不同形状和粒径的金纳米粒载药系统及其制备方法

1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及不同形状和粒径的金纳米粒载药系统及其制备方法。


背景技术：

2.金纳米粒的均匀性和稳定性，以及磁性和光学特性使它们在催化领域、纳米光子学、生物传感器和药物输送方面很有前途，尤其是生物医学和生物技术领域的应用，都需要抗聚集的水溶性纳米粒子，使这些纳米粒子能够在复杂的体内环境中存在。金纳米粒子还具有较强的生物相容性，合成方式可行性高并且可以简单地修饰它们的表面。在医学中现已被广泛作为各种生物药物的潜在递送剂。
3.金纳米粒的制备工艺较为简单，合成方法也较多，主要包括物理合成法及化学合成法。在众多化学合成法中，晶种生长法(也叫种子生长法)是最为常见的合成棒状金纳米粒子的方法。粒子在合成时即使同为一种纳米粒，也可能合成各种不同的形态，比如球状、棒状金纳米粒等，而展现出的形态不同，则可能产生不同的效果；同样的粒子的表面特性会由于合成方法不同而大有不同，可以有的呈现正电势而有的为负电势；粒径在合成的时候可以极大的得到控制，而这一行为具有很大的生物学意义。纳米粒的大小可以直接影响细胞对其的摄取，进而对细胞毒性产生影响。
4.阿霉素(dox)是常用一线化疗药物，具有极强的药理活性，抗肿瘤谱广，其作用机制主要是阿霉素分子嵌入dna，抑制核酸的合成。因此，构建负载阿霉素的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，使阿霉素在体内降低药物的不良反应，延缓药物在体内释放，有效提高阿霉素的疗效是十分必要的。


技术实现要素：

5.本发明为解决上述问题，提供不同形状和粒径的金纳米粒载药系统及其制备方法。
6.本发明采用的技术方案为：
7.不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，是以不同形状和粒径的金纳米粒为载体，通过静电力与经具有良好生物相容性、生物可降解性的配体分子修饰过的抗肿瘤药物结合而成。
8.进一步，上述的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，所述的不同形状和粒径的金纳米粒为球状金纳米粒或棒状金纳米粒。
9.更进一步，上述的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，所述的球状金纳米粒或棒状金纳米粒的粒径为10
–
100nm。
10.更进一步，上述的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，所述的配体分子为透明质酸。
11.更进一步，上述的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统，所述的抗肿瘤药物为阿
霉素。
12.上述的不同形状和粒径的金纳米粒载药系统的制备方法，包括如下步骤：
13.1)在氯金酸溶液中，加入强还原剂使au
3
还原形成粒径在3
–
5nm的金种子，得到金种子溶液；
14.2)在氯金酸溶液中，加入还原剂使au
3
复原为au

