一种柔性NO传感器及其制备方法

一种柔性no传感器及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种柔性no传感器及其制备方法，属于生物检测及医学检测技术领域。


背景技术：

2.一氧化氮(no)是一氧化氮合酶(nos)在生物系统中产生的一种高度不稳定的信号分子，在免疫、心血管和神经系统中发挥着重要的调节作用。在异常情况下，过量no被看作是一种促进炎症反应的标志，如no释放增加与软骨细胞死亡和骨关节炎(oa)有关。因此，no可能作为关节腔内早期诊断oa的生物标志物。前交叉韧带(acl)断裂是最常见的膝关节损伤之一，常见于运动员。据估计，在美国，每10万人中就有29人患有acl损伤，每年与治疗相关的费用高达5亿美元。acl撕裂及相关损伤被认为是导致创伤后软骨损伤和早期oa发病的原因，可能与膝关节机械负荷异常和炎症细胞因子上调有关。与传统的诊断技术(如影像学和对患者症状的医学评估)相比，这些通常发生在oa的后期阶段，实时评估关节腔内相关的生物标志物(如no)可以提示初始阶段的病理演变，因此可以为创伤性膝关节损伤后优化治疗提供必要信息。
3.先前的研究发现，acl撕裂导致no增加。然而，这些研究中提出的绝大多数技术都是基于比色法，这依赖于用传统的griess分析对亚硝酸盐等次生物种进行感知，而无法进行实时监测。其他直接捕获no的方法如电子顺磁共振光谱法、化学发光法、质谱法、荧光法等，其灵敏度不足，样品制备复杂，实验仪器昂贵，阻碍了连续检测。基于三电极结构的电化学传感器具有良好的灵敏度和选择性，现有技术中已经有灵活的物理瞬态电化学传感器，实现了对生物系统中的no进行实时检测。然而，由于电化学传感器的灵敏度往往依赖于电活性表面积，因此如何同时获得高灵敏度和高空间分辨率仍然是一个挑战。此外，电化学传感器的传感稳定性依赖于参考电极，可能需要定期重新校准，以确保理想的准确性。
4.具有信号放大能力的基于晶体管的器件有可能解决上述问题。已经有报道使用小型血红素功能化石墨烯场效应晶体管进行亚纳摩尔灵敏度的体外no检测。然而，对于如何在生物体内实现连续检测no的研究却很少。作为高性能传感器、有机电化学晶体管(oects)作为体内有前途的设备，对于关键生物标志物的检测具有高空间分辨率，加工简单、高灵敏度、良好的生物相容性和灵活性。与传统的fet不同，oects具有与电解质直接接触的活性通道。该通道的电导率是由栅极电压通过电化学反应来调节的，电化学反应决定离子从电解质注入通道改变其掺杂状态。由于掺杂过程发生在光离子通道的整个体积内，使电化学信号得以放大，从而显著提高了传感灵敏度。更有趣的是，与三电极电化学传感器相比，oects系统不需要参考电极和对电极，因此可以在不影响性能的情况下实现小型化。
5.聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)(pedot:pss)是一种典型的oects材料，由于pedot是p型掺杂(pedot

