始，经气管内给予低分子量玻尿酸(mw10kda-100kda)，共七次(图1)。
57.第四组为blm hha组，即在第0天，大白鼠气管内接受5mg blm注射。在blm伤害后第7天开始，经气管内给予高分子量玻尿酸(》mw 1mda)，共七次(图1)。
58.第五组为blm mix ha组，即在第0天，大白鼠气管内接受5mg blm注射。在blm伤害后第7天开始，经气管内给予混合分子量玻尿酸(mw 10kda-2mda)，共七次(图1)。
59.各组大白鼠，每周都测量体重、动脉血氧浓度、与呼吸频率，在blm给予后第28天牺牲，观察肺脏型态。
60.1.4实验动物肺功能检测-动脉血氧饱和度的测定
61.以isoflurane(baxter228-194)将老鼠麻醉后，使用脉冲式血氧浓度器(pulseoximeter,nonin ls1-10r)夹住后足底，以侦测动脉血中的氧气饱和度。
62.1.5实验动物肺功能检测-肺部呼吸频率的测定
63.将实验动物放置于密闭式的圆筒呼吸侦测舱室(emka technologies,whole body plethysmograph)，以biopac bsl 4.0mp45软件收集大白鼠15分钟内呼吸气流的变化情形，定量大白鼠在舱室内静置不动时的呼吸频率。
64.1.6实验动物灌流固定与组织的石蜡包埋
65.将过量的舒泰50(zoletil 50)及盐酸二甲苯胺噻嗪(xylazine hydrochloride)(sigma 23076359)以腹腔注射方式打入老鼠体内，麻醉致死后，再进行灌流。灌流后，取出左、右肺脏，置于4℃环境中后固定2天，接着，进行石蜡包埋。
66.固定后的左、右肺脏，依序放入浓度递增的酒精中(70％、80％、95％、100％)脱水，每次20分钟。组织脱水结束后，放入二甲苯(xylene)、二甲苯：石蜡＝1：1混合液、二甲苯：石蜡＝1：3混合液、纯蜡中浸泡。最后，组织以纯蜡包埋。
67.1.7组织切片与取片方式
68.组织蜡块剃除多余石蜡，并修成梯形。使组织蜡块固定于石蜡切片机上。将肺脏组织切成5μm厚度的切片。组织切片置于40℃至45℃温水中展平，再将肺脏组织切片贴于玻片上，放置50℃加热平台上烘干。
69.由肺脏最外侧进行矢状切面，进行连续切片、并取片。
70.1.8染色苏木紫-伊红染色(hematoxylin&eosin stain，简称he stain)
71.肺组织切片先进行脱蜡，依序放入二甲苯、浓度递减的酒精中(100％、95％、80％、70％酒精)、置于苏木精(hematoxylin)溶液(武藤化学，no.3008-1)中染5分钟，接着，将肺组织片置于伊红(eosin)溶液(武藤化学，no.3200-2)中染2.5分钟，随即，组织片浸泡于冰
醋酸3秒，再以流动的水冲洗。肺组织切片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水(依序为50％、70％、80％、90％、95％、100％)，再浸泡于二甲苯两次，每次5分钟。最后，以封片胶(permount,fisher scientific sp15-500)封片，进行光学显微镜观察及拍照。
72.1.9支气管肺泡冲洗液(bronchoalverlar lavage，简称bal)的细胞计数
73.大白鼠以pbs灌流完成后，由气管将整个肺取出，以20g针头搭配pe插管(pe60，内径0.76
×
外径1.22mm)，将插管由左支气管伸入左肺，以0.5ml无菌pbs进行冲洗后吸出。接着，进行第二次冲洗，以新的0.5ml无菌pbs冲吸一次；由此得到1ml肺泡冲洗液。将取得的肺泡冲洗液以1500rpm离心5分钟，下层细胞则以1ml食盐水回溶，进行细胞计数。
74.1.10蛋白质萃取
75.取各组大白鼠的肺脏组织，放入钵中加入液态氮，磨碎后加入适量ripa溶析缓冲液(lysis buffer)(millipore 20-188)，于4℃作用至隔夜，待肺脏组织均质化后，在4℃以13000rpm离心30分钟，取上清液冻至-20℃冰箱保存。
76.1.11免疫染色(immunostaining)与西方墨点法(western blotting)
