一种蛋白磷脂纳米制剂、应用及其制备方法

1.本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种蛋白磷脂纳米制剂、应用及其制备方法。


背景技术：

2.中枢神经系统(cns)疾病严重影响着人类健康，例如，神经退行性疾病(如阿兹海默病、帕金森疾病)、脑膜炎、脑部肿瘤(如胶质母神经瘤、中枢神经淋巴瘤等)。
3.阿尔茨海默病(ad)是一种最常见的神经退行性疾病，大约10-12％的65岁及以上人口被ad影响着。2021年召开的aaic国际会议发布多项报告数据(world alzheimer report 2021)，预计到2050年痴呆患者总数将达1.52亿人，其中约60-70％为阿尔茨海默病患者。我国目前有1000万阿尔茨海默病患者，数量已居全球之首，预计到2050年还可能爆发至4000万人。随着中国人口老龄化，阿尔茨海默病以及其他形式的痴呆症和主要神经认知障碍正在急剧增加。并且目前中国65岁以上的帕金森疾病(pd)患病率大约为1.7％。
4.血脑屏障(bbb)严重限制了中枢神经系统(cns)疾病(例如，神经退行性疾病、脑瘤、脑部感染和中风)的治疗，因为它阻止了98％的小分子药物和大分子(例如，肽、基因药物和蛋白质药物)进入大脑。
5.因此针对目前中枢神经系统(cns)疾病的瓶颈，亟需开发一种能高效通过血脑屏障、且兼具高脑靶向性、安全无毒、有效防治早期神经退行性疾病等功能的蛋白体系。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明提供一种蛋白磷脂纳米制剂，为基于apoa1蛋白和磷脂相结合的蛋白磷脂复合物；
7.其中，所述apoa1蛋白为不含有如seq id no.1所示的保守序列或所述保守序列的同源序列的apoa1蛋白。
8.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列包括：
9.如seq id no.2所示的第1氨基酸序列和如seq id no.3所示的第2氨基酸序列中的一种或两种组合。
10.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列还包括：
11.如seq id no.3所示的第3氨基酸序列。
12.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列的排列顺序为所述第1氨基酸序列、所述第2氨基酸序列和所述第3氨基酸序列依次排列。
13.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的每个纳米颗粒的直径为5-130nm。
14.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的每个纳米颗粒的内部嵌入的磷脂数量为100-1000个。
15.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂在制备用于预防和/或治疗早期神经退行性疾病的产品中的应用。
16.优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂在制备针对中枢神经系统cns疾病的治疗和/或预防的产品中的应用。
17.此外，为解决上述问题，本技术还提供一种脑部药物递送系统，包括如上述所述蛋白磷脂纳米制剂。
18.此外，为解决上述问题，本技术还提供一种如上述所述蛋白磷脂纳米制剂的制备方法，包括：
19.取apoa1蛋白质，经诱导表达后，获得粗蛋白样本；
20.纯化所述粗蛋白样本，得到纯化蛋白；
21.将所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱进行组装，得到所述蛋白磷脂纳米制剂。
22.本发明提供一种蛋白磷脂纳米制剂、应用及其制备方法。其中，所述蛋白磷脂纳米制剂，是一种运用基因工程设计的基于apoa1蛋白和磷脂相结合的蛋白磷脂复合物，该蛋白磷脂纳米制剂具有如下有益效果：
23.1、蛋白磷脂纳米制剂一方面能够有效穿越血脑屏障，另一方面其自身能够明显表现出对早期神经退行性疾病(包括ad疾病)显著治疗效果。
24.2、蛋白磷脂纳米制剂中的磷脂属天然磷脂，且apoa1蛋白又具有良好的生物兼容性，从而能够使蛋白磷脂纳米制剂在体内达到更好的稳定性；
25.3、该蛋白磷脂纳米制剂自身可负载相应小分子，可作为药物载体应用。
26.综上，该蛋白磷脂纳米制剂可作为抗cns疾病的药物，又可作为脑部靶向递送体系，成为一套针对中枢神经系统cns疾病预防和治疗的脑部药物递送系统解决方案。