)，其中空穴作为载流子，pss的磺酸阴离子(pss-)可以认为是电离受体。基于pedot:pss的oects工作在耗尽模式，即通道电流在正栅极偏置时减小，并随着栅极电压的增加最终达到off状态，这是由于从电解质注入阳离子到通道，补偿pss的
400v，工作电流为0.03-0.09a，溅射速率为
27.发明的效果
28.本发明的柔性no传感器具有低响应极限，宽广的感应范围和优异的抗干扰性能。同时，具有优异的生物相容性和柔性，具有较小的物理尺寸，可以减少植入器件时造成的损伤，从而可以在生理条件下提供准确而稳定的no的实时监测，为多种疾病的诊断和治疗提供必要的诊断和治疗信息。
附图说明
29.图1柔性no传感器结构示意图；
30.图2柔性no传感器制备过程示意图；
31.图3传感器-i的傅里叶变换红外光谱测试图；
32.图4传感器-i的传感性能测试图；
33.图5传感器-i的抗干扰测试图；
34.图6传感器-i的柔性展示图，(a)器件向外弯曲，(b)器件向内拉伸；
35.图7传感器-i的稳定性能测试图；
36.图8传感器-i的生物相容性能测试图；
37.图9传感器-i对sd大鼠膝关节软骨细胞no释放行为的实时监测示意图：(a)电流信号(b)一氧化氮浓度信号；
38.图10传感器-i在哺乳动物骨关节腔的植入测试图。
39.图11传感器-i的晶体管性能测试结果图
40.图12传感器-对i的抗干扰测试图
具体实施方式
41.以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
42.本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
43.本说明书中，如没有特殊声明，则“多”、“多种”、“多个”等中的“多”表示2或以上的数值。
44.本说明书中，所述“基本上”、“大体上”或“实质上”表示于相关的完美标准或理论标准相比，误差在5％以下，或3％以下或1％以下。
45.本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
46.本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
47.本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
48.本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不
存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
49.本发明提供一种柔性no传感器，如图1所示，包括：
50.基底，所述基底由聚酰亚胺形成；
51.形成于所述基底上的晶体管电极，所述晶体管电极包括栅极，源极和漏极；
52.形成于所述基底上的有机沟道，所述有机沟道由聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)形成；
53.选择透过性薄膜，所述选择透过性薄膜至少部分地包覆在所述基底表面。
54.图1描述了本发明的柔性no传感器对no的探测机理，本发明的柔性no传感器包含栅极(gate)，漏极(drain)和源极(source)，如图1所示。当栅极施加一个恒定电位时，no会在传感器表面被氧化成为亚硝酰阳离子，这个法拉第电流产生的同时会增大电解质的电压，从而使得电解质中更多的阳离子嵌入有机沟道和pedot:pss完成掺杂，使得有机沟道的电导状态发生改变，导致沟道电流的改变的电压降和no浓度在一定范围内是呈线性关系的，因此可以通过探测响应电流的大小反推电压降来定量的分析no浓度的高低。具体反应过程如下：
55.no-e-→
no