77.将肺组织切片、或左肺蛋白质跑完电泳的nc试纸(nc paper)，分别加入初级抗体抗-n钙粘蛋白(anti-n cadherin)(abcam ab18203，1:1000)、抗-ed1抗体(millipore mab1435，1:400)、抗-cd86抗体(proteintech 13395-1-ap，1:1000)、小鼠抗-cd206(abcam ab64693 1:1000)、抗-mmp9(abcam ab76003，1:1000)、抗-mmp2(abcam ab92536，1:1000)、抗-tlr4(abcam ab30667，1:1000)，于4℃下反应16至18小时。接着，与二级抗体(secondary antibodies)于室温下反应60分钟，再以abc套组(avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex(abc)kit，vector laboratories)于室温下反应60分钟后，以0.01m pbs清洗5分钟3次，最后，以dab[diaminobenzidine，二氨基联苯胺](5mg dab，30％h2o2 3.5μl in 10ml tris-hcl ph7.4)进行呈色。
[0078]
1.12统计分析
[0079]
所有实验数据以平均值标准误差(mean
±
sem,standard error of the mean)表示。各平均值间的比较以单因子变异细数分析(one-way anova)、或双因子变异细数分析(two-way anova)，再以turkey’s test进行多重比较。实验数据皆以p《0.05作为具有显著差异的最低起始标准。
[0080]
2.结果
[0081]
2.1严重的急性呼吸窘迫症动物模式的建立
[0082]
给予blm伤害七天内，侦测大白鼠的肺功能变化情形。首先，是脉冲式血氧浓度器侦测后肢足底的动脉血含氧饱和度，可代表肺部氧气交换的效能。在伤害之前(day 0)，动脉血氧饱和度通常维持在97％。伤害后第一天会下降到87.7
±
1.2％，第二天再下降至84.7
±
1.7％，在伤害后第7天只剩83.7
±
0.9％(图2中的a及b部分)。第二种侦测方式是抽取老鼠的尾动脉血液，来侦测动脉血内的含氧分压、与二氧化碳分压。在伤害之前(day 0)，动脉血的氧分压(po2)约88.1
±
2.7mmhg；伤害后第4天，会显著下降到74.2
±
4.2mmhg；伤害后第7天只剩66.3
±
3.9mmhg(图2中的c部分)。在伤害之前(day 0)，动脉血的二氧化碳分压(pco2)约46.4
±
1.6mmhg；伤害后第4天，会上升到49.0
±
1.3mmhg；伤害后第7天更升高至53.8
±
2.0mmhg(图2中的d部分)。第三种侦测是每分钟的呼吸频率。在伤害之前(day 0)，呼吸频率约为132.3
±
11.8cycles/min；伤害后第1天，会上升到188.0
±
32.6cycles/min；之
后，老鼠的呼吸逐渐加速，在伤害后第7天增加到330.3
±
17.3cycles/min(图3中的a及b部分)。由此结果显示，blm伤害造成肺功能下降，动脉血液呈现缺氧的情形，导致呼吸的急促。
[0083]
由肺的巨观来观察，正常大白鼠不论是左肺、或是右肺，都呈现平滑完整，白色为正常肺泡的位置。在伤害后第一天，左肺已经出现凹凸不平的表面。在伤害后第二天，左肺中央区域，白色肺泡已经有部分丧失。在伤害后第四天，左肺中央区域内的白色肺泡完全不见，仅剩周围区域有肺泡存在。到伤害后第7天，左肺明显萎缩，而且，只剩周围区域有肺泡存在(图4)。接着，左肺组织切片进行he染色，观察微细型态的变化(图5中的a部分)。分别放大，左肺中央区域、与周围区域(图5中的b及c部分)，normal组大白鼠的左肺，无论是中央、或周围区域都是正常的肺泡组织，结缔组织多存在于支气管周围，肺泡与肺泡之间的结缔组织极少。在伤害后第一天，不论是中央区域、或周围区域，在肺泡之间开始出现细胞浸润的情形。伤害后第二天到第七天，细胞浸润的情形越来越严重，左肺中央区域的肺泡几乎消失不见。仅在左肺的周边区域，仍然有少许的肺泡存在(图5中的a-c部分)。进一步，我们加总所有的肺组织切片，推算出左肺的总体积，正常组的左肺体积大约317.6
±
19.4mm3立方毫米。在blm伤害后第7天，明显降低到217.2
±
17.0mm3左右，与正常组相比有明显的萎缩(图5中的d部分)。此时萎缩的左肺，肺泡结构的体积也下降到59.7
±
8.4cm3；大量细胞浸润的实质化组织，则占左肺体积的63.8
±
