大黄素琥珀酰乙酯在制备治疗卵巢癌药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及大黄素琥珀酰乙酯在制备抗卵巢癌药物中的应用，本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.大黄素(如式i)也称为朱砂莲甲素，化学名为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌，属于蒽醌类化合物，以游离和苷形式存在于蓼科植物掌叶大黄、大黄、唐古特大黄的根茎及根中。近年来的研究发现，大黄素对肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤均有抑制作用，其机制与抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡、抗血管生成等多种途径相关。同时大黄素与现临床上使用的抗肿瘤药物及放化疗等均具有较好的协同作用。但大黄素本身具有毒性高，生物利用度低等缺点，因此目前还没有直接用于临床方面的报道。经过化学修饰的大黄素琥珀酰乙酯降低了毒性以及吉布斯自由能，成药性良好，并且具有抗卵巢癌作用。
[0003][0004]
卵巢癌是常见的恶性妇科肿瘤之一，致死率高于宫颈癌和子宫癌，占各类妇科肿瘤的首位，严重威胁女性生命安全。国际癌症研究机构发布数据预估，到2020年，全球将有1930万例癌症新发病例和1000万例癌症死亡，在900万女性癌症患者中，卵巢癌的发生率为4.3％，在440万死亡的女性患者中，卵巢癌的占比高达4.7％，其发生率和死亡率均居各种癌症第八位(rl siegel,kd miller,a jemal.cancer statistics,2020.ca cancerj.clin.,2020.)。在中国，根据国家癌症中心在2020年发布的最新的肿瘤数据，2015年中国新发卵巢癌病例5.2万例，死亡的患者为2.5万例，死亡率高居各癌种第十位(郑荣寿，赫捷，等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析。中华肿瘤杂志，2019)。由于卵巢位于盆腔深处、体积较小，很难在病程早期发现卵巢癌，大多数在发现时都已经扩散到盆腹腔器官，因此80％以上的患者就诊时已为晚期。晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为20％～40％，而早期患者却可以达到70％～90％。因卵巢位于盆腔深处，难以扪及或筛查，卵巢癌早期又多无症状，70％的卵巢癌在诊断时就已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，而且卵巢癌组织类型复杂，所以卵巢癌无论在诊断和治疗上都是目前研究的热点。
[0005]
目前，卵巢癌的常规治疗方式为手术、放疗以及化疗，此外，靶向治疗、内分泌治疗、放射治疗等也具有一定的疗效。但手术治疗难以完全保存年轻患者的生育功能；放射治疗对于卵巢内胚窦瘤、未成熟畸胎瘤、胚胎癌等不敏感，并具有较大的腹、盆腔副作用，所以化疗是卵巢癌唯一的辅助治疗手段。然而临床使用的化疗药物如多柔比星存在严重的心脏
毒性，甚至可能导致患者心律失常及心力衰竭，因此研发安全有效的化疗药物尤为重要。
[0006]
pfkfb4作为一种分子支点可通过刺激src-3促进恶性肿瘤将糖代谢和转录激活结合。pfkfb4也被称为6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶4，是合成2，6-二磷酸果糖的酶，广泛存在于各种生物细胞中。pfkfb4是由缺氧引起的，在癌细胞中被高度表达，对于在缺氧条件下癌细胞的生存至关重要。所以pfkfb4可能是开发抗肿瘤药物的一个有效分子靶标。研究表明，pfkfb4能够诱导src-3的磷酸化，src-3磷酸化后转位进入细胞核，与atf-4结合，调节mtorc1，影响卵巢癌的增殖、迁移和侵袭(s dasgupta,et.al.metabolic enzyme pfkfb4 activates transcriptional coactivator src-3 to drive breast cancer.nature,2018)。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于为卵巢癌的治疗提供一种全新的化合物，即大黄素琥珀酰乙酯在制备抗卵巢癌药物中的应用。
[0008]