附图说明
27.图1为含有保守序列的apoa1蛋白的带状结构图；
28.图2为apoa1蛋白纯化后的sds-page图；
29.图3a为apoa1-nd的尺寸排阻(sec)图；
30.图3(b-1)为大尺寸颗粒(125nm)的apoa1-nd的透射电子显微镜(tem)图；
31.图3(b-2)为中尺寸颗粒(38nm)的apoa1-nd的透射电子显微镜(tem)图；
32.图3(b-3)为小尺寸颗粒(4.6nm)的apoa1-nd的透射电子显微镜(tem)图；
33.图3(c-1)为原子力显微镜纳米颗粒形貌图；
34.图3(c-2)为原子力显微镜纳米颗粒高度图；
35.图4为bodipy标记的apoa1-nd静脉给药后的脑分布图；
36.图5为apoa1-nd经静脉注射后在aβ聚集体周围积累图；
37.图6apoa1-nd减少aβ沉积的大脑组织切片图；
38.图6(a)为apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质和海马体中的淀粉样蛋白沉积；
39.图6(b)为app/ps1小鼠大脑皮质中的淀粉样蛋白沉积定量分析统计图；
40.图6(c)为app/ps1小鼠海马体中的淀粉样蛋白沉积定量分析统计图；
41.图7apoa1-nd减少小胶质细胞增生的大脑组织切片图；
42.图7(a)为apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质和海马体中的减弱的小胶质细胞增生；
43.图7(b)为apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质中的小胶质细胞增生的定量分析统计图；
44.图7(c)为apoa1-nd减少了app/ps1小鼠海马体中的小胶质细胞增生的定量分析统计图；
45.图8组织切片的尼氏染色结果图；
46.图9(a)为阿尔兹海默症模型小鼠的行为轨迹分析(莫尔斯水迷宫实验)治疗、病理监测和治疗评估的时间表；
47.图9(b)为不同时间点的逃避潜伏时间图；
48.图9(c)为游泳速度比较图；
49.图9(d)为平台拆除的最后一天小鼠通过平台的次数；
50.图9(e)为mwm小鼠在不同处理后的代表性游泳路径；
51.图10各器官组织切片图。
52.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
53.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
54.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
55.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
56.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
57.本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
58.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
59.以下仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
60.下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
61.本发明提供一种蛋白磷脂纳米制剂，为基于apoa1蛋白和磷脂相结合的蛋白磷脂复合物；其中，所述apoa1蛋白为不含有如seq id no.1所示的保守序列或所述保守序列的同源序列的apoa1蛋白。
62.上述，apoa1是一种高密度脂蛋白的主要成分，可以作为磷脂纳米盘的支架组装成磷脂纳米盘，是一种载脂蛋白。
63.磷脂纳米盘，其外围受两亲性膜支架蛋白包裹，能形成稳定的双分子层类膜结构，结构组成稳定，不受磷脂浓度变化影响。
64.上述，磷脂，在本发明中为天然磷脂，具有非常好的稳定性和生物相容性。需要说明的是，根据文献(human apolipoprotein a
–
i binds amyloid-βand prevents aβ-induced neurotoxicity，int j biochem cell b，41(2009)1361
–