ꢀꢀ
(1)
56.pedot

:pss- m

→
pedot0 m

:pss- h

ꢀꢀ
(2)
57.δv
g-eff
≈a
×
[analyte]
β
ꢀꢀ
(3)
[0058]
根据本发明所述的柔性no传感器，所述栅极、源极、漏极由铬层和金层，或者钛层和金层层叠构成。所述铬层的厚度为5-10nm，所述金层的厚度为80-100nm。
[0059]
采用层叠结构的电极中，cr层主要用作粘附层，提高金层与基底之间的粘附性，也可以用等同厚度的ti层代替。au层作为功能层，主要起到连接、探测no的作用。au电极对no的电化学氧化反应有一定的催化作用，且其电化学、机械性能稳定。适用上述电极结构，可以防止金属与基底粘附性不佳导致电极易脱落，同时防止所制备的传感器的灵敏度和稳定性的降低。
[0060]
根据本发明所述的柔性no传感器，所述有机沟道的厚度为80～150nm。
[0061]
根据本发明所述的柔性no传感器，所述选择透过性薄膜由聚5-氨基-1-萘酚(聚-5a1n)形成。将聚5-氨基-1-萘酚作为选择透过性薄膜形成在栅极的表面上，可以最小化由生物系统中的相关化学物质(例如葡萄糖，亚硝酸盐，尿酸等)引起的感应干扰。
[0062]
根据本发明所述的柔性no传感器，所述聚酰亚胺薄膜的厚度为100-200μm。根据本发明所述的柔性no传感器，其中，所述选择透过性薄膜的厚度为10-30nm。
[0063]
聚酰亚胺薄膜的厚度优选为50～150μm，选择透过性膜的厚度优选为10～30nm。聚酰亚胺薄膜厚度会决定最终器件的柔性，越薄器件柔性越好。选择透过性膜如果太薄起不到尺寸筛选大分子(如ua、aa等)的作用，太厚则会降低传感器灵敏度。
[0064]
本发明还提供一种根据本发明所述的柔性no传感器的制备方法，如图2所示，其包括如下步骤：
[0065]
由聚酰亚胺形成基底，例如，可以将聚酰亚胺薄膜贴附在涂有聚二甲基硅氧烷的玻璃片上，形成基底；
[0066]
所述基底经磁控溅射和光刻形成栅极、源极、漏极；优选地，磁控溅射形成栅极、源
极、漏极时，溅射电压为350-400v，工作电流为0.03-0.09a，溅射速率为
[0067]
将聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)涂覆至所述基底之上，退火，然后通过光刻和反应离子刻蚀形成有机沟道，优选地，采用旋涂将聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)涂覆至所述基底之上，优选地，旋涂分两步进行，第一步旋涂转速为500-600rpm，旋涂时间为6-9s，第二步旋涂转速为2000-3500rpm，旋涂时间为30-40s，退火温度为120-150摄氏度，退火时间为30-60min，最优选地，第一步旋涂转速为600rpm，旋涂时间为6s，第二步旋涂转速为2500rpm，旋涂时间为30s，退火温度为120摄氏度，退火时间为60min。
[0068]
对于光刻和反应离子刻蚀并没有特别限制，只要能够得到所需的形貌即可，特别优选地，在90mtorr压力下，100sccm o2，5sccm sf6，功率100w下反应离子刻蚀100～150s，最优选120s。
[0069]
光刻和反应离子刻蚀，将带有栅极、源极、漏极和有机沟道的基底进行封装，封装层的材料并无特别限制，例如采用su-8 3005光刻胶，厚度范围是5～30μm。
[0070]
将带有栅极、源极、漏极和有机沟道的基底浸入电化学聚合原料溶液中，通过电化学聚合形成选择透过性薄膜，得到柔性no传感器。例如，可以将聚酰亚胺薄膜从玻璃基板上机械剥离，得到柔性no传感器。
[0071]
根据本发明所述的制备方法，所述电化学聚合原料溶液为5-氨基-1-萘酚溶液，5-氨基-1-萘酚的浓度为5～10mm。优选地，将5-氨基-1-萘酚溶于ph＝1的溶液中，将该混合溶液作为电解质溶液，使用pt作为对电极，ag/agcl作为参比电极，使用电化学工作站cv功能进行聚合，其中扫描电压范围为0～0.1v，扫描速率15-25mv
·
s-1
，扫描5-10个循环。其中，5-氨基-1-萘酚溶液的浓度为5～10mm，当5-氨基-1-萘酚溶液的浓度在上述范围内时，器件具有较好的响应电流和抗干扰能力。
[0072]
实施例
[0073]
实施例1
[0074]
将聚酰亚胺薄膜(厚度为125μm)贴附在涂有聚二甲基硅氧烷的玻璃片上，形成基底；
[0075]
使用铬(cr)，金(au)的溅射靶材经磁控溅射和光刻形成电极，包括栅极、对电极和参比电极，溅射电压为380v，工作电流为0.06a，溅射速率为经台阶仪测试表明，所述电极的厚度约为铬5nm，金80nm；
[0076]
将聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)旋涂在基底上退火后经过光刻和反应离子刻蚀形成有机沟道，优选地，旋涂参数为600rpm/2500rpm，6s/30s，退火温度为120摄氏度，退火时间为1h；经台阶仪测试表明，所述有机沟道的厚度约为180nm；反应离子刻蚀的参数为：压力90mtorr压力，气体流量为100sccm o2，5sccm sf6，功率100w，持续120s，之后进行封装；
[0077]
