补骨脂素在人皮肤T细胞淋巴瘤治疗药物中的应用

补骨脂素在人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物中的应用
技术领域
1.本发明属于人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物研制技术领域，具体涉及补骨脂素在人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。


背景技术：

2.t细胞淋巴瘤是一类来源于t淋巴细胞的恶性克隆增殖性疾病，是亚洲国家比较常见的淋巴瘤类型。nk/t细胞淋巴瘤(natural killer/tcelllymphoma)是非霍奇金淋巴瘤的一个亚型，发病率居t细胞淋巴瘤的首位，中国发病率远高于西方国家。外周t细胞淋巴瘤如结外鼻型nk/t细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤具有高度侵袭性，病程进展快，生存期短，预后较差等特点，对我国人民的生命健康构成了严重威胁。
3.从补骨脂中分离出香豆素类、黄酮类、单萜酚类，以及豆甾醇、谷甾醇葡萄糖苷、棉子糖等化合物，其中香豆素类、黄酮类及单萜酚类化合物是其主要活性成分。补骨脂素和异补骨脂素属香豆素类化合物。补骨脂素(psoralen)化学式为：c
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h6o3，为无色针状结晶，有挥发性，溶解于甲醇、乙醇、苯、氯仿、丙酮；微溶于水、乙醚和石油醚。补骨脂素(psoralen)对t细胞淋巴瘤细胞株的抑制作用及其机制目前尚不清楚。