1370)报道，保守序列“gnlltld”片段，与apoa1蛋白具有同源性，并且，序列gnlltld及其同源性的序列，均能够与聚集的aβ特异性结合，证明该同源序列就是aβ的结合位点。参考图1，为含有保守序列片段的apoa1蛋白的空间带状结构。表1为与保守序列具有相近片段的同源序列，与保守序列1中的“gnlltld”片段相比，序列2-18均具有相同“gnlltld”中的部分片段，即为同源性序列(用加粗和斜体字母表示)。例如，序列2中的“lnlklld”，就具有与保守序列相同的对应片段“nl”和“ld”，该序列片段虽然不是与保守序列完全相同的序列片段，但属于与保守序列相近的同源序列。
65.表1、与保守序列具有相近片段的同源序列
[0066][0067][0068]
传统的已公开的高密度脂蛋白的apoa1相关蛋白，在其中均含有上述同源序列，亦即保守序列的片段区间，由此致使所述的apoa1相关蛋白透过血脑屏障后，能够靶向aβ并促进aβ降解。
[0069]
而本发明中所提供的蛋白磷脂纳米制剂，其为apoa1蛋白和磷脂相结合的蛋白磷脂复合物。作为apoa1相关蛋白的一种，其中并不含有传统已公开的高密度脂蛋白的apoa1相关蛋白中相同的保守序列的片段区间，却表现出同aβ的相互作用能力，特别是显著的对
早期神经退行性疾病ad疾病的治疗效果，这是目前尚未有文献报道过的。
[0070]
本发明所提供的蛋白磷脂纳米制剂，能够透过血脑屏障(bbb)靶向aβ并促进其降解，降低aβ聚集水平、降低小胶质细胞增生，降低海马即大脑皮质神经细胞丢失、提高空间学习和记忆能力，能够表现出显著的早期神经退行性疾病防治效果。
[0071]
本发明提供的蛋白磷脂纳米制剂，一方面能够有效穿越血脑屏障，另一方面其自身能够明显表现出对早期神经退行性疾病(包括ad疾病)显著治疗效果；蛋白磷脂纳米制剂中的磷脂属天然磷脂，且apoa1蛋白又具有良好的生物兼容性，从而能够使蛋白磷脂纳米制剂在体内达到更好的稳定性；该蛋白磷脂复合物自身可负载相应小分子，可作为药物载体应用；该蛋白磷脂复合物可作为抗cns疾病的药物，又可作为脑部靶向递送体系，成为一套针对中枢神经系统cns疾病预防和治疗的脑部药物递送系统解决方案。
[0072]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列包括：
[0073]
如seq id no.2所示的第1氨基酸序列和如seq id no.3所示的第2氨基酸序列中的一种或两种组合。
[0074]
上述，蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列为在e.coli bl21(de3)中表达改造后的apoa1蛋白，其至少要含有第1氨基酸序列(a)、第2氨基酸序列(b)中的一种或两种。
[0075]
在此，蛋白磷脂纳米制剂可能包含有如下几种情况，分别可以为：1、a；2、b；3、a b。其中，序列a和b之间再此并不限制排列顺序。
[0076]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列还包括：
[0077]
如seq id no.3所示的第3氨基酸序列。
[0078]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂的氨基酸序列的排列顺序为所述第1氨基酸序列、所述第2氨基酸序列和所述第3氨基酸序列依次排列。
[0079]
上述，在e.colibl21(de3)中表达改造后的apoa1蛋白中，即蛋白磷脂纳米制剂中，包括如下按照顺序依次排列的序列：所述第1氨基酸序列、所述第2氨基酸序列和所述第3氨基酸序列依次排列。
[0080]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂的每个纳米盘颗粒的直径为5-130nm。
[0081]
上述，蛋白磷脂纳米制剂中，apoa1蛋白符合天然磷脂后，其颗粒的尺寸能够保持固定，颗粒大小规格可以为：颗粒粒径能够保持在5-130nm。
[0082]
优选地，所述蛋白磷脂纳米制剂的每个颗粒的内部嵌入的磷脂数量为100-1000个。
[0083]
上述，apoa1蛋白能在一系列体内实验中也表现出良好的稳定性，是理想的可应用于成像诊断和治疗的药物递送的载体平台，在与磷脂结合后，每个纳米颗粒本体的内部能够嵌入脂质数量为100-1000个脂质分子，形成复合物，组成复合的生物大分子体系。
[0084]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂在制备用于预防和/或治疗早期神经退行性疾病的产品中的应用。
