一种抗菌复合材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及材料领域，具体涉及一种抗菌复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.严重开放性骨折、骨科术后感染、急慢性骨髓炎所导致的感染性骨缺损的修复重建已成为临床医生面临的巨大挑战，常需要多次手术，早期局部抗生素的应用能有效减少开放伤骨感染，抗菌人工骨支架材料有望用于治疗感染性骨缺损。将抗菌性药物与载体结合的药物控释系统是有效解决骨感染难题的选择之一，药物控释系统可以在植入部位直接或间接地促进药物的延长释放，除了持续和可控的给药外，这些给药载体还可以保护活性因子和蛋白质分子免于解离或失活，提高整体生物利用度和临床疗效。与全身用药相比，局部给药降低了血浆药物浓度，从而避免了一些不良反应或一般毒性；而且靶向骨感染部位的局部给药载体通常具有一定的骨诱导活性，结合抗菌性药物和骨修复材料的局部给药系统在骨感染治疗中表现出显著的优势。
3.研究表明纳米银颗粒对数十种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，无耐药性，无细胞毒性，能够促进伤口的愈合。金属离子如银离子对细菌的影响是多方面的，它们通过改变正常生物膜内外的极化状态形成新的细胞内外离子浓度差，阻碍或破坏维持细胞生理功能的小分子和大分子物质的运输。一些金属离子如银离子也可以进入微生物细胞内，使大多数酶失活，发挥抗菌效能。但是，当金属离子如银离子的浓度过高时，会造成生物毒性。因此，需要生物材料作为银的载体材料，使之缓慢释放阴离子，在抗菌的同时不造成生物毒性。纳米介孔硅基材料表面含有许多纳米级微孔结构，具有庞大的比表面积和多微孔结构，具有很高的活性。介孔硅基材料具有优良的吸附性能，是一种理想的无机抗菌剂载体。用传统的沉淀法制备的纳米银材料，粒度大且尺寸分布较宽，影响其抗菌性能的高效性。
4.海藻酸是一类自然界普遍存在的多糖类物质，来源广泛，价格便宜，具备良好的生物相容性，广泛应用于新型生物材料的研发中，如细胞载体、受伤组织修复材料、生物活性物质的释放载体等。海藻酸盐能与多种二价阳离子通过静电相互作用构成离子交联型水凝胶。但离子交联型水凝胶材料存在一个缺点即能与多种一价阳离子发生离子交换反应，使其失去凝胶特性。因此，材料的稳定性有待提高。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种抗菌复合材料。
6.本发明的目的之二在于提供一种抗菌复合材料的制备方法。
7.本发明的目的之三在于提供一种骨支架材料。
8.本发明的目的之四在于提供一种抗菌复合材料在组织修复材料或再生材料中的应用。
9.本发明的目的之五在于提供一种抗菌复合材料在制备治疗骨科疾病的药物或材料中的应用。
10.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一个方面在于提供一种抗菌复合材料，由包括负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶的原料制得；所述负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶和负载纳米银的聚乙二醇形成半互穿网络结构；所述交联海藻酸盐凝胶为海藻酸盐经交联反应制得。本发明中的“半互穿网络结构”是指负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶和负载纳米银的聚乙二醇形成的互穿网络结构中，负载纳米银的聚乙烯醇为线性非交联的，负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶是交联的。
12.优选地，所述活性因子包括骨形态发生蛋白、白介素-4、血管内皮生长因子、阿仑膦酸钠、地塞米松、柚皮甙、白藜芦醇中的至少一种；进一步优选地，所述活性因子包括骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、地塞米松、白藜芦醇中的至少一种。
13.优选地，所述骨形态发生蛋白包括骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-7。
14.优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇为核壳结构，聚乙二醇为壳，纳米银为核。
15.优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇的粒径为10～80nm。