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0009]
本发明通过细胞活力测定实验、划痕实验、侵袭实验、流式细胞实验、卵巢癌荷瘤小鼠模型在体实验、免疫印迹实验确证大黄素琥珀酰乙酯的抗卵巢癌作用。与空白对照组相比，cck8实验证明3、10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯均能降低卵巢癌细胞ovhm的细胞活力，其抑制率随浓度升高而增大，并且在100μmol/l时达到最大，ic50为10.27μmol/l；流式细胞分析证明10，30，100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯均能够诱导卵巢癌细胞凋亡；划痕实验证明大黄素琥珀酰乙酯抑制卵巢癌细胞迁移；transwell实验证明大黄素琥珀酰乙酯降低卵巢癌细胞侵袭能力。卵巢癌荷瘤小鼠模型在体实验证明给药21天后，模型组、多柔比星组和大黄素琥珀酰乙酯20mg/kg
·
d-1
、60mg/kg
·
d-1
、180mg/kg
·
d-1
组的肿瘤体积分别为：1.02
±
0.092cm3、0.66
±
0.088cm3、0.81
±
0.134cm3、0.55
±
0.060cm3、0.65
±
0.066cm3；肿瘤重量分别为0.64
±
0.09g、0.38
±
0.06g、0.39
±
0.06g、0.34
±
0.05g、0.35
±
0.03g。与肿瘤模型组相比，60mg/kg
·
d-1
、180mg/kg
·
d-1
剂量的大黄素琥珀酰乙酯分散体均能够降低荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量。免疫印迹实验证明与模型组相比，大黄素琥珀酰乙酯在蛋白水平上抑制卵巢癌中pfkfb4、src-3、p-src-3及其下游atf-4、asns、p-mtorc1、bcl-2的表达，升高bax/bcl-2比值，诱导肿瘤细胞凋亡。
[0010]
在上述研究的基础上，本发明提出了大黄素琥珀酰乙酯在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述大黄素琥珀酰乙酯化学名为：1,8-二羟基-3-琥珀酸单乙酯基-6-甲基蒽醌，分子式：c
21h18
o8，分子量：398。
[0011]
大黄素琥珀酰乙酯的结构如下式ii所示。
[0012]
[0013]
其中，优选的，所述的药物能够降低肿瘤细胞的活力，抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭，诱导卵巢癌细胞凋亡，延缓卵巢癌进展。
[0014]
其中，优选的，将大黄素琥珀酰乙酯与药学上可接受的载体制成片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂或混悬剂，用于口服。
[0015]
其中，优选的，所述的药物用于单独给药或者联合治疗。
[0016]
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0017]
本发明提出了一种新的可用于治疗卵巢癌的药物。通过细胞活力测定实验、划痕实验、侵袭实验、流式细胞实验、卵巢癌荷瘤小鼠模型在体实验确证大黄素琥珀酰乙酯具有显著的抗卵巢癌作用。本发明的提出为卵巢癌的治疗提供了一种新的技术手段。
附图说明
[0018]
图1为大黄素琥珀酰乙酯影响小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞活力图(*：与空白对照组相比，p《0.05；**：与空白对照组相比，p《0.01，***：与空白对照组相比，p《0.001)；
[0019]
图2为大黄素琥珀酰乙酯对小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞ic
50
计算图；
[0020]
图3为大黄素琥珀酰乙酯影响小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞凋亡图(*：与空白对照组相比，p《0.05；**：与空白对照组相比，p《0.01，***：与空白对照组相比，p《0.001)；
[0021]
图4为大黄素琥珀酰乙酯影响小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞迁移图(*：与空白对照组相比，p《0.05；**：与空白对照组相比，p《0.01，***：与空白对照组相比，p《0.001)；