[0085]
进一步的，所述蛋白磷脂纳米制剂在制备针对中枢神经系统cns疾病的治疗和/或预防的产品中的应用。
[0086]
此外，为解决上述问题，本技术还提供一种脑部药物递送系统，包括如上述所述蛋白磷脂纳米制剂。
[0087]
药物递送系统(drug delivery system，dds)是指在空间、时间及剂量上全面调控
药物在生物体内分布的技术体系。其目标是在恰当的时机将适量的药物递送到正确的位置，从而增加药物的利用效率，提高疗效，降低成本，减少毒副作用。药物递送系统是医学、工学(材料、机械、电子)及药学的融合学科，其研究对象既包括药物本身，也搭载药物的载体材料、装置，还包括对药物或载体等进行物理化学改性、修饰的相关技术。而本技术中，提供的是一种脑部药物递送系统，由其涉及到的是一种针对脑部疾病具有一定治疗和预防功能的药物递送系统。
[0088]
本发明运用基因工程设计的apoa1蛋白为基础的蛋白磷脂纳米制剂，该蛋白磷脂纳米制剂是一种药物递送的载体平台，其在与磷脂结合后，每个apoa1蛋白的纳米颗粒内能嵌入100-1000个。脂质分子从而形成复合物，组成复合的生物大分子体系，从而实现药物递送系统的载体功能，可作为抗cns疾病的药物脑部靶向递送体系，成为一套针对中枢神经系统cns疾病脑部药物递释系统解决方案。
[0089]
此外，为解决上述问题，本技术还提供一种如上述所述蛋白磷脂纳米制剂的制备方法，包括：
[0090]
取apoa1蛋白质，经诱导表达后，获得粗蛋白样本；
[0091]
纯化所述粗蛋白样本，得到纯化蛋白；
[0092]
将所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱进行组装，得到所述蛋白磷脂纳米制剂。
[0093]
上述，所述将所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱进行组装中，所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的摩尔比例可以为1：(50-150)。
[0094]
进一步的，所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的摩尔比例可以为1：(60-120)。
[0095]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0096]
实施例1：apoa1蛋白质的诱导表达。
[0097]
制备方法中步骤：取apoa1蛋白质，经诱导表达后，获得粗蛋白样本。
[0098]
实验方法：
[0099]
(1)取含有apoa1蛋白基因序列的重组质粒，将其转化至大肠杆菌感受态bl21(de3)菌株中；
[0100]
(2)过夜培养后挑取单克隆至50ml含有100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，置于摇床上220r/min，37℃培养过夜。
[0101]
(3)将菌液转接至1000ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，使初始od600＝0.1。37℃震荡培养至od600＝0.8左右，加入1ml iptg，使其终浓度为1mm。
[0102]
(4)放置摇床上37℃、220r/min诱导4h。诱导前后取菌液(粗蛋白样本)保存用于后续sds-page凝胶电泳。
[0103]
实施例2：蛋白质的纯化。
[0104]
制备方法中步骤：纯化所述粗蛋白样本，得到纯化蛋白。
[0105]
实验方法：
[0106]
(1)离心收集诱导的细菌(粗蛋白样本)，用预冷的tbs缓冲液洗2遍，去上清，在沉淀中加入裂解液20mm tris-hcl ph＝8.0,1％triton x,充分重悬菌体，再加入1mg溶菌酶。
低温超声(冰浴)裂解细菌。裂解产物在4℃下12000rpm离心45min，收集上清进行过滤，再通过ni-nta亲和柱进行纯化。
[0107]
其中，所用到的缓冲液如下：上样缓冲液：1)ph＝8.0,20mm tris-hcl,500mm nacl,1％tritonx(上样)；2)ph＝8.0,20mm tris-hcl，500mm nacl，50mm na-cholate(冲平)；洗脱缓冲液：3)ph＝8.0,20mm tris-hcl，500mm nacl，20mm imidazole(除杂蛋白)；4)ph＝8.0,20mm tris-hcl，500mm nacl，50mm imidazole(除杂蛋白)；5)ph＝8.0,20mm tris-hcl，500mm nacl，500mm imidazole(洗脱目的蛋白)；