16.优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为100～30000da；进一步优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为200～20000da；再进一步优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为400～10000da；更进一步优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为1000～10000da；更优选地，所述聚乙二醇的数均分子量为200da、400da、600da、800da、1000da、2000da、4000da、10000da或20000da。
17.优选地，每1mg抗菌复合材料中，纳米银的负载量为0.005～0.1mg。
18.优选地，每1g抗菌复合材料中，活性因子的负载量为0.01～0.1mg。
19.优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶的质量比为(0.2～2):1。
20.优选地，每1mg抗菌复合材料中，纳米银的负载量为0.01～0.1mg；进一步优选地，每1mg抗菌复合材料中，纳米银的负载量为0.03～0.1mg；再进一步优选地，每1mg抗菌复合材料中，纳米银的负载量为0.05～0.1mg。
21.优选地，每1g抗菌复合材料中，活性因子的负载量为0.02～0.08mg；进一步优选地，每1g抗菌复合材料中，活性因子的负载量为0.04～0.08mg；再进一步优选地，每1g抗菌复合材料中，活性因子的负载量为0.05～0.07mg。
22.优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶的质量比为(0.5～2):1；进一步优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶的质量比为(1～2):1；再进一步优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的交联海藻酸盐凝胶的质量比为(1～1.5):1。
23.优选地，所述交联反应为：在碳二亚胺存在下使海藻酸盐与胱胺交联。
24.本发明的第二个方面在于提供本发明第一个方面提供的抗菌复合材料的制备方法，包括以下步骤：
25.s1：制备负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的海藻酸盐；
26.s2：将负载纳米银的聚乙二醇和负载活性因子的海藻酸盐混合，然后使负载活性
因子的海藻酸盐进行交联反应，制得所述抗菌复合材料。
27.优选地，所述步骤s2中的混合步骤包括机械搅拌混合、超声混合中的至少一种。
28.优选地，所述机械搅拌混合的搅拌速度为100～2000rpm；进一步优选地，所述机械搅拌混合的搅拌速度为200～1200rpm。
29.优选地，所述机械搅拌混合的搅拌时间为5～60min；进一步优选地，所述机械搅拌混合的搅拌时间为10～40min；再进一步优选地，所述机械搅拌混合的搅拌时间为10～25min。
30.优选地，所述超声混合的超声波频率为10～30khz；进一步优选地，所述超声混合的超声波频率为15～25khz；再进一步优选地，所述超声混合的超声波频率为20～25khz。
31.优选地，所述超声混合的超声波功率为100～1000w；进一步优选地，所述超声混合的超声波功率为200～1000w；再进一步优选地，所述超声混合的超声波功率为200～800w。
32.优选地，所述超声混合的时间为5～60min；进一步优选地，所述超声混合的时间为10～40min；再进一步优选地，所述超声混合的时间为10～30min。
33.优选地，所述制备负载活性因子的海藻酸盐具体为：将活性因子与海藻酸盐混合制得。
34.优选地，所述海藻酸盐为海藻酸一价金属盐。
35.优选地，所述海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾中的至少一种。
36.优选地，所述制备负载纳米银的聚乙二醇的步骤具体为：将纳米银源与聚乙二醇混合反应制得；进一步优选地，所述制备负载纳米银的聚乙二醇的步骤具体为：将纳米银源与聚乙二醇溶液混合反应12～24h制得；再进一步优选地，所述制备负载纳米银的聚乙二醇的步骤具体为：将纳米银源与聚乙二醇溶液在避光、15～35℃条件下混合反应12～24h制得。
37.优选地，所述纳米银源为硝酸银。
38.优选地，所述聚乙二醇的粒径为10～20nm。
39.优选地，所述聚乙二醇水溶液的浓度为0.02～0.06g/ml；进一步优选地，所述聚乙二醇水溶液的浓度为0.03～0.05g/ml；再进一步优选地，所述聚乙二醇水溶液的浓度为0.04～0.05g/ml。
40.优选地，所述纳米银源与聚乙二醇水溶液的质量体积比为(0.003～0.01)：1g/ml；进一步优选地，所述纳米银源与聚乙二醇水溶液的质量体积比为(0.005～0.01)：1g/ml；再进一步优选地，所述纳米银源与聚乙二醇水溶液的质量体积比为(0.008～0.01)：1g/ml。
