一种新型的外泌体检测方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种新型的外泌体检测方法。


背景技术：

2.外泌体是直径为30～200nm的单层膜囊泡，通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，是细胞外囊泡的一种，由所有类型的细胞分泌，已在血浆、尿液、精液、唾液、支气管液、脑脊髓液、母乳、血清、羊水、眼泪、淋巴液、胆汁和胃酸中都有发现。外泌体是早期内体通过向内出芽形成，起源于细胞质膜向内出芽的早期内体和多泡体(mvb)参与细胞内吞以及物质运输。在免疫系统中，外泌体参与免疫细胞相互作用，包括抗原呈递、免疫激活功能、免疫抑制特性和免疫耐受。
3.由于外泌体的形成和mvb运输受内体分拣转运复合物(escrt)蛋白的调节，因此在不同来源的细胞类型中，这些蛋白及其辅助蛋白如hsc70、hsp90β等都有望在外泌体中发现。vps25蛋白是运输所需的内体分选复合体ii(escrt-ii)所需的一个亚基。escrt-ii是外泌体生成过程中的一个重要复合体，酵母与人的escrt-ii复合体中的蛋白质亚基以字母“y”的形式排列，一个分子vps22蛋白和一个vps36蛋白分子形成一个分支，vps25蛋白二聚体形成另一个分支。目前，外泌体蛋白分析的一个传统方法是western blot以及流式细胞术，这是检测外泌体的一个重要方式，涉及的仪器多并且复杂。
4.酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)是一种利用抗原抗体之间专一性结合的特性，对样品进行检验的方法。elisa方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，这种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应，最终在特定波长下读取吸光值。因此可通过底物的颜色反应来判断有无相应的免疫反应。
5.elisa的检测方法有很多，例如夹心法。夹心法一般的操作步骤为：1.将具有专一性的抗体包被与elisa板上，洗去多余抗体；2.加入待测样品，样品中若有待测的抗原，则其会与elisa板上的抗体进行专一性结合；3.洗去多余的样品，加入另外一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原结合；4.洗去未结合的一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体结合；5.洗去未结合的二次抗体，加入酶底物显色，酶标仪读取显色结果。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的外泌体检测方法操作繁琐，涉及的仪器精密且价格较为昂贵，传统的外泌体检测方法耗费时间较长。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型的外泌体检测方法。
8.本发明是这样实现的，一种新型的外泌体检测方法，所述新型的外泌体检测方法包括：
9.包被在elisa板上的抗外泌体上标志蛋白抗体通过与样品中外泌体结合后，用另
外一种抗外泌体上标志蛋白抗体与外泌体结合，再用酶连接的二次抗体与抗外泌体上标志蛋白抗体结合，最后滴加酶底物进行显色反应进行检测。
10.进一步，所述新型的外泌体检测方法包括以下步骤：
11.步骤一，利用定位在外泌体上不同的特定蛋白进行检测；
12.步骤二，基于外泌体上vps25蛋白的酶联免疫吸附检测。
13.进一步，所述新型的外泌体检测方法还包括：
14.利用外泌体上的标志蛋白进行检测，具体为利用vps25蛋白进行检测。
15.进一步，所述新型的外泌体检测方法还包括：
16.利用外泌体上的标志蛋白进行检测，在酶标板上包被相关的抗体。
17.进一步，所述抗体为抗vps25抗体。
18.进一步，所述新型的外泌体检测方法还包括：
19.利用与酶标板上包被的不同的标志蛋白抗体进行检测。
20.进一步，所述新型的外泌体检测方法还包括：
21.在elisa板上包被特异性抗外泌体上标志蛋白抗体；洗去多余抗体，封闭洗涤，加入待测样品，孵育洗涤；加入另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体，孵育洗涤，加入带有酶或荧光的二次抗体，孵育洗涤并进行检测。
22.进一步，所述特异性抗体为vps25抗体，所述另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体为非vps25抗体。
23.进一步，所述新型的外泌体检测方法还包括：
24.在elisa板上包被特异性抗外泌体上标志蛋白抗体；洗去多余抗体，封闭洗涤，加入待测样品，孵育洗涤；加入另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体，孵育洗涤，加入带有酶或荧光的二次抗体，孵育洗涤并进行检测。
25.进一步，所述特异性抗外泌体上标志蛋白抗体为非vps25抗体，所述另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体为vps25抗体。