，得到生长液；
15.3)将步骤1)得到的金种子溶液与步骤2)得到的生长液混合，au

在已经形成的金种子上被进一步还原为金粒子，得到不同形状和粒径的金纳米粒；
16.4)在催化剂存在下，透明质酸通过化学键连阿霉素，形成透明质酸-阿霉素复合物；
17.5)将步骤3)得到的不同形状和粒径的金纳米粒与步骤4)得到的透明质酸-阿霉素复合物混合反应，通过静电吸附作用力形成不同形状和粒径的金纳米粒载药系统。
18.进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，所述的强还原剂为硼氢化钠。
19.进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，所述的还原剂为抗坏血酸。
20.进一步的，上述的制备方法，步骤4)中，所述的催化剂为二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺。
21.进一步的，上述的制备方法，步骤5)中，所述的透明质酸-阿霉素复合物的投入量为15mg；所述的不同形状和粒径的金纳米粒添加要过量；所述的反应温度为30℃，反应时间为6h。
22.本发明的有益效果为：
23.1、金纳米粒是抗聚集的水溶性纳米粒子，使这些纳米粒子能够在复杂的体内环境中存在；金纳米粒还具有较强的生物相容性，合成方式可行性高，纳米粒子的大小和形状可以直接影响细胞对其摄取，进而对细胞毒性产生影响，本发明采用种子生长法合成了3种不同粒径和形状的金纳米粒，将其作为药物递送系统之用。
24.2、阿霉素是常用的广谱抗癌药，对多种肿瘤细胞有抗癌活性。本发明选择透明质酸作为修饰所用因为其溶于水呈负电性，在修饰时相对于呈正电的金纳米粒较易结合，同时其水溶性好在体内生物相容性尚佳，ha-dox复合物可与癌细胞表面的cd44受体发生特异性识别，从而使系统中的抗癌药物有选择性的释放，达到既能减少损害正常细胞，更能精确靶向除去肿瘤细胞的目的。
附图说明
25.图1为aunps 1、aunps 2和aunrs的紫外光谱对比图。
26.图2为三种不同金纳米粒的粒径及电位图，其中，a、b:aunps 1，c、d:aunps 2，e:aunrs。
27.图3为三种不同金纳米粒的透射电镜图，其中，a:aunps 1，b:aunps 2，c:aunrs。
28.图4为三种不同金纳米粒的扫描电镜图，其中，a:aunps 1，b:aunps 2，c:aunrs。
29.图5为ha-dox复合物的电位图。
30.图6为ha-dox复合物和ha的红外图谱。
31.图7为ha-dox复合物和ha的热失重分析图。
32.图8为三种不同金纳米粒载药系统的电位图，其中，a:aunps 1/ha-dox，b:aunps2/
ha-dox，c:aunrs/ha-dox。
33.图9为aunps 1、aunps 2和aunrs载药前后的电位对比图。
34.图10为三种不同金纳米粒载药系统的的透射电镜图，其中，a:aunps 1/ha-dox，b:aunps 2/ha-dox，c:aunrs/ha-dox。
35.图11为aunps 1、aunps 2和aunrs载药前后的粒径对比图。
36.图12为在不同ph条件下aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的体外释放曲线图。
具体实施方式
37.实施例1不同形状和粒径的金纳米粒载药系统的制备和表征
38.(一)球状金纳米粒(aunps 1和aunps 2)的合成
39.步骤如下：
40.1)制备金种子溶液：将250μl 0.01m的氯金酸溶液加入到10ml 0.1m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中，温和搅拌，此时溶液颜色为黄色，然后向该溶液中快速滴加新鲜冰冷(0℃)的0.01m的硼氢化钠水溶液，继续搅拌，直至溶液颜色从黄色变为棕色，将溶液以1500rpm剧烈搅拌15分钟，然后在环境温度下以300rpm搅拌2小时，使种子成熟，形成粒径在3
–
5nm的金种子，得到金种子溶液；
41.2)制备生长液：将1ml 0.01m的氯金酸溶液加入到32ml 0.1m的ctab溶液中，通过添加去离子水将该溶液的最终体积定容至40ml，然后分别取7.5ml与50μl 0.1m的抗坏血酸溶液均匀混合，得到生长液1，取9ml与50μl 0.1m的抗坏血酸溶液均匀混合，得到生长液2；
42.3)合成球状金纳米粒：分别将1ml金种子溶液加入到生长液1中，将1ml金种子溶液加入到生长液2中，分别在室温下保持过夜，然后均通过高速离心机在25℃的条件下以5000g离心20min，除去上清液，收集下层金纳米粒并重新分散在去离子水中，反复3次以除去多余的模板剂ctab，得到球状金纳米粒(aunps 1和aunps 2)。
43.(二)棒状金纳米粒(aunrs)的合成
44.步骤如下：
45.1)制备金种子溶液：将250μl 0.01m的氯金酸溶液与10ml 0.1m的ctab溶液混匀，在搅拌的过程中快速加入新鲜冰冷(0℃)的0.01m的硼氢化钠水溶液0.6ml，强烈搅拌2分钟后，于30℃恒温水浴中静置2小时，得到褐色澄清的金种子溶液；