41.优选地，所述步骤s2具体为：将负载活性因子的海藻酸盐缓慢溶解在负载纳米银的聚乙二醇溶液中，然后使负载活性因子的海藻酸盐进行交联反应，制得所述抗菌复合材料。
42.优选地，所述步骤s2中的交联反应具体为：使负载活性因子的海藻酸盐与碳二亚胺混合反应，然后与胱胺交联。在水溶性的碳二亚胺的活化作用下，海藻酸盐中的羧基与胱胺中的氨基发生酰胺化反应，形成化学交联的海藻酸盐水凝胶。活性因子负载在交联海藻酸盐凝胶中，交联海藻酸盐凝胶网络中存在线型的聚乙二醇，从而形成半互穿网络结构。
43.优选地，所述负载活性因子的海藻酸盐与碳二亚胺混合反应时间为20～80min；进一步优选地，所述负载活性因子的海藻酸盐与碳二亚胺混合反应时间为30～70min；再进一
步优选地，所述负载活性因子的海藻酸盐与碳二亚胺混合反应时间为40～60min。
44.优选地，所述碳二亚胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(1～5):1；进一步优选地，所述碳二亚胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(1～4):1；再进一步优选地，所述碳二亚胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(2～3):1。
45.优选地，所述胱胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(0.5～3):1；进一步优选地，所述胱胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(1～3):1；再进一步优选地，所述胱胺与负载活性因子的海藻酸盐的质量比为(2～3):1。
46.优选地，所述胱胺与负载活性因子的海藻酸盐的交联时间为0.5～2h；进一步优选地，所述胱胺与负载活性因子的海藻酸盐的交联时间为1～2h。
47.优选地，所述海藻酸盐和负载纳米银的聚乙二醇溶液的质量体积比为(0.02～0.08)：1g/ml；进一步优选地，所述海藻酸盐和负载纳米银的聚乙二醇溶液的质量体积比为(0.03～0.06)：1g/ml；再进一步优选地，所述海藻酸盐和负载纳米银的聚乙二醇溶液的质量体积比为(0.04～0.06)：1g/ml。
48.优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇溶液的ph为4.5～6；进一步优选地，所述负载纳米银的聚乙二醇溶液的ph为5～6。
49.本发明的第三个方面在于提供一种骨支架材料，包括本发明第一个方面提供的抗菌复合材料。
50.本发明的第四个方面在于提供本发明第一个方面提供的抗菌复合材料在组织修复材料或再生材料中的应用。
51.本发明的第五个方面在于提供本发明第一个方面提供的抗菌复合材料在制备治疗骨科疾病的药物或材料中的应用。
52.本发明的有益效果是：本发明中的抗菌复合材料通过聚乙二醇包覆纳米银，聚乙二醇与交联海藻酸盐凝胶之间形成半互穿网络结构，可以实现银离子的缓释，银离子的释放周期及抑菌效果可达21天以上，更适用于存在细菌感染下的组织修复与重建的应用。本发明中的聚乙二醇一方面作为纳米银的载体材料，起到稳定纳米银胶体的作用，可获得粒径分布为10～80nm且分散均匀的负载纳米银的聚乙二醇；另一方面聚乙二醇与交联的海藻酸盐凝胶形成半互穿网络，增强海藻酸盐的机械强度。
53.本发明中的抗菌复合材料中的交联海藻酸盐凝胶中含有二硫键，具有氧化还原降解特性，随着交联海藻酸盐凝胶的缓慢降解，纳米银被缓释，从而实现长效抗菌效果。
54.此外，本发明中的制备方法工艺简单，对设备的要求不高，原料均已产业化、来源易得，成本低廉，易于实现产业化。
附图说明
55.图1为实施例1～5和对比例1中的复合材料的细胞增殖测试图。
56.图2为本发明实施例1～5和对比例1中的复合材料的体外银离子释放曲线图。
57.图3为实施例1～5和对比例1～3中的复合材料的体外诱导前成骨细胞成骨分化测试图。
58.图4为本发明实施例1～5和对比例1～3中的复合材料的压缩强度测试图。
具体实施方式
59.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
60.原料信息：
61.骨形态发生蛋白2可以购买自sigma、gibco、invitrogen、碧云天、赛业、艾美捷等公司；
62.血管内皮生长因子可以购买自sigma、gibco、invitrogen、碧云天、赛业、艾美捷等公司；
63.骨形态发生蛋白7可以购买自sigma、gibco、invitrogen、碧云天、赛业、艾美捷等公司。
64.实施例1
65.本例中的抗菌复合材料采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