[0108]
(2)洗脱目的蛋白后，用ph＝8.0，20mm tris-hcl，50mm nacl缓冲液透析过夜。然后继续用阴离子交换柱进行纯化。用ph＝8.0,10mm tris-hcl溶解不同浓度的nacl进行洗脱。洗脱后的目的蛋白取少量进行sds-page分析，其余用20mm ph＝7.4的pbs缓冲液透析过夜。
[0109]
(3)经镍离子亲和层析及阴离子交换层析纯化后可获得单一apoa1蛋白。
[0110]
实验结果：参考图2，由sds-page结果显示成功纯化出蛋白。需要说明的是，本实施例中apoa1的产量可根据实际需要大调整范围。其中，apoa1蛋白的产量为，每100l液体培养基经表达纯化可得到1000mg目的蛋白。
[0111]
实施例3：dmpc与apoa1蛋白的组装。
[0112]
制备方法中步骤：将所述纯化蛋白与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱进行组装，得到所述蛋白磷脂纳米制剂。
[0113]
实验方法：(1)将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)分散在含胆酸钠的pbs缓冲液中(20mm ph 7.4)；(2)将apoa1蛋白溶液逐滴滴入dmpc中，实验于超声中进行，直至溶液变澄清，其中apoa1蛋白与dmpc的摩尔比例为1:80。(3)将apoa1蛋白与dmpc混合物用生理盐水透析过夜，离心取上清液用于尺寸排阻色谱(sec)、透射电子显微镜(tem)和原子力显微镜(afm)表征。
[0114]
实验结果：参考图3(c-1)和图3(c-2)的afm图，参加下表，在afm结果中测量了组装后单个蛋白磷脂纳米制剂纳米颗粒的大小。由tem的结果表明，apoa1蛋白与dmpc混合后组装成的生物大分子体系，即蛋白磷脂纳米制剂(以下简称为apoa1-nd)，其直径约为10nm，由图3(a)的sec图，sec的出峰时间也验证了蛋白磷脂复合物apoa1-nd的成功构建，证明了apoa1-nd的成功组装。
[0115][0116]
实施例4-11中材料和仪器：
[0117]
1、实验材料：(1)雄性balb/c裸鼠，4-5周龄，20
±
2g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。(2)雄性app/ps1双转基因小鼠，7月龄，30
±
2g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。(3)雄性c57bl/6j小鼠，7月龄，30
±
2g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
[0118]
2、实验试剂：bodipy、生理盐水、gsh、兔抗app多克隆抗体、兔抗pecam1多克隆抗体、alexafluor488标记山羊抗兔igg、4％多聚甲醛、包埋石蜡、柠檬酸、甲醇、过氧化氢、triton x-100、浓缩型正常山羊血清(封闭)、兔抗ptrpc多克隆抗体、免疫组化试剂盒、
nissl染色、无水乙醇、二甲苯、苏木素、盐酸、中性树胶、dako real envision detection system、甲苯胺蓝、伊红y(水溶性)、抗荧光淬灭封片剂。
[0119]
3、实验仪器：脱水机、超纯水系统、病理切片机、切片刀、组织摊烤片机、载玻片及盖玻片、抗原修复用电陶炉、显微镜、包埋机。
[0120]
实施例4-11中动物饲养方法：实验采用小鼠均为spf级小鼠，所有小鼠的饲养温度均控制在25
±
1℃；实验小鼠随时可获得清洁级颗粒饲料、无菌水；每5d进行垫、鼠笼料及饮用水更换。
[0121]
实施例4：apoa1-nd的体内荧光成像分析。
[0122]
实验目的：为了确定静脉给药后蛋白磷脂复合物nd溶液能穿过血脑屏障进入中枢，使用荧光bodipy标记的apoa1-nd进行体内荧光成像分析。
[0123]
实验方法：将12只裸鼠随机分为两组，分别通过尾静脉注射200μl生理盐水和bodipy-labeled apoa1-nd。在静脉给药后的15min、1h、4h、10h和20h进行图像采集。
[0124]