26.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
27.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
28.本发明涉及细胞外囊泡的检测，具体提供了一种新型的外泌体检测方法。本发明首次发现vps25蛋白(vacuolar protein-sorting-associated protein 25，vps25)位于外泌体上，同时涉及利用酶联免疫吸附测定的方法特异地检测外泌体。传统的外泌体蛋白分析的方法是western blot(免疫印迹)以及流式细胞术，这是检测外泌体的重要方式，但是western blot以及流式细胞术，实验操作繁琐，耗时长，并且涉及的实验仪器也较为昂贵。本发明采用elisa的方式，利用外泌体上的多个标志蛋白来特异性地检测外泌体，操作简单，耗时短，必要时可肉眼观察结果，未来商品化的elisa试剂盒便携。
29.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
30.本发明发现了一种位于外泌体上新型标志蛋白分子，本发明的目的是提供一种基
于该外泌体上标志蛋白的外泌体检测方法。
31.本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：
32.1.外泌体上的vps25蛋白为发明人发现的新标志蛋白；
33.2.相对于传统的western blot方法，采用elisa的方法免除了繁琐复杂的实验过程与实验设备；
34.3.相对于流式细胞术，采用elisa的方法不用涉及大型的仪器设备，且操作简单。
35.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
36.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
37.目前，外泌体作为生命科学和医学药学研究的一个热门对象，传统的外泌体检测方法繁琐并且耗时，而本发明是基于本发明人发现的新标志蛋白为基础的一种新型外泌体检测方法。选用的标志物为原创发现，其方法原理设计巧妙。目前尚未投入市场，将来在市场上应用前景非常巨大。
38.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
39.本发明中的技术方案，仅在研究论文中出现(exosomal pd-l1contributes to immunosuppression and is associated with anti-pd-1response.nature 560:382-386)，但选择的标志蛋白不具普遍性。此发明中的vps25是外泌体中普遍存在的蛋白，可广泛应用于外泌体的检测。国内外并无相应的技术，因此本发明的技术方案填补了国内外技术的空白。
40.(3)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
41.本发明的技术方案一定程度上可缓解如何快速、方便、特异性地检测外泌体的技术难题。
42.(4)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
43.目前的技术尚处于对外泌体定性检测，尚不能定量检测。若实现外泌体定量检测，还需借助外泌体标准品制备标准曲线，通过吸光值的计算外泌体的浓度。
附图说明
44.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1是本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法流程图；
46.图2是本发明实施例提供的免疫电镜图，胶体金标记出了vps25蛋白；
47.图3是本发明实施例提供的elisa法的原理示意图；
48.图4是本发明实施例提供的elisa板上包被cd63抗体，之后用vps25抗体检测不同浓度的外泌体样品的结果示意图；
49.图5是本发明实施例应用提供的elisa板上包被cd63抗体，之后用vps25抗体检测不同浓度的外泌体样品的结果示意图。
具体实施方式
50.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
51.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型的外泌体检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
52.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
53.本发明实施例提供的vps25蛋白位于外泌体上。
54.本发明实施例提供的新型外泌体检测方法，包括包被在elisa板上的抗外泌体上标志蛋白抗体通过与样品中外泌体结合，然后用另外一种抗外泌体上标志蛋白抗体与外泌体结合，再用酶连接的二次抗体与抗外泌体上标志蛋白抗体结合，最后滴加酶底物进行显色反应进行检测。