技术实现要素：

4.本发明通过研究补骨脂素对人皮肤t细胞淋巴瘤细胞株的作用机制，得出补骨脂素对人皮肤t细胞淋巴瘤细胞具有促进凋亡作用；
5.补骨脂素在人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物中的应用；
6.优选的，所述补骨脂素通过激活人皮肤t细胞淋巴瘤细胞株hut-78细胞凋亡信号通路相关基因表达，促进hut-78的凋亡；
7.优选的，所述补骨脂素促进细胞caspase9的mrna表达，并可促进caspase3、fas/faslmrna的表达，下调bcl2mrna的表达。
8.本发明的有益效果是：
9.本发明补骨脂素促进人皮肤t细胞淋巴瘤细胞株hut-78细胞凋亡，可以将补骨脂素用于人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物，为人皮肤t细胞淋巴瘤治疗提供了新的思路。
附图说明
10.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
11.图1是补骨脂素(psoralen)对hut-78细胞增殖的抑制作用；其中a：不给药空白组；b：50μm、100μm、200μm、400μm补骨素均能显著抑制hut-78细胞的生长；
12.图2是不同浓度补骨脂素(psoralen)对hut-78细胞增殖和凋亡的影响(n＝8)；其
中a：不同浓度补骨脂素(psoralen)对对hut-78细胞增殖和凋亡的影响；b：补骨脂素(psoralen)抑制hut-78细胞增殖的ic50值曲线；
13.图3是psoralen(400μm)对hut-78细胞细胞凋亡信号通路基因表达的影响(n＝3)；a：psoralen对bcl2基因表达影响，b：psoralen对bax基因表达影响，c：psoralen对fas基因表达影响，d：psoralen对fasl基因表达影响；e:psoralen对caspase3基因表达影响；f：psoralen对caspase8基因表达影响；g：psoralen对caspase9基因表达影响。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例1
16.补骨脂素在人皮肤t细胞淋巴瘤治疗药物中的应用；
17.优选的，所述补骨脂素通过激活人皮肤t细胞淋巴瘤细胞株hut-78细胞凋亡信号通路相关基因表达，促进hut-78的凋亡；
18.优选的，所述补骨脂素促进细胞caspase9的mrna表达，并可促进caspase3、fas/faslmrna的表达，下调bcl2mrna的表达。
19.实施例2
20.验证补骨脂素对hut-78细胞凋亡及细胞凋亡相关基因表达情况实验；
21.1、材料：人皮肤t细胞淋巴瘤细胞株hut-78购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。补骨脂素(纯度》98％)购自中国食品药品监督研究院。rpmi-1640培养基(ginco)购自lifetechnology公司；胎牛血清(gibco)购自lifetechnology公司。cck-8试剂及rna提取试剂盒及逆转录试剂购自北京全式金生物技术(transgenbiotech)股份有限公司。rna扩增引物订购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
22.2、方法
23.1)hut-78细胞培养
24.hut-78细胞培养于含20％胎牛血清的rpmi-1640培养基(100u
·
ml-1
青霉素和100μg
·
ml-1
链霉素双抗)，37℃、5％co2培养箱中培养并继代；
25.2)细胞增殖与凋亡的测定
26.取对数生长期的hut-78细胞，按1.0
×
104个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板中培养过夜。实验分组如下：空白组(无药物处理)，药物处理组(分别用25，50，100，200，400μm补骨脂素预处理24h后)。处理结束后，96孔细胞培养板中每孔加入10μlcck-8检测试剂，分别测定其中各个药物处理组hut-78细胞的增殖和凋亡情况。
27.3)补骨脂素ic50的测定
28.取对数生长期的hut-78细胞，按1.0
×
104个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板中培养过夜。实验分组如下：空白组(无药物处理)，药物处理组(分别用25，50，100，200，400μm补骨脂素(psoralen)预处理24h后)。处理结束后，96孔细胞培养板中每孔加入10μl cck-8检测试剂。测定补骨脂素抑制hut-78细胞的增殖和凋亡的ic50值。
29.4)细胞凋亡相关基因表达分析
30.按照上述分组及药物处理方法处理细胞，处理结束后，trizol法提取rna，nanodrop蛋白核酸分析仪测定rna浓度。取2μg总rna，应用反转录试剂盒(thermo)逆转成cdna。将上述转录产物cdna，用ddh2o按1:5比例稀释后作为模板，根据全式金sybrgreen荧光定量试剂盒的操作说明对细胞中bcl2、bax、caspas3、caspase9、fas/fasl基因表达进行定量，内参基因选用gapdh。pcr反应条件如下：95℃预变性30sec后进行95℃5sec，60℃34sec共40个循环的扩增反应。
31.3、结果
32.1)补骨脂素(psoralen)对hut-78细胞增殖的抑制作用
33.如图1所示，与空白组相比，补骨脂素预处理24h后，25μm补骨素不能显著抑制hut-78细胞的生长，而50μm、100μm、200μm、400μm补骨素均能显著抑制hut-78细胞的生长(***p《0.001，**p《0.01,*p《0.05)。
34.2)补骨脂素药物在细胞水平对人淋巴瘤细胞株系hut-78细胞的细胞活力(cck-8)实验
35.实验结果表明：补骨脂素在细胞水平可以促进人t淋巴瘤细胞系hut-78细胞的凋亡，在药物浓度为50μm时就能显著抑制t淋巴瘤细胞系hut-78细胞的细胞活力，差异具有统计学意义(*p《0.05)，ic50值约为220.8μm，相关结果如图2所示。
36.3)补骨脂素(psoralen)对hut-78细胞凋亡相关基因表达的影响
37.研究表明，通过bcl2//bax/fas/fasl,caspase3/caspase8/caspase9信号通路，可以额诱导细胞的凋亡反应。和文献报道相一致，我们的研究结果表明(图2)，psoralen给药可以显著提高hut-78细胞中bcl2//bax/fas/fasl,caspase3/caspase8/caspase9的mrna表达。由此可知，psoralen可能通过调控bcl2//bax/fas/fasl,caspase3/caspase8/caspase9基因的表达，抑制了hut-78细胞的激活，进而促进了hut-78的凋亡。
38.引物序列如表1所示。如图2所示，与空白组相比，50μm补骨脂素(psoralen)能够显著促进细胞caspase9的mrna表达(p《0.05)，并表现出促进caspase3、fas/faslmrna表达的趋势，下调bcl2mrna表达的趋势，但对hut-78细胞bax的mrna水平无显著影响。
39.表1细胞凋亡相关基因引物名称和序列
[0040][0041]