实验结果：(1)15分钟：在溶液注射15min时的图像采集结果表明，只注射生理盐水的对照组无荧光，经bodipy标记的apoa1-nd主要集中在尾部。(2)1小时：1h图像采集表明，bodipy标记的apoa1-nd进入血液循环，在进入下腔静脉后进入心脏，经主动脉及其各级分支到达脑部，并且可透过血脑屏障进入脑内，荧光遍布全脑。(3)4小时：4h时随血液循环经主动脉及其各级分支到达全身各部，且apoa1-nd的量达到最大，同样，泵入脑部的apoa1-nd也大量增多。(4)10小时：10h后，随着小鼠新陈代谢，荧光强度逐渐减弱。
[0125]
总结：参考图4中，由15分钟、1小时、4小时和10小时的apoa1-nd的体内荧光成像变化趋势可见，apoa1-nd能够明显表现出具有有效穿过bbb的能力。
[0126]
实施例5：aβ免疫荧光分析。
[0127]
实验目的：为了证明尾静脉给药后apoa1-nd可以进入脑实质，我们采用免疫荧光技术结合共聚焦显微镜分析，使用aβ免疫荧光分析评估apoa1-nd在体内靶向aβ的能力。
[0128]
实验方法：1)将200μl的浓度为20μm的bodipy标记的apoa1-nd尾静脉注射入app/ps1小鼠；2)4小时后，处理小鼠并准备好两组冷冻的大脑切片。为了确定apoa1-nd是否被输送到脑实质并与脑中的aβ聚集物结合，第一组切片利用兔抗pecam1多克隆抗体(一抗)标记毛细血，第二组使用兔抗app多克隆抗体(一抗)标记脑中的aβ聚集物。3)从冰箱取出冰冻切片恢复至室温，于pbs中浸泡数分钟；4)血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色；5)加一抗：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，加完一抗后于4℃湿盒中孵育过夜；6)加二抗(带荧光)：用pbst冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，pbst冲洗切片4次，每次3min，此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行；7)复染核：滴加dapi避光孵育5min，对标本进行染核，pbst 5min
×
4次洗去多余的dapi；8)用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
[0129]
实验结果：参考图5，通过兔抗app多克隆抗体免疫荧光信号(aβ组图的高光位置)显示，在aβ聚集的主要部位，即大脑皮层(cotex)和海马体(hippocampus)中，bodipy标记的apoa1-nd(apoa1-nd组图的高光位置)在aβ的周围高度聚集。
[0130]
总结：尾静脉给药4h后，在aβ聚集的主要部位即大脑皮层和海马体中，bodipy标记
的apoa1-nd(红色)在aβ的周围出现高度聚集。结果表明，apoa1-nd在穿过脑血管进入脑实质后，可以明确的靶向aβ沉积。
[0131]
实施例6：抗aβ免疫染色实验。
[0132]
实验目的：为了评估apoa1-nd对aβ的靶向作用及其在ad中的疾病改善作用。
[0133]
实验方法：将7月龄雄性app/ps1小鼠分为三组，每组三只小鼠，分别进行尾静脉注射：生理盐水(ns)、20μm apoa1-nd、5μm apoa1-nd，注射量为200μl，连续2周，以相同条件c57bl/6j雄性小鼠作为正常对照，只注射生理盐水(ns)，具体分组如下表，两周时间后，将小鼠进行麻醉，心脏灌注冷盐水并采集脑组织。
[0134]
组别试验操作1(control)c57bl/6j小鼠 静脉注射生理盐水，连续2周2app/ps1小鼠 静脉注射生理盐水，连续2周3app/ps1小鼠 静脉注射apoa1-nd(浓度为20μm)，连续2周4app/ps1小鼠 静脉注射apoa1-nd(浓度为5μm)，连续2周
[0135]
操作流程：组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋、切片和烤片、切片脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加一抗、加酶标二抗、加显色剂、复染、脱水、封片和镜检拍照。
[0136]
实验结果：由图6(a)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质和海马体中的淀粉样蛋白沉积(棕色斑块)。当apoa1-nd浓度从5μm增加至20μm时，对淀粉样蛋白斑块量的抑制作用明显增强，淀粉样蛋白沉积数量明显减少。由图6(b)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质中的淀粉样蛋白沉积(统计图)。由图6(c)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠海马体中的淀粉样蛋白沉积(统计图)。