[0022]
图5为大黄素琥珀酰乙酯影响小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞侵袭图(*：与空白对照组相比，p《0.05；**：与空白对照组相比，p《0.01，***：与空白对照组相比，p《0.001)；
[0023]
图6为大黄素琥珀酰乙酯灌胃给药后，小鼠卵巢癌细胞的生长曲线图；
[0024]
图7为大黄素琥珀酰乙酯灌胃给药21天后取出肿瘤的代表图(*：与模型组相比，p《0.05；**：与模型组相比，p《0.01；***：与模型组相比，p《0.001)；
[0025]
图8为大黄素琥珀酰乙酯灌胃给药21天后取出肿瘤体积统计图(*：与模型组相比，p《0.05；**：与模型组相比，p《0.01)；
[0026]
图9为大黄素琥珀酰乙酯灌胃给药21天后取出肿瘤重量统计图(*：与模型组相比，p《0.05；**：与模型组相比，p《0.01)；
[0027]
图10为大黄素琥珀酰乙酯调控卵巢癌组织中pfkfb4/src-3/atf-4/asns/mtor信号通路电泳条带代表图(*：与模型组相比，p《0.05；**：与模型组相比，p《0.01)。
具体实施方式
[0028]
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0029]
实施例1大黄素琥珀酰乙酯对小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞活力测定实验及ic
50
计算
[0030]
使用cck8测定法检测细胞活力。将对数生长期的ovhm细胞接种在96孔板中。然后将它们暴露于3、10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯以及10μg/ml的多柔比星。24h后，在96孔板中加入cck8试剂，每孔10μl，37℃孵育1h。取出后将96孔板在振荡器上摇动10min，最后用酶标仪读取每个孔在450nm处的吸光度值。
[0031]
结果见图1，由图1可知，大黄素琥珀酰乙酯可抑制小鼠卵巢癌细胞ovhm的细胞活
力，且该抑制作用呈剂量依赖性(
*
：与空白对照组相比，p《0.05；
**
：与空白对照组相比，p《0.01，
***
：与空白对照组相比，p《0.001)。由图2可知，以大黄素琥珀酰乙酯浓度为横坐标，对卵巢癌细胞的抑制率为纵坐标绘制量-效曲线图，并计算抑制率为50％时的大黄素琥珀酰乙酯浓度为ic
50
值。经计算可得，大黄素琥珀酰乙酯对卵巢癌细胞的ic
50
为10.27μmol/l。
[0032]
实施例2大黄素琥珀酰乙酯对小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞凋亡测定实验
[0033]
利用流式细胞技术检测大黄素琥珀酰乙酯对ovhm细胞凋亡的影响。将对数生长期的ovhm细胞接种在6孔板中。然后分别加入10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯、10μmol/l的大黄素以及10μg/ml的多柔比星。药物处理24h后，用不含edta的胰酶消化细胞，1000r/min离心5min，4℃预冷的pbs洗涤两次，重悬，调整细胞浓度为2
×
106个/ml，依次加入10μlannexin
ⅴ
和5μl碘化丙啶(pi)，室温避光孵育5min，流式细胞仪检测分析各组细胞凋亡率。
[0034]
结果见图3a、b，由图3a、b可知，空白对照组、多柔比星组、大黄素组、大黄素琥珀酰乙酯10、30、100μmol/l组的细胞凋亡率分别为9.824
±
1.16％、32.976
±
3.67％、14.274
±
1.09％、15.03
±
1.73％、23.028
±
1.00％、28.986
±
0.91％。因此，10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯均能够诱导卵巢癌细胞凋亡。
[0035]
实施例3大黄素琥珀酰乙酯对小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞迁移测定实验
[0036]
利用划痕实验检测大黄素琥珀酰乙酯对ovhm细胞迁移的影响。将对数生长期的ovhm细胞接种在6孔板中。当细胞汇合度达到90％以上时，用10μl枪头制造人工伤口，然后分别加入10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯、10μmol/l的大黄素以及10μg/ml的多柔比星。分别于0h、12h以及24h在倒置显微镜下进行拍照观察细胞迁移距离，最后用image pro plus软件进行数据分析。