将带有电极和有机沟道的基底浸入电化学聚合原料溶液中，溶液中5-氨基-1-萘酚的浓度为5mm，通过电化学聚合形成选择透过性薄膜，其中，使用pt作为对电极，ag/agcl作为参比电极，使用电化学工作站cv功能进行聚合，扫描电压范围为0～0.1v，扫描速率20mv
·
s-1
，扫描5个循环。经台阶仪测试表明，选择透过性薄膜的厚度约为22nm；
[0078]
将聚酰亚胺薄膜从玻璃基板上机械剥离，得到柔性no传感器，记为传感器-i。
[0079]
比较例1
[0080]
除了不形成选择透过性薄膜外，与实施例1采用相同的方法制备得到柔性no传感器，记为传感器-对i。
[0081]
传感器-对i(即不施用选择性薄膜)的器件的抗干扰效果如图12所示。
[0082]
性能测试
[0083]
傅里叶变换红外光谱测试
[0084]
将传感器-对i以及传感器-i采用德国耐驰公司测试仪(x70)进行傅里叶变换红外光谱测试，结果如图3所示。
[0085]
通过图3可以看出，施镀选择透过性薄膜后的传感器-i的电极表面展现出包含有5-氨基-1-萘酚的特征官能团，说明5-氨基-1-萘酚已经成功聚合于电极表面。
[0086]
晶体管性能测试
[0087]
传感器-i的晶体管性能测试结果如图11所示，其中a为晶体管的输出特性曲线，b为转移特性曲线。
[0088]
传感性能测试
[0089]
用半导体分析仪在pbs溶液中完成测试，测试时，栅压固定为1.0v，源漏极电压固定为-0.2v。通过持续在pbs溶液中滴加不同量的no标准溶液得到不同no浓度溶液和与其相对应的响应电流，结果如图4所示。
[0090]
通过图4可以看出，制备的器件具有良好的有机电化学性能，具备稳定的输出特性曲线和转移特性曲线。在栅极电压为1.0v时，晶体管具有最大的跨导，说明在该电压下晶体管的信号放大性能最佳，该电压也是一氧化氮发生电化学氧化电压，说明所制备的器件能有效检测一氧化氮。
[0091]
抗干扰测试
[0092]
采用葡萄糖(glu)，亚硝酸钠(nitrite)，硝酸钠(nitrate)，抗坏血酸(aa)和尿酸(ua)作为比对物质，对传感器-i进行抗干扰测试，使用生物系统中常见的干扰物质，包括葡萄糖(glucose)、亚硝酸钠(亚硝酸盐)、硝酸钠(硝酸盐)、硝酸钠(nano3)、抗坏血酸(aa)和尿酸(ua)来测试传感器-i的选择性和特异性，采用半导体分析仪在pbs溶液中完成测试。在选择性试验中，在pbs中依次加入no和干扰剂(葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸钠、抗坏血酸和尿酸)，并记录响应电流。no和干扰剂的浓度分别为0.1mm和0.5mm，通过计算归一化电流响应来比较传感器的抗干扰性能，具体如下：
[0093][0094]
其中，是加入分析物之后的电流大小，是未加入分析物的电流大小，结果如图5所示。
[0095]
柔性测试
[0096]
如图6所示，传感器-i具有良好的弯曲能力。
[0097]
稳定性测试
[0098]
稳定性测试即在5日后、10日后重复传感性能测试。具体测试方法与前述方法相同，结果如图7所示，说明所制备的器件具有良好的稳定性。
[0099]
生物相容性测试
[0100]
为了研究传感器的生物相容性，将传感器-i与小鼠上皮样成纤维细胞(l929 cells)共同培养5天，并观察细胞增殖荧光图像和相应的光学显微镜图像。这里的实验组是和传感器-i共同培养的小鼠上皮样成纤维细胞，对照组为无传感器-i且其余培养条件均和实验组保持一致的小鼠上皮样成纤维细胞。
[0101]
对于体内植入器件来说，良好的生物相容性可以有效减少排异反应和炎症反应，减少患者痛苦，促进伤口愈合，是器件正常工作和安全植入的重要保证。将小鼠上皮样成纤维细胞与器件共培养，通过细胞增殖情况和细胞活性测试可以有效科学的判断植入器件的生物相容性。图8展示了传感器-i的细胞共培养荧光图片，可以看到，随着培养天数的增加，细胞增殖明显，且增殖情况与对照组无明显差别，结果说明no传感器具有良好的生物相容性
[0102]
sd大鼠膝关节软骨细胞no释放行为的实时监测
[0103]
对软骨细胞产生的no进行实时检测的体外传感性能评估测试，nos将l-精氨酸转化为no，il-1β和l-name分别作为nos的刺激剂和抑制剂。软骨细胞与炎症细胞因子il-1β(10ng ml-1)
在pbs中37℃培养，以模拟骨关节炎的情况。如图9(a)所示，在l-arg(5mm)引入后(t＝2h)(a组)，传感器-i的漏极电流显著下降，并持续逐渐下降约5h，然后逐渐恢复到初始状态。相比之下，在添加l-name(10mm)和l-arg(5mm)的软骨细胞(b组)或未添加l-arg和l-name的软骨细胞(c组)，漏极电流的变化可以忽略不计(图9(b)和(c))，no浓度的相应变化如图9所示。
[0104]
哺乳动物骨关节腔的植入测试
[0105]
在新西兰大白兔关节腔两侧植入传感器-i，经皮连接到用手术胶带固定在兔大腿上的无线电路。装置植入前，一侧后肢行acl横断术(实验组)，另一侧不手术(对照组)。关节腔中捕获的传感器-i的典型归一化传递曲线和导出的跨导与pbs中获取的跨导一致，表明传感器-i在生物环境中的鲁棒性能。连续进行no检测实现超过8天，每天10分钟的周期。图10给出了器件在0、2、4、6、8天的记录信号，总结了由校准曲线转换后对应的no浓度。与对照组相比，实验组的no浓度在监测期间保持在较高水平，对照组显示出相对较低的no生成，并呈下降趋势。