[0137]
总之，由图6(a)、图6(b)和图(c)的抗aβ免疫染色能够明显显示出，与生理盐水处理的app/ps1双转基因小鼠相比，apoa1-nd处理的app/ps1双转基因小鼠皮质和海马中的淀粉样蛋白斑块负荷显著减少。
[0138]
实施例7：小胶质细胞的活化评估实验。
[0139]
实验目的：在ad患者和淀粉样变性小鼠模型中观察到小胶质细胞的异常激活。先前的研究表明，aβ寡聚物和原纤维均可触发神经炎症级联反应。本实施例中，用ptrpc作为标记来评估小胶质细胞的活化。
[0140]
实验方法：7个月大的app/ps1小鼠(每组n＝8-9)接受apoa1-nd治疗，200μl 5μm apoa1-nd，每天通过尾静脉静脉注射，持续2周，使用年龄匹配的app/ps1和c57bl/6j小鼠分别给予生理盐水作为阴性对照和正常对照。用兔抗ptrpc多克隆抗体对脑切片(4μm)进行免疫染色。
[0141]
实验结果：由图7(a)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质和海马体中的减弱的小胶质细胞增生(棕色信号)。由图7(b)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠大脑皮质中的小胶质细胞增生(统计图)。由图7(c)可见，apoa1-nd减少了app/ps1小鼠海马体中的小胶质细胞增生(统计图)。
[0142]
总之，与用生理盐水处理的app/ps1双转基因小鼠相比，apoa1-nd减少了阿尔兹海默症模型小鼠不同组织的淀粉样蛋白(aβ)沉积，apoa1-nd处理的小鼠中阳性激活的小胶质细胞负荷显著降低。
[0143]
鉴于aβ聚集物在ad脑小胶质细胞激活中的核心作用，apoa1-nd处理的小鼠中观察到活化小胶质细胞的显著减少可能归因于apoa1-nd在促进aβ清除方面的活性。
[0144]
实施例8：nissl染色分析：皮层和海马体的神经元状态观察。
[0145]
实验目的：皮层和海马体的神经元丢失是ad的主要特征之一。所以能够通过观察皮层和海马体的神经元状态，反应apoa1-nd的治疗效果。
[0146]
实验方法：采用nissl染色检查脑的组织学变化。
[0147]
1)组织脱水；2)组织透明；3)浸蜡；4)包埋；5)切片和烤片；6)切片脱蜡；7)切片入预热60℃1％的甲苯胺蓝染液(尼氏染液)染色40min，蒸馏水洗3次；8)95％酒精快速分化，脱色，显微镜镜检至背景清晰为止；无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，通风柜中风干后中性树胶封片。
[0148]
实验结果：
[0149]
由图8中nissl染色分析显示，与c57bl/6j小鼠相比，生理盐水处理的app/ps1双转基因小鼠的皮质和海马均出现神经元亚细胞减少和神经元核萎缩。相反，apoa1-nd处理显著减轻了app/ps1双转基因小鼠的神经元完整性受损和神经元丢失。
[0150]
实施例9：阿尔兹海默症模型小鼠的行为轨迹分析：morris水迷宫实验。
[0151]
实验目的：评估app/ps1双转基因小鼠的空间学习和记忆能力。
[0152]
实验方法：将7月龄雄性app/ps1小鼠随机分为2组，分别在尾静脉注射生理盐水或apoa1-nd溶液，连续注射4周，每天200μl。以年龄相当的7月龄雄性c57bl/6j小鼠注射生理盐水作为正常对照组，具体分组如下。
[0153]
组别试验操作1(control)c57bl/6j小鼠 静脉注射生理盐水，连续4周2app/ps1小鼠 静脉注射生理盐水，连续4周3app/ps1小鼠 静脉注射apoa1-nd(浓度为20μm)，连续4周
[0154]