66.将50mg硝酸银缓慢溶解在10ml 0.05g/ml的聚乙二醇(数均分子量为2000da)水溶液中，避光、室温条件下搅拌反应12h，得到纳米银/聚乙二醇溶液。采用乙酸将纳米银/聚乙二醇溶液的ph值调至5，加入20ml含500mg海藻酸钠和50μg骨形态发生蛋白2(bmp-2)的水溶液，机械分散20min(转速为500rpm)；加入2g水溶性碳二亚胺，反应60min；再加入1.5g胱胺溶液，反应0.5h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
67.实施例2
68.本例中的抗菌复合材料采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
69.将80mg硝酸银缓慢溶解在10ml 0.05g/ml的聚乙二醇(数均分子量为600da)水溶液中，避光、室温条件下搅拌反应16h，得到纳米银/聚乙二醇溶液。采用乙酸将纳米银/聚乙二醇溶液的ph值调至4.5，加入30ml的含400mg海藻酸钠和20μg血管内皮生长因子的水溶液，超声分散30min(超声条件为：20khz，800w)；加入1.2g水溶性碳二亚胺，反应30min；再加入0.2g胱胺溶液，反应2h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
70.实施例3
71.本例中的抗菌复合材料采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
72.将40mg硝酸银缓慢溶解在10ml 0.02g/ml的聚乙二醇(数均分子量为10000da)水溶液中，避光、室温条件下搅拌反应18h，得到纳米银/聚乙二醇溶液。采用乙酸将纳米银/聚乙二醇溶液的ph值调至4.5，加入25ml的含200mg海藻酸钠和35μg骨形态发生蛋白7的水溶液，机械分散10min(转速为1200rpm)；加入1g水溶性碳二亚胺，反应20min；再加入0.4g胱胺溶液，反应2h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
73.实施例4
74.本例中的抗菌复合材料采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
75.将100mg硝酸银缓慢溶解在10ml 0.06g/ml的聚乙二醇(数均分子量为200da)水溶液中，避光、室温条件下搅拌反应20h，得到纳米银/聚乙二醇溶液。采用乙酸将纳米银/聚乙二醇溶液的ph值调至6，加入50ml的含800mg海藻酸钠和50μg地塞米松的水溶液，超声分散10min(超声条件为25khz，200w)；加入0.8g水溶性碳二亚胺，反应80min；加入1.2g胱胺溶
液，反应1.5h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
76.实施例5
77.本例中的抗菌复合材料采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
78.将60mg硝酸银缓慢溶解在10ml 0.03g/ml的聚乙二醇(数均分子量为4000da)水溶液中，避光、室温条件下搅拌反应24h，得到纳米银/聚乙二醇溶液。采用乙酸将纳米银/聚乙二醇溶液的ph值调至5，加入30ml含600mg海藻酸钠和100μg白藜芦醇的水溶液，机械分散25min(转速为200rpm)；加入1.2g水溶性碳二亚胺，反应40min；再加入0.48g胱胺溶液，反应1h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
79.对比例1
80.本例中的抗菌复合材料与实施例1相比，区别之处在于：在制备纳米银时不使用聚乙二醇。本例采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
81.将50mg硝酸银、500mg海藻酸钠溶解于含50μg骨形态发生蛋白2的10ml水中，采用乙酸将溶液的ph值调至5，机械分散20min(转速为500rpm)；加入2g水溶性碳二亚胺，反应60min；加入1.5g胱胺溶液，反应0.5h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的抗菌复合材料。
82.对比例2
83.本例中的复合材料与实施例2相比，区别之处在于：不使用硝酸银。本例采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
84.配制10ml 0.05g/ml的聚乙二醇2000水溶液，避光、室温条件下搅拌反应12h，采用乙酸将溶液的ph值调至5，加入20ml含500mg海藻酸钠和50μg骨形态发生蛋白2的水溶液，机械分散20min(转速为500rpm)；加入2g水溶性碳二亚胺，反应60min；再加入1.5g胱胺溶液，反应0.5h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的复合材料。