[0037]
结果见图4a、b，由图4a、b可知，药物处理12h后，空白对照组、多柔比星组、大黄素组、大黄素琥珀酰乙酯10、30、100μmol/l组的细胞迁移率分别为58.56
±
4.74％、19.97
±
1.80％、25.62
±
3.29％、17.13
±
5.11％、14.18
±
2.68％、4.61
±
3.47％；药物处理24h后，细胞迁移率分别为68.98
±
1.26％、6.09
±
1.72％、41.91
±
1.77％、34.64
±
5.48％、19.93
±
5.37％、11.89
±
5.08％。因此，以上结果说明10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯均能够抑制卵巢癌细胞迁移。
[0038]
实施例4大黄素琥珀酰乙酯对小鼠卵巢癌细胞ovhm细胞侵袭测定实验
[0039]
利用transwell实验检测大黄素琥珀酰乙酯对ovhm细胞侵袭的影响。用预冷的无血清培养液按10:1将基质胶稀释，每孔加入100μl，37℃培养箱中放置1h使其凝固。取对数生长期的ovhm细胞,调整细胞密度为2.5
×
105个/ml。将200μl细胞悬液加入到小室中，分别加入10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯，阳性对照组加入10μg/ml的多柔比星，37℃，5％co2孵育24h后，加入0.1％的结晶紫染色20min后拍照。
[0040]
结果见图5a、b，由图5a、b可知，空白对照组、多柔比星组、大黄素组、大黄素琥珀酰乙酯10、30、100μmol/l组的相对细胞侵袭率分别为100.00
±
7.04％、19.63
±
1.00％、68.10
±
7.72％、71.78
±
5.61％、58.28
±
3.80％、38.04
±
3.246％。因此，以上结果说明，10、30、100μmol/l的大黄素琥珀酰乙酯均能够抑制卵巢癌细胞侵袭。
[0041]
实施例5大黄素琥珀酰乙酯抗卵巢癌药效学实验
[0042]
将卵巢癌细胞ovhm培养至5-8代后，制备成密度为1
×
106个/ml的肿瘤细胞混悬
液，于balb/c鼠右背部皮下注射0.3ml肿瘤细胞。模型制备1天后，将balb/c鼠随机分为5组。其中包括肿瘤模型组、多柔比星(4mg/kg)组、大黄素琥珀酰乙酯(20mg/kg)组、大黄素琥珀酰乙酯(60mg/kg)组、大黄素琥珀酰乙酯(180mg/kg)组，每组各8只。分组后，多柔比星组每周腹腔注射给药2次，共给药7次。受试药物组每天灌胃给药一次，共给药21天。观察成瘤情况和balb/c鼠生存情况。给药一周后，每3天测量各组肿瘤大小，按照公式计算肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线。给药3周后取材，取肿瘤称重、测量体积并拍照。
[0043]
结果见图6～9，由图6～9可知，大黄素琥珀酰乙酯抑制卵巢癌的生长、降低肿瘤的体积和重量(
*
：与模型对照组相比，p《0.05；
**
：与模型对照组相比，p《0.01，
***
：与模型对照组相比，p《0.001)。
[0044]
实施例6大黄素琥珀酰乙酯调控pfkfb4/src-3/atf-4/asns/mtor信号通路抑制卵巢癌进展
[0045]
采用免疫印迹实验检测大黄素琥珀酰乙酯对pfkfb4/src-3/atf-4/asns/mtor信号通路的调控作用。将肿瘤组织置于冰上，并用ripa蛋白裂解液裂解。超声震荡后将细胞或组织裂解物离心两次并收集上清液。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，转移到nc膜上后用5％脱脂牛奶封闭2h，然后置于一抗中在4℃冰箱摇晃过夜。12h后孵育二抗1h。利用奥德赛红外荧光扫描系统扫膜并分析蛋白条带的灰度值。
[0046]
结果见图10，由图10可知，与模型组相比，大黄素琥珀酰乙酯在蛋白水平上抑制pfkfb4、src-3、p-src-3及其下游atf-4、asns、p-mtorc1、bcl-2的表达，升高bax/bcl-2比值，诱导肿瘤细胞凋亡。
[0047]
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。