46.2)制备生长液：将100ml 0.1m的ctab溶液和5ml 0.01m的的氯金酸溶液混匀得到深黄色溶液，然后加入1ml 0.01m的硝酸银溶液，轻轻搅拌混合，再加入700μl 0.1m的抗坏血酸溶液和700μl 0.1m的hcl溶液混匀，溶液变为无色，即为生长液；
47.3)合成棒状金纳米粒：取制得的100μl金种子溶液加入到生长液中，轻轻混合10秒，溶液为无色澄清液体，在30℃静置过夜，然后通过高速离心机在25℃下以5000g离心15min，除去上清液，收集下层金纳米粒并重新分散在去离子水中，反复3次以除去多余的模板剂ctab，得到棒状金纳米粒(aunps)。
48.(三)透明质酸-阿霉素复合物(ha-dox复合物)的制备
49.1)称取36mg分子量为3000da的透明质酸(ha)均匀分散在10ml pbs缓冲盐溶液中，取适量二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)溶于1ml去离子水中，得到0.07mmol/ml的edc水溶液，取适
量n-羟基丁二酰亚胺(nhs)溶于2ml去离子水中，得到0.16mmol/ml的nhs水溶液，将0.07mmol/ml的edc水溶液和0.16mmol/ml的nhs水溶液加入到ha溶液中，溶解过程于低温恒温搅拌浴中进行，搅拌30分钟后得到活化的ha溶液；
50.2)取适量阿霉素(dox)加入1ml的去离子水中分散均匀，得到0.0086mmol/ml的阿霉素水溶液，取0.0086mmol/ml的阿霉素水溶液与活化的ha溶液混合，将混合溶液在室温下进一步搅拌反应24小时；
51.3)将步骤2)所得溶液用去离子水透析3天，注意适当换透析水以除去未结合的dox、edc和nhs，透析完成后将所得ha-dox复合物冻干为固体，并在-20℃下避光储存。
52.(四)三种不同金纳米粒载药系统的制备
53.分别将三种金纳米粒(aunps 1、aunps 2和aunps)和15mg ha-dox复合物混合，在30℃下反应6h，注意金纳米粒要过量，以保证ha-dox充分结合到载体金纳米粒上，制得三种不同金纳米粒载药系统(aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox)。
54.(五)aunps 1、aunps 2和aunrs的表征
55.1、aunps 1、aunps 2和aunrs的紫外光谱(uv-vis)测定
56.用适量去离子水稀释分散样品，用uv-2550紫外分光光度计在200nm至800nm的波长下，进行样品的紫外吸收测定。结果如图1，aunps 1在521.5nm处出现球状金纳米粒的等离子共振(spr)吸收峰，aunps 2在522.5nm出现共振吸收峰，而aunrs在518.5nm和650nm处出现棒状金纳米粒特有的等离子共振吸收峰，进一步说明成功合成了三种不同金纳米粒。
57.2、aunps 1、aunps 2和aunrs的平均粒径及zeta电位测定
58.将1ml样品溶液轻轻滴入马尔文粒径皿中避免产生气泡干扰测量，将粒径皿放到预热好的马尔文激光粒度仪中，运行malvern v2.2工作站，选择size模块，调节好参数，测量3次取均值得平均粒径。
59.将1ml样品溶液慢慢滴入马尔文电位皿的孔中，一定注意避免产生气泡，将电位皿放入预热好的动态光散射仪中，运行马尔文工作站，选择zeta potential模块，调节平衡时间120s，数据取测量3次的均值。
60.结果如图2，所制得的aunps 1平均粒径为14.96nm，pdi值为0.204，zeta电位为34.6mv；aunps 2的平均粒径为39.80nm，pdi值为0.198，zeta电位为36.8mv；而aunrs的电位为35.9mv，从以上结果得知，已经合成了目标粒径的球状金纳米粒，合成的棒状金纳米粒也都符合种子生长法的电位情况，为正电势。
61.3、aunps 1、aunps 2和aunrs的透射电镜图像
62.合成的三种金纳米粒于jem-2100透射电子显微镜下观察金纳米粒的形态。结果如图3，aunps 1和aunps 2均大部分呈现圆球状，粒径分别在13nm和39nm左右，而aunrs基本呈现规整的长棒状，长径在40nm左右、宽径在15nm左右，且分散较均匀，在溶液中能稳定存在。
63.4、aunps 1、aunps 2和aunrs的扫描电镜图像
64.用移液枪吸取少量三种金纳米粒的水溶液，在扫描电镜下观察金纳米粒的形态。结果如图4，由于金纳米粒的粒径尺寸较小，在扫描电镜下并不是极其清晰的状态，但结果与透射电镜相同，aunps 1、aunps 2大部分呈圆球形，而aunrs呈较规整的长棒状，且进一步印证了合成的金纳米粒尺度之小。
65.(六)ha-dox复合物的表征
66.1、ha-dox复合物的zeta电位测定
67.将1ml样品溶液放在动态光散射仪中，运行马尔文工作站，选择zeta potential模块，调节平衡时间120s，数据取测量3次的均值。ha-dox复合物经动态光散射仪测定结果如图5所示，平均电位是-29mv，结果符合呈负电势的ha与dox结合后的电势，也为下一步的静电合成作用奠定基础。