85.对比例3
86.本例中的复合材料与实施例2相比，区别之处在于：不使用聚乙二醇和硝酸银。本例采用以下制备方法制得，具体包括以下步骤：
87.将500mg海藻酸钠溶解于含50μg的骨形态发生蛋白2的10ml水中，采用乙酸将溶液的ph值调至5，机械分散20min(转速为500rpm)；加入2g水溶性碳二亚胺，反应60min；再加入1.5g胱胺溶液，反应0.5h。反应后，对产物进行过滤、洗涤，获得本例中的复合材料。
88.性能测试：
89.将实施例1-5和对比例1-3中制备得到的复合材料进行如下性能测试。
90.(1)体外细胞毒性评价
91.取实施例1-5和对比例1-3中制备得到的复合材料，按gb/t 16886.5-2017的要求进行评价和计分。实验结果如下表1所示：
92.表1实施例1～5及对比例1～3中制备得到的复合材料的体外细胞毒性测试结果
[0093] 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5对比例1对比例2对比例3计分00000000
[0094]
由表1可知，本发明实施例1～5中制得的抗菌复合材料安全性高，无细胞毒性，可以适用于人体骨修复。
[0095]
(2)材料细胞增殖测试
[0096]
选用l929小鼠成纤维细胞(来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞库)进行细胞增殖试验。设置空白组(l929细胞)，实施例组(实施例1～5中的复合材料、l929细胞)，对比例组(对比例1中的材料、l929细胞)。37℃下，分别将实施例1～5中的复合材料和对比例1中的材料浸没在培养基中过夜，种植细胞浓度为2.5
×
109个细胞/l的l929细胞20μl(达到5
×
104细胞/孔)，平行数为5，分别培养1d，3d，7d后将培养基从培养板移除。用pbs冲洗3遍，每个孔加入400μl的培养基，然后在无光下再添加100μl的5g/l的mtt/pbs溶液(mtt为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，pbs溶液为磷酸缓冲盐溶液)。用铝箔将培养板裹紧，37℃下孵化4h；用移液管移除培养基和mtt，每个孔添加200μl二甲基亚砜，混合几分钟；从每个孔移除100μl混合液，加入96孔板中；在490nm波长下，用elisa(酶联接免疫吸附剂测定)试剂盒对孔板的溶液进行检测，记录吸光度值，具体测试结果如图1所示。
[0097]
从图1可知，随时间的延长，空白组、实施例1～5组和对比例1组的吸光度值均不断增大，且实施例1～5组比空白组增大更快，到第七天时实施例1～5组的吸光度值明显超过空白组和对照1组，表明了实施例1～5中的复合材料中引入纳米银颗粒对小鼠成纤维细胞的生长无明显影响，且能促进小鼠成纤维细胞的增殖。而对比例1组由于没有用聚乙二醇包裹纳米银，导致纳米银浓度过大，抑制了小鼠成纤维细胞的增殖。
[0098]
(3)体外银离子释放性能检测
[0099]
将实施例1～5和对比例1中制备得到的复合材料进行体外溶质释放评价。评价方法具体为：
[0100]
(1)首先分别精密称取2mg实施例1～5和对比例1中制备得到的复合材料至离心管中，加入pbs缓冲液至总体积为5ml，密封后，保持温度在37
±
1℃，100rpm下置于摇床中振摇。
[0101]
(2)隔一段时间点，停止振摇，将释放介质经微孔滤膜过滤，测定释放的银离子浓度，根据投入的银离子量及取样的体积可计算出此时银离子释放的百分比。
[0102]
(3)往沉淀中加入新鲜pbs缓冲液至总体积为5ml，继续按第一步条件振摇，然后重复进行2-3步。
[0103]
(4)释放总时间为21天，最后根据时间和累积释放百分比得到银离子释放曲线。
[0104]
按照上述方法测得的实施例1～5和对比例1中制备得到的复合材料体外银离子释放曲线图如图2所示，由图2可知，本发明中的抗菌复合材料的体外银离子释放周期可达21天以上，且在释放21天时，累计释放率不超过90％。
[0105]
(4)抗菌性能检测
[0106]
取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的斜面新鲜培养物，将菌液进行活菌计数，并用稀释液(含1％蛋白胨的0.03mol/l pbs(ph＝7.2～7.4))配制成含菌量为10
×
106cfu/ml的菌悬液。将实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料分别放入无菌平皿中，加菌悬液50μl于各材料上并记录各管加菌时间，同时将实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料放入5ml营养肉汤管内。于加菌后60min将菌悬液接种血平板培养基，作为对照，血平板培养基中不含有实施例1～5和对比例1～3中的复合材料。将接种细菌的血平板培养基及肉汤管均放入37℃培养48h，观察初步结果，在无菌生长管继续培养至第21天。若肉汤管浑浊及血平板有菌生长，记为阳性，以( )表示；如第21天仍澄清，视为无菌生长，以(