55.如图1所示，本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法包括以下步骤：
56.s101，包被在elisa板上的抗外泌体上标志蛋白抗体与样品中外泌体结合；
57.s102，用另外一种抗外泌体上标志蛋白抗体与外泌体结合；
58.s103，用酶连接的二次抗体与抗外泌体上标志蛋白抗体结合；
59.s104，滴加酶底物进行显色反应进行检测。
60.本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法包括：利用定位在外泌体上不同的特定蛋白进行检测；基于外泌体上vps25蛋白的酶联免疫吸附检测方法。
61.本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法还包括：利用外泌体上的标志蛋白进行检测，具体为利用vps25蛋白进行检测。
62.本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法还包括：利用外泌体上的标志蛋白进行检测，在酶标板上包被相关的抗体，具体为抗vps25抗体。
63.本发明实施例提供的新型的外泌体检测方法还包括：利用与酶标板上包被的不同的标志蛋白抗体进行检测，具体为抗vps25抗体。
64.本发明实施例提供的双抗体夹心法的一般elisa操作步骤为在elisa板上包被特异性抗外泌体上标志蛋白抗体，所述特异性抗体为vps25抗体；洗去多余抗体、封闭洗涤、加入待测样品、孵育洗涤、加入另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体(非vps25抗体)、孵育洗涤、加入带有酶或荧光的二次抗体、孵育洗涤、进行检测。
65.本发明实施例提供的双抗体夹心法的一般elisa操作步骤为在elisa板上包被特异性抗外泌体上标志蛋白抗体(非vps25抗体)、洗去多余抗体、封闭洗涤、加入待测样品、孵育洗涤、加入另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体，所述另外一种特异性抗外泌体上标志蛋白抗体为vps25抗体、孵育洗涤、加入带有酶或荧光的二次抗体、孵育洗涤、进行检测。
66.在没有特别指明的情况下，本发明采用的材料及实验方法为常规材料及方法。下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
67.实施例1
68.(1)实验材料：含外泌体的样品来自于间充质干细胞，为本实验室提取并保存；
69.(2)主要实验试剂(见表1)
70.表1主要实验试剂
[0071][0072]
(3)主要实验仪器(见表2)
[0073]
表2主要实验仪器
[0074][0075][0076]
(4)主要实验步骤
[0077]
1)样品中加入免疫电镜专用固定液重悬混匀固定，4℃固定。
[0078]
2)提前加热溶解制备2％琼脂糖溶液，待冷却至40℃左右后加入ep管内，在琼脂糖凝固之前将沉淀用镊子挑起悬浮包裹于琼脂糖内。
[0079]
3)脱水：预冷后的梯度酒精进行脱水，依次为30％酒精4℃20min，50％酒精-20℃20min，70％酒精-20℃20min，80％酒精-20℃10min，85％酒精-20℃10min，90％酒精-20℃10min，95％酒精-20℃10min，100％酒精-20℃10min，100％酒精-20℃10min。
[0080]
4)树脂渗透：100％酒精：纯树脂＝2：1 4℃1h；100％酒精：纯树脂＝1：1 4℃3h；100％酒精：纯树脂＝1：2 4℃17～20h；纯树脂4℃17～20h；纯树脂4℃2次，1h/次。
[0081]
5)包埋：4℃，先将纯树脂滴入包埋胶囊中，然后将样本放入纯树脂中并扣上胶囊帽进行包埋，抽真空0.5～1h后扣紧胶囊帽。
[0082]
6)聚合：低温紫外聚合仪-20℃进行聚合48h以上，后恢复室温，取出树脂块备用。
[0083]
7)超薄切片：超薄切片机切片70～80nm超薄切片，镀膜镍网捞片，片子4℃保存。
[0084]
8)免疫标记：
[0085]
①
复温水合：镍网从4℃取出用超纯水悬浮5min；
[0086]
②
清洗：tbs室温清洗3次，每次5min；
[0087]
③
封闭：1％bsa/tbs的封闭液室温封闭30min；
[0088]
④
加一抗：抗体与封闭液按一定稀释比稀释后4℃过夜孵育；
[0089]
⑤
清洗：室温复温后，tbs清洗3次，每次5min；
[0090]
⑥
加二抗：二抗与二抗稀释液按一定稀释比稀释，先室温孵育20min，后转37℃烘箱孵育1h，然后转室温复温0.5h。实验过程中防止干片。
[0091]
⑦
清洗：tbs清洗5次，每次5min后，超纯水清洗5次，每次5min。
[0092]
⑧
铀复染：镍网于2％醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8min；70％酒精清洗3次；超纯水清洗3次。
[0093]
⑨
烘干：清洗后的镍网用滤纸吸干后放入网板中，37℃烘箱放置10min烘干备用。
[0094]