2.5％左右(图5中的e及f部分)。在blm伤害之后，大白鼠每分钟呼吸频率在七天内急遽上升、动脉含氧指数都显著下降、左肺的肺泡减少、组织间大量的细胞浸润，这些，都与临床上的急性呼吸窘迫症的特性相同。因此，我们成功建立严重的、可重复性的、一致性的、急性呼吸窘迫症的动物模式。我们因此选择急性期、最严重的第七天，开始给予治疗。
[0084]
2.2给予玻尿酸可以增加严重的急性呼吸窘迫症病鼠的体重
[0085]
正常组大白鼠随着时间增加，体重也有逐渐上升的情形。在给予blm伤害后第7天，各组大白鼠体重都有明显停滞的现象。之后，体重随着时间虽然也有些微增长，但各组大白鼠与正常组大白鼠的体重相较，都呈现明显减少的现象，并且，体重较正常组少的趋势一直持续到第28天。blm hha组大白鼠的体重，一直都与blm组相近。blm hha组大白鼠的体重，从第14天到第28天，都比blm mix ha组来的少。第blm lha组大白鼠的体重，在第28天，与blm组大白鼠相较，有显著的增加情形。blm mix ha组大白鼠的体重，则在第21天与第28天，都较blm组大白鼠的体重有统计上的提升(图6)。
[0086]
2.3给予玻尿酸能够提升严重的急性呼吸窘迫症病鼠的动脉血的氧合指数
[0087]
以脉冲式血氧浓度仪分析动脉血氧饱和度(spo2)，由此评估肺部气体交换的功能。结果显示，在实验时间的28天内，正常组大白鼠的血氧饱和度均维持在98.2％左右(图7中的a及b部分)。在给予blm伤害后第7天，各组大白鼠的血氧饱和度都有明显下降的现象，约为84.3
±
0.7％，一直到第28天，blm组大白鼠的动脉血氧饱和度并没有改善，与正常组大白鼠相较，均呈现明显的减少(图7中的a及b部分)。blm hha组大白鼠，在第28天时的动脉血氧饱和度都约为86％左右，与blm伤害组相较，并没有统计上差异。blm hha组大白鼠的动脉血氧饱和度，从第14天到第28天，都比blm mix ha组来的少。从第14天到第28天，blm lha组、与blm mix ha组大白鼠的动脉血氧饱和度，相较blm组都有明显的增加。然而，blm mix ha组大白鼠的动脉血氧饱和度在第21天与第28天又较blm lha组有更明显的改善(图7中的a及b部分)。
[0088]
另外，在blm伤害之前(day 0)，大白鼠动脉血内的氧分压约为86.4-89.7mmhg(图7中的c部分)。在给予blm伤害后第7天，各组大白鼠动脉血氧分压都有明显下降的现象，blm组大白鼠一直到第28天，动脉血氧分压并没有太大变化，与正常组大白鼠相较，均呈现明显的减少(图7中的c部分)。blm hha组大白鼠，在第28天时的动脉血氧分压虽然有些微上升的趋势，但与blm组相较，并没有统计上差异。而且，blm hha组大白鼠的动脉血氧分压，在第28天时，仍然低于blm mix ha组大白鼠。blm lha组大白鼠的动脉血氧分压，在第28天，相较blm组有明显的增加。blm mix ha组大白鼠的动脉血氧分压在第14天已经显著升高，此上升趋势一直持续到第28天，动脉血氧分压相较blm组，都有明显的改善(图7中的c部分)。
[0089]
在blm伤害之前(day 0)，大白鼠动脉血内的二氧化碳分压约为46.6-47.9mmhg(图7中的d部分)。在给予blm伤害后第7天，各组大白鼠动脉血二氧化碳分压都较正常组有明显上升的情形，升高至51.6
–
54.7mmhg。到第14天，各组动脉血二氧化碳分压仍旧是升高的情形。只有blm mix ha组大白鼠的动脉血二氧化碳分压在第14天已经显著下降，较blm组减少，与normal组相近。其余各组大白鼠(blm组、blm lha组、和blm hha组)动脉血内二氧化碳分压，在第21天，都与正常组大白鼠没有统计差异(图7中的d部分)。
[0090]
2.4给予玻尿酸能舒缓严重的急性呼吸窘迫症病鼠的呼吸速率
[0091]
侦测大白鼠的呼吸频率结果显示，正常组大白鼠从第0天到第28天，一直都保持呼吸速率相当稳定的情形，两秒内的呼吸次数约维持4-5次(图8中的a及f部分)。在blm伤害后第7天，各组的呼吸速率都明显上升。blm组，在第7天到第28天，呼吸速率都较正常组明显增快(图8中的b及f部分)。blm hha组大白鼠，从第7天到第28天的呼吸速率，都与blm组相似。而且，blm hha组大白鼠的呼吸速率，在第21天、与第28天时，仍然高于blm mix ha组大白鼠(图8中的d及f部分)。blm lha组大白鼠的呼吸速率在第14天，与blm组相比，有明显的减少，但是，呼吸频率仍然高于正常组(图8中的c及f部分)。blm mix ha组大白鼠的呼吸速率在第14天，相较blm组，已有明显的降低，此趋势一直持续到第28天；并且，blm mix ha组大白鼠的呼吸速率在第21天与第28天的呼吸速率与正常组并没有统计差异(图8中的e及f部分)。