–
)表示；具
体测试结果如下表2所示：
[0107]
表2实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料的抗菌性能检测结果
[0108][0109]
由上表2可知，本发明中的抗菌复合材料具有长效抗菌效果，抗菌时间不少于21天。由图2和表2可知，实施例1与对比例1都是基于装载银离子的海藻酸盐。其中，实施例1在制备抗菌复合材料的过程中，使用聚乙二醇制备纳米银，对比例1则不使用聚乙二醇。在没有聚乙二醇预装载纳米银以及作为抗菌复合材料半互穿网络载主要成分的情况下，海藻酸盐中的银离子在24h内便释放出去，也达不到长效的抗菌效果。与实施例1相比，对比例2和3均不装载银离子，它们都没有杀菌效果。
[0110]
(5)体外诱导前成骨细胞成骨分化性能检测
[0111]
将实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料辐照灭菌后按照10mg/ml的浓度浸泡在dmem基础培养基内，放入37℃摇床内120rpm浸提24h。浸提完成后将复合材料和培养基的混合物1000rpm离心后收集上清。将收集的浸提液分别用相应的dmem培养基稀释2倍，最后添加10％胎牛血清得到条件培养基。
[0112]
将mc3t3-e1细胞按照每孔1
×
105个的密度接种于24孔板，贴壁培养24h后分别更换条件培养基，在温度为37℃且5％二氧化碳气氛下的培养箱中培养。培养基每2-3d更换一次，培养7天后，mc3t3-e1细胞的成骨分化性能通过其分泌的碱性磷酸酶检测，利用pnpp法进行测定，具体步骤如下：细胞用pbs溶液洗涤后，浸没于含有0.1mol/l甘氨酸、1mmol/l氯化镁以及0.05％曲拉通x-100(辛苯昔醇)的pbs溶液。待细胞溶解后，将溶解液与对硝基苯磷酸二钠盐均匀混合，将混合液置于37℃下放置30min。随后，将混合液滴加到96孔板，用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸光值。
[0113]
碱性磷酸酶活性单位的定义：在ph9.8的二乙醇胺(dea)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸酯(para-nitrophenyl phosphate)显色底物产生1微摩尔对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个dea酶活力单位。在ph9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸酯显色底物产生1微摩尔对硝基苯酚所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，也被称作一个glycine酶活力单位。一个glycine酶活力单位约相当于3个dea酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性并分别做图，具体如图3所示。
[0114]
由图3可以看出，本发明实施例1～5中的抗菌复合材料都有较好的诱导细胞分泌碱性磷酸酶的效果，但对比例1在不使用聚乙二醇预装载纳米银以及作为抗菌复合材料半互穿网络载主要成分的情况下，抗菌复合材料浸提液中的银离子浓度较高，对细胞活性有不利的影响，因此也影响了细胞分泌碱性磷酸酶。此外，实施例2中含有血管内皮生长因子，有利于血管组织的再生，而新生血管组织有利于组织修复，但血管内皮生长因子在体外诱导前成骨细胞成骨分化性能方面的效果劣于实施例1和实施例3～4。
[0115]
(6)复合材料的力学性能检测
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利用万能材料试验机对实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料的力学性能进行了测定。在测试之前需要先制备测试试样：将实施例1～5和对比例1～3中制备得到的复合材料制备成高20mm，底面直径22mm的圆柱体，具体测试结果如图4所示。
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由图4可知，实施例1～5中的抗菌复合材料都有较好的压缩强度，但对比例1不使用聚乙二醇作为抗菌复合材料半互穿网络载主要成分，所制得的抗菌复合材料的压缩强度较低。
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上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。