68.2、ha-dox复合物的红外光谱(ir)测定
69.ha-dox复合物冻干后的固体试样放入监测器进行红外光谱检测，设定测量范围在400-4000cm-1
。ha与ha-dox的红外结果如图6所示，ha特征区的第一个峰为宽峰，在3408cm-1
处，是o-h伸缩振动峰，c-h的伸缩振动峰在2920cm-1
处，n-h振动峰在1608cm-1
处，1034cm-1
处是c-o的伸缩振动峰，而1407cm-1
处是c-h的弯曲振动峰。与ha不同的是，连接了dox的红外谱图显示1741cm-1
处有明显的c＝o伸缩振动峰出现，表明透明质酸与阿霉素已结合成功。
70.3、ha-dox复合物的热失重实验(tga)
71.分别取适量的ha、ha-dox复合物固体样品置于坩埚内，样品体积为坩埚的2/3最佳，在氮气作为保护气的环境下进行测量，升温速率为10℃/min，升温范围设置在0至1200℃。结果见图7，观察到ha除100℃以前失掉的水分，在约200-300℃间急剧从80％下降到40％的重量，分析可能由于大量羧基、羟基等发生热解，而后在300-400℃之间缓慢失重至30％，而ha-dox复合物同样除100℃以前的失水外，在约200-400℃间急剧失重了50％，分析可能因为ha共价连接dox后，含氧基团有所增加，故热分解较快，在温度升至足够高时，ha-dox达到全部分解。鉴于ha与连接dox后的复合物的热分解拐点温度的重合，以及失重的比率对比来看，可以认为ha-dox是合成成功的，且其基本符合1:1连接的构想。
72.(七)三种不同金纳米粒载药系统的表征
73.1、载药系统的zeta电位测定
74.利用动态光散射仪，运行马尔文工作站，选择zeta potential模块，调节平衡时间120s，样品数据取测量3次的均值。aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的zeta电位结果如图8所示，电位分别为-14.9mv、-10.6mv和-14mv。图9为aunps 1、aunps 2和aunrs载药前后的zeta电位对比图，由图9可知，采用静电吸附法载药后，载体aunps的正电位在结合ha-dox的负电位后，变为最终载药系统的负电位，初步证明aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的成功制备。
75.2、载药系统的透射电镜观察
76.利用jem-2100透射电子显微镜下观察三种不同金纳米粒载药系统的形态，结果如图10所示。图11为金纳米粒载药前后粒径对比图，结合三种不同金纳米粒的透射电镜图像可以看出，球状金纳米粒在载药修饰后由原来的圆球形变成椭球形，且aunps 1/ha-dox的粒径分布在20
±
3nm，aunps 2/ha-dox的粒径约为45
±
3nm，而棒状金纳米粒子在载药修饰之后，在透射电镜下观察与修饰前的两端规整状不同，呈现骨头状的长棒形，即两头宽、中间略窄的形状，且其宽径约在20
±
5nm，长径约为50
±
5nm。故无论从形状的变化，亦或是粒径的增大都再一次验证了载药修饰的成功，即aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的成功合成。
77.(八)三种不同金纳米粒载药系统的体外释放实验
78.取aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox分别装于3500da的透析袋
中，再将透析袋分别放入装有40ml不同释放介质的离心管中，将六支离心管放入37℃恒温振荡器，于150rpm的条件下均匀震荡释放，取点时间设置在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h，取点时，精准量取2ml释放液于离心管中标记待测，另立即补入等温的2ml新鲜的释放介质。计算相应时间点整个金纳米粒载药系统释放到介质中的dox累积含量，即累计释放量，并绘制体外释放曲线。
79.结果如图12，在ph 7.4的模拟正常体液的生理条件下，72h时aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的累计释放量分别约是37.4％、42.7％和40.1％，而在ph 6.5的模拟肿瘤细胞微环境条件下，72h时aunps 1/ha-dox、aunps 2/ha-dox和aunrs/ha-dox的累计释放量分别约是77.4％、83.9％和81.3％。可以看出，在两种不同ph条件下，皆是aunps 2/ha-dox释放量最大，aunrs/ha-dox次之，aunps 1/ha-dox累计释放量最小，同时通过累计释放曲线可知，尽管在ph为6.5的前10h内aunps 1/ha-dox释放速率略大于aunrs载药系统，但仍不影响最后的累计释放结果。在不同ph条件下同时间点的累计释放结果，明显在ph较小的条件下药物累计释放量更大，即在呈酸性的肿瘤细胞微环境中更有利于药物的释放，结合载药系统的修饰方式，分析应是酸性条件下发生了水解反应，更有利于药物的释放。