[0092]
2.5由外型巨观及he染色显示，给予玻尿酸，能改善严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺的萎缩
[0093]
在第28天，牺牲灌流各组大白鼠，取其左、右肺脏，观察肺部的外观型态。由前面观(上排)、与背面观(下排)照片显示，正常组大白鼠的左、右肺均可以看见白色肺泡结构，肺泡呈现完整、平滑的情形。blm组的左肺明显萎缩，非常少量的肺泡组织仅出现在左肺的外周围，左肺的中央区域已经呈现没有肺泡的病变组织。其中，blm mix ha组大白鼠，他们左肺的白色肺泡区域、以及整体左肺的体积，与blm伤害组相比，都有明显的增大(图9)。
[0094]
各组大白鼠左肺连续的组织切片，经he染色，取低倍率图片(图10中的a部分)，再分别放大左肺的中央区域(图10中的b部分)、与周边区域(图10中的c部分)。结果显示，正常组大白鼠左肺面积较大、肺泡较多，结缔组织只出现在支气管周围，肺泡与肺泡之间的结缔组织极少。blm组大白鼠的左肺，完整的肺泡只出现在左肺的外周围，中央区域均为大量细胞浸润、几乎看不到肺泡的存在。而blm mix ha组大白鼠，他们左肺中央区域虽然也有大量的细胞浸润，但也存在不少肺泡空间(白色空间)(图10中的b及c部分)。加总所有he染色的左肺组织切片，经由统计定量，结果显示，blm组左肺总体积明显萎缩，萎缩左肺内的肺泡体积显著减少(图10中的d-e部分)。其中，blm mix ha组大白鼠的左肺体积明显提升，左肺肺
泡体积较多，与正常组大白鼠左肺的结构比例相当。推测给予混合分子量的玻尿酸，可以提升左肺的整体体积、回复左肺的肺泡空间(图10中的d-e部分)。
[0095]
2.6给予玻尿酸能降低严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺内发炎反应、与肺泡上皮细胞的emt反应
[0096]
计算支气管与肺泡的冲洗液内的细胞数目，细胞数目越多，代表发炎反应越剧烈。
[0097]
第28天，取各组大白鼠左肺的肺泡冲洗液，进行细胞计数。结果显示，blm组大白鼠的左肺的肺泡冲洗液内的细胞数量明显增加。blm lha组、和blm hha组大白鼠肺泡冲洗液内的细胞数量，相较于blm组，都有显著降低的情形，但仍较normal组来得多。blm mix ha组大白鼠的左肺的肺泡冲洗液的细胞数量，与blm伤害组相比，有显著降低，且与normal组并没有统计差异。推测给予玻尿酸，都能够减少严重的急性呼吸窘迫症病鼠的肺部发炎反应，因此，左肺内的细胞数量减少，尤其，给予混合各分子量的玻尿酸，与正常组相似(图11中的a部分)。
[0098]
blm伤害后，alveolar type ii cell会大量的增生，进行上皮细胞变形反应(epithelial mesenchymal transition，简称emt)，此时，n-钙粘蛋白(n-cadherin)大量表现。此时，alveolar type ii cell变型成为myofibroblasts，造成肺泡减少、组织结疤。
[0099]
以抗-n-钙粘蛋白抗体进行西方墨点法(western blotting)，结果显示，正常组大白鼠的左肺中仅有少量n-钙粘蛋白存在。blm组大白鼠的左肺中会有大量表现n-钙粘蛋白，代表肺泡上皮细胞大量的增生，进行上皮细胞变形反应。然而，blm mix ha组大白鼠左肺n-钙粘蛋白产量，与blm伤害组相较，呈现降低情形。blm mix ha组大白鼠左肺n-钙粘蛋白产量，与正常组相近(图11中的b部分)。
[0100]
2.7给予玻尿酸能促进严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺内第二型巨噬细胞活化，以进行抗发炎作用。
[0101]