9)结果观察图像采集：在透射电子显微镜下观察并采集图像，黑色10nm大小的金颗粒即为阳性表达。
[0095]
(5)实验结果
[0096]
图2为免疫电镜图，vps25蛋白位于外泌体上；箭头所指的是外泌体(凹陷球状)以及外泌体上的vps25蛋白(黑点)。
[0097]
实施例2
[0098]
(1)实验材料：含外泌体的样品来自于间充质干细胞，为本实验室提取并保存；
[0099]
(2)主要实验试剂(见表3)
[0100]
表3主要实验试剂
[0101][0102][0103]
(3)主要实验仪器：酶标仪为thermo公司产品。
[0104]
(4)主要实验步骤
[0105]
1)取一块干净的酶标板，将cd63抗体用包被缓冲溶液按1：200的比例稀释混匀，100μl/孔，将酶标板置于4℃冰箱，过夜；
[0106]
2)取出酶标板，洗去多余的抗体，拍干孔中液体，用封闭液封闭未结合位点，200μ
l/孔，室温1h；
[0107]
3)洗去封闭液，拍干孔中液体，将样品用pbs缓冲溶液按一定比例稀释，将待测样品分别加入，100μl/孔，室温1h；
[0108]
4)洗去待测样品，拍干孔中液体，加入vps25抗体；
[0109]
5)洗去未结合抗体，拍干孔中液体，加入带hrp的二次抗体；
[0110]
6)洗去未结合二次抗体，拍干孔中液体，加入tmb显色溶液，10min后加入等体积终止液，充分混匀后，在酶标仪上读取od450处吸光值；
[0111]
(5)实验结果
[0112]
如图3所示为实施例2的elisa原理图，在酶标板上包被cd63抗体，cd63抗体与外泌体上的cd63蛋白结合捕获从而外泌体，然后加入vps25抗体与外泌体上vps25蛋白特异性地结合，加入抗vps25抗体的二次抗体，然后tmb溶液显色，再用h2so4终止反应。
[0113]
如图4所示为实施例2的elisa检测结果，在酶标板上包被cd63抗体，cd63抗体与外泌体上的cd63蛋白结合，然后加入vps25抗体与外泌体上的vps25蛋白结合，加入抗vps25的二次抗体，然后tmb溶液显色，再用h2so4终止反应。其中，外泌体的颗粒数分别使用了1
×
109、5
×
108和1
×
108个/每个孔。检测外泌体阳性反应的灵敏度为1
×
108个颗粒数/每个孔。
[0114]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0115]
应用实施例
[0116]
(1)实验材料：含外泌体的样品来自于横纹肌肉瘤(rd)细胞未感染和肠道病毒71(ev71)感染(moi＝0.5)的rd细胞24h后，取细胞培养上清并通过超高速离心法获得，为本实验室提取并保存；
[0117]
(2)主要实验试剂(见表4)
[0118]
表4主要实验试剂
[0119][0120]
(3)主要实验仪器：酶标仪为thermo公司产品。
[0121]
(4)主要实验步骤
[0122]
1)取一块干净的酶标板，将cd63抗体用包被缓冲溶液按1：200的比例稀释混匀，100μl/孔，将酶标板置于4℃冰箱，过夜；
[0123]
2)取出酶标板，洗去多余的抗体，拍干孔中液体，用封闭液封闭未结合位点，200μl/孔，室温1h；
[0124]
3)洗去封闭液，拍干孔中液体，将样品用pbs缓冲溶液按一定比例稀释，将待测样品分别加入，100μl/孔，室温1h；
[0125]
4)洗去待测样品，拍干孔中液体，加入vps25抗体；
[0126]
5)洗去未结合抗体，拍干孔中液体，加入带hrp的二次抗体；
[0127]
6)洗去未结合二次抗体，拍干孔中液体，加入tmb显色溶液，10min后加入等体积终止液，充分混匀后，在酶标仪上读取od450处吸光值；
[0128]
(5)实验结果
[0129]
如图5所示为应用实施例的检测结果，在酶标板上包被cd63抗体，cd63抗体与外泌体上的cd63蛋白结合，然后加入vps25抗体与外泌体上的vps25蛋白结合，加入抗vps25的二次抗体，然后tmb溶液显色，再用h2so4终止反应。未包被抗体的空白孔(blank)检测外泌体读值较低，而包被cd63抗体检测未感染细胞上清来源外泌体的读值为阳性；且包被cd63抗体检测ev71感染细胞上清来源外泌体的读值显著升高，与ev71感染细胞促进外泌体分泌的预期一致。应用实施例中提示该发明技术应用范围可行。
[0130]
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
[0131]
本发明实施例在研发或者使用过程中取得的积极效果有：
[0132]
(1)elisa板上的抗体可以预包被，在有需要检测样品时，加样后再进行其余步骤的操作(见实施例)，其能快速得出结果，节约时间；同时，选择外泌体普遍表达的蛋白vps25与cd63进行抗体结合，外泌体检测特异性高。
[0133]
(2)elisa实验无需繁琐的实验操作步骤，也无需复杂的大型仪器，操作简单；
[0134]
(3)elisa涉及的试剂也较为简单易得，实验成本低；
[0135]
(4)elisa试剂盒相对便携。
[0136]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。