实验共进行5天，前四天为定位航行实验：实验开始先将小鼠放入水池中(不放平台)自由游泳2min使其熟悉迷宫环境，把小鼠放在平台上若干秒，让小鼠知道水中有逃生平台。之后将小鼠从离平台最远的象限(ⅰ象限)面壁放入水池中，计时开始，小鼠登上站台后5s停止计时，允许游泳时间为120s，若小鼠120s后没有登上站台，潜伏期记为120s，让小鼠在站台上站立若干秒，最后擦干小鼠放入笼子。如此将小鼠依次放入其余的三个象限(即ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ的顺序依次进行实验)，每只小鼠每天4个象限，共测量4天。训练视频分析系统自动记录到达水下平台的逃避潜伏期、轨迹(路径)、总路程、总时间、平均速度、各象限游泳路程、花在每个象限的时间等。第5天撤除原平台，环境及水温与定位航行试验相同。把水面下的平台撒掉，将小鼠从离平台最远的象限(ⅰ象限)面壁入水进行单次测试，剩余的象限不需要测试。记录小鼠120s的游泳轨迹，之后拿出小鼠，擦干水放入笼子。测定指标有穿越原平台位置的次数(进入和离开平台的次数)、在原平台象限所在的时间占总时间的百分比、各象限游泳路程等。
[0155]
实验结果：由图9(a)可见，7月龄雄性app/ps1小鼠接受apoa1-nd治疗。图9(b)为逃逸潜伏期，apoa1-nd处理的app/ps1双转基因小鼠在四天的水迷宫训练过程中，逃避潜伏期明显缩短。图9(c)为游泳速度，apoa1-nd处理的app/ps1双转基因小鼠在四天的水迷宫训练过程中，游泳速度有了一定的提升。图9(d)展示了平台拆除后的一天各组小鼠通过平台的
次数，可见接受apoa1-nd治疗的app/ps1小鼠通过平台的次数明显比未接受apoa1-nd治疗的app/ps1小鼠通过平台的次数多。
[0156]
总之，参考附图9(a)、图9(b)、图9(c)和图9(d)，其中，与c57bl/6j小鼠相比，它们表现出学习能力的缺陷。相比之下，apoa1-nd处理的app/ps1双转基因小鼠在四天的水迷宫训练过程中，无论是逃避潜伏期还是游泳速度，都表现出明显改善的空间学习和记忆能力。
[0157]
拆除逃生平台后，c57bl/6j老鼠集中搜索平台所在的象限，而生理盐水处理过的app/ps1双转基因老鼠则表现出不集中的搜索策略。apoa1-nd处理后，app/ps1双转基因小鼠的搜索策略有明显改善，具有更积极的探索性能，并且更频繁地出现在平台位置周围。
[0158]
实施例10：apoa1-nd治疗ad的生物安全性评价实验。
[0159]
实验目的：评价apoa1-nd治疗ad的生物安全性
[0160]
实验方法：
[0161]
将7月龄雄性app/ps1小鼠随机分为2组，分别在尾静脉注射生理盐水或apoa1-nd溶液，连续注射4周，每天200μl。以年龄相当的7月龄雄性c57bl/6j小鼠注射生理盐水作为正常对照组，具体分组如下。
[0162]
组别试验操作1(control)c57bl/6j小鼠 静脉注射生理盐水，连续4周2app/ps1小鼠 静脉注射生理盐水，连续4周3app/ps1小鼠 静脉注射apoa1-nd(浓度为20μm)，连续4周
[0163]
处死实验小鼠和并对主要器官进行收集、固定、脱水、嵌入在石蜡,连续切片，苏木精和伊红染色，最后用光学显微镜评估。
[0164]
实验结果：
[0165]
与用生理盐水处理的动物相比，apoa1-nd处理的动物的心(a)、肝(b)、脾(c)和肾脏(e)没有明显的病理变化。而在肺部(d)，有报告表明，在用生理盐水处理的app/ps1小鼠中会观察到炎症反应，如肺泡间隔出血、肺泡周围毛细血管充血和间质局灶性淋巴细胞浸润。
[0166]
在apoa1-nd治疗的动物中没有看到这种病理变化。由于hdl(high-density lipoprotein，高密度脂蛋白)具有抗炎活性，可以推测apoa1-nd可能通过相同的机制减轻app/ps1小鼠肺部的炎症反应。
[0167]
如图10所示，在图中a、b、c、d和e，依次对应心、肝、脾、肺和肾脏。apoa1-nd的治疗减轻了app/ps1小鼠的小胶质细胞增生并改善了神经系统变化，而不会对脑组织造成其他明显的损伤。实验数据表明，在目前给药方案下，apoa1-nd的体内应用是安全的。对于抗ad治疗，进一步评估长期体内安全性具有显著的商业价值。
[0168]
实验结果表明，apoa1-nd对aβ单体和寡聚体具有较高的结合亲和性，加速aβ在小胶质细胞和肝细胞的降解。更重要的是，由实验结果可以得出，在小鼠尾静脉注射后，apoa1-nd可通过血脑屏障进入脑内。
[0169]
并且在经过连续的尾静脉注射治疗后，模型小鼠可减少淀粉样蛋白沉积，减轻小胶质细胞增生，改善神经系统变化，挽救记忆缺陷。
[0170]
由于apoa1-nd成分来源蛋白和天然磷脂，因此本发明所开发的蛋白体系既能高效通过血脑屏障、又兼具高脑靶向性、安全无毒、并有效消除阿尔茨海默症状，可应用于防治
早期神经退行性疾病。
[0171]
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。