各组大白鼠的左肺组织切片，以抗-ed1抗体进行组织免疫染色，以标定巨噬细胞。结果显示，正常组大白鼠左肺中仅有少量、形态较小的巨噬细胞存在。blm组大白鼠的左肺组织间，出现大量形态较小颗的巨噬细胞。blm mix ha组大白鼠左肺组织间，仍然有许多形态较小的巨噬细胞存在，但是，出现型态较大的吞噬细胞分布在结缔组织间、及肺泡空间内(图12中的a部分)，推测这些型态较大的巨噬细胞是具有抗发炎作用的第二型巨噬细胞。
[0102]
以抗-cd86抗体西方墨渍法，标定第一型巨噬细胞。第一型巨噬细胞具有促进发炎的效果。结果显示。blm组大白鼠的左肺内cd86的含量上升。然而blm mix ha组大白鼠左肺内cd86的浓度下降，与blm组相比，有统计上差异(图12中的b部分)。推测给予玻尿酸，能避免严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺内第一型巨噬细胞的分化与转型，以降低发炎反应。
[0103]
进一步，以anti-cd206抗体西方墨渍法，标定第二型巨噬细胞，第二型巨噬细胞具有抗发炎的作用。blm mix ha组大白鼠左肺内cd206的浓度升高，与正常(normal)组、和blm组相比，都呈现统计上的增加(图12中的c部分)。推测给予玻尿酸，能促进严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺内第二型巨噬细胞的分化与转型，以进行抗发炎反应。
[0104]
2.8给予玻尿酸能刺激严重的急性呼吸窘迫症病鼠左肺内的mmp生成，降低发炎反应
[0105]
定量各组大白鼠左肺中基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9，简称mmp-9)蛋白质的含量，结果显示，blm组大白鼠左肺内的mmp-9，与正常组相比，呈现减少的
from marine organisms.adv food nutr res.2014；72:61-77.
[0117]
6.hadidian z,pirie n.the preparation and some properties of hyaluronic acid from human umbilical cord.biochem j.1948；42:260-65.
[0118]
7.chu ka,wang sy,yeh cc,fu tw,fu yy,ko tl,chiu mm,tsai pj,fu ys.reversal of bleomycin-induced rat pulmonary fibrosis by a xenograft of human umbilical mesenchymal stem cells from wharton’s jelly.2019theranostics.22(9):6646-6664.
[0119]
8.liang,j.,y.zhang,t.xie,n.liu,h.chen,y.geng,a.kurkciyan,j.m.mena,b.r.stripp,d.jiang&p.w.noble(2016)hyaluronan and tlr4 promote surfactant-protein-c-positive alveolar progenitor cell renewal and prevent severe pulmonary fibrosis in mice.nat med,22,1285-1293.
[0120]
9.tavianatou,a.g.；caon,i.；franchi,m.；piperigkou,z.；galesso,d.；karamanos,n.k.hyaluronan:molecular size-dependent signaling and biological functions in inflammation and cancer.febs j.2019.286:2883-2908.
[0121]
10.yang h-z,wang j-p,mi s,liu h-z,cui b,yan h-m,et al.tlr4 activity is required in the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis after acute and chronic lung injury.am j pathol.2012；180:275-292.