在多肽生产中具有提高的生产力的丝状真菌细胞的突变体的制作方法

在多肽生产中具有提高的生产力的丝状真菌细胞的突变体
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背景技术：
技术领域
3.本发明涉及在多肽生产中具有提高的生产力的突变体丝状真菌细胞。
4.相关技术说明
5.丝状真菌广泛用于生产各种工业应用的酶和其他生物制品。丝状真菌细胞在目的多肽的产生中的生产力取决于几个因素，如碳源、氮源、分泌、ph、温度和溶解氧。特别地，碳源可以确定诱导和/或抑制哪些分泌酶基因，和其的生产率。碳源通过转录因子和其相关的启动子起作用，根据碳源的水平激活或抑制这些启动子。
6.据报道，raca基因在丝状真菌的菌丝生长和菌丝分枝中起关键作用，并且raca基因失活有助于增加蛋白质产量，因为分泌潜力增强(chen等人,2016,biotech[生物技术]6:214；fitz等人,2019,fungal biol.biotechnology[真菌生物学与生物技术](2019),6:16；fielder等人,2018,microb.cell.[微生物细胞]17:95；virag,2007,molecular microbiology[分子微生物学]66:1579-1596)。
[0007]
还报道了ras gtp酶ras2基因对于调节里氏木霉(trichoderma reesei)中的形态发生和纤维素酶表达很重要，其中ras2g16v组成型活性变体在诱导条件下增加里氏木霉中的纤维素酶基因转录，尤其是xyr1、ace2、cre1和ace1转录因子控制下的纤维素酶基因(zhang等人,2012,plos one[公共科学图书馆
·
综合]7:e48786)。
[0008]
本发明提供了丝状真菌细胞的突变体，用于增加丝状真菌细胞在目的多肽生产中的生产力，其中经修饰的raca基因和ras2变体的组合协同地增加了该突变体的生产力。


技术实现要素：

[0009]
本发明涉及亲本丝状真菌细胞的分离的突变体，该突变体包含：
[0010]
(a)编码目的多肽的多核苷酸；
[0011]
(b)编码rho-gtp酶raca蛋白的raca基因，其中该raca基因在该亲本丝状真菌细胞中经修饰以产生该突变体，使得该突变体在该rho-gtp酶raca蛋白的产生方面部分或完全缺陷；以及
[0012]
(c)编码gtp酶ras2蛋白的ras2基因，其中该gtp酶ras2蛋白在该亲本丝状真菌细胞中经修饰以产生gtp酶ras2变体，该变体在与seq id no:11的位置16相对应的位置处包含取代；
[0013]
其中经修饰的raca基因和该gtp酶ras2变体的组合协同地增加了该突变体在该目的多肽产生中的生产力。
[0014]
本发明还涉及产生目的多肽的方法，该方法包括在用于产生该目的多肽的培养基
中培养此类突变体丝状真菌细胞，以及任选地回收该目的多肽。
附图说明
[0015]
图1示出了质粒pgmer263的图谱。
[0016]
图2示出了质粒pgmer263-raca-proto3的图谱。
[0017]
图3示出了质粒pgmer263-ras2g16v-proto的图谱。
[0018]
图4(以“箱线图”表示)示出了里氏木霉菌株o83e59、o83e58、以及o838xe和亲本里氏木霉菌株o44n7j相对于第7天总蛋白值的比较。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0019]
图5(以“箱线图”表示))示出了里氏木霉菌株o83e59、o83e58、以及o838xe和亲本里氏木霉菌株o44n7j相对于第7天β-葡糖苷酶活性值的比较。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0020]
图6(以“箱线图”表示)示出了里氏木霉菌株o83e59、o83e58、以及o838xe和亲本里氏木霉菌株o44n7j相对于第7天总补料(发酵运行中使用的总补料克数)的比较。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0021]
定义
[0022]
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(ec 3.1.1.72)，其催化乙酰基基团从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。可以在含有0.01％tween
tm 20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mm乙酸钠(ph 5.0)中使用0.5mm乙酸对硝基苯酯作为底物来确定乙酰木聚糖酯酶活性。将一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在ph 5、25℃下每分钟能够释放1微摩尔对硝基酚根阴离子的酶的量。
[0023]
α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-l-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(ec 3.2.1.55)，其催化α-l-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-l-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、l-阿拉伯糖苷酶、或α-l-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mm乙酸钠(ph 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(megazyme international ireland,ltd.))以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过hpx-87h柱色谱法(伯乐实验室有限公司(bio-rad laboratories,inc.))进行阿拉伯糖分析来确定α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0024]
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指可催化α-d-葡萄糖苷酸水解成为d-葡萄糖醛酸酯和醇的α-d-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(ec 3.2.1.139)。可以根据de vries,1998,j.bacteriol.[细菌学杂志]180:243-249来确定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在ph 5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-o-甲基葡糖醛酸的酶的量。
[0025]
辅助活性9多肽：术语“辅助活性9多肽”或“aa9多肽”或“aa9溶解性多糖单加氧酶”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(quinlan等人,2011,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家
xylohydrolase)(e.c.3.2.1.37)，其催化短β(1
→
4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的d-木糖残基从非还原端移除。可以在含有0.01％20的100mm柠檬酸钠中，在ph 5，40℃下，使用1mm对硝基苯基-β-d-木糖苷作为底物来确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、ph 5下，在含有0.01％20的100mm柠檬酸钠中从1mm对硝基苯基-β-d-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
[0035]
cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的，mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mrna。
[0036]
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-d-葡聚糖纤维二糖水解酶(e.c.3.2.1.91和e.c.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-d-糖苷键的水解，从该链的还原端(纤维二糖水解酶i)或非还原端(纤维二糖水解酶ii)释放纤维二糖(teeri,1997,trends in biotechnology[生物技术趋势]15:160-167；teeri等人,1998,biochem.soc.trans.[生化学会会刊]26:173-178)。可以根据由以下所述的程序来确定纤维二糖水解酶活性：lever等人,1972,anal.biochem.[分析生物化学]47:273-279；van tilbeurgh等人,1982,febs letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van tilbeurgh和claeyssens,1985,febs letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和tomme等人,1988,eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志],170:575-581。
[0037]
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在zhang等人,2006,biotechnology advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(whatman)
№
1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、羧甲基纤维素、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼
№
1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(iupac)建立的(ghose,1987,pure appl.chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
[0038]
可以通过测量在以下条件下，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解期间，糖的产生/释放的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(pcs)(或其他预处理的纤维素材料)中的纤维素，在适合的温度(如40℃-80℃)和适合的ph(如4-9)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应物，洗涤或未洗涤的pcs，5％不溶性固体(干重)，50mm乙酸钠(ph 5)，0.1mm cucl2，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过hpx-87h柱色谱法(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。
[0039]
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna或其组
合。
[0040]
控制序列：术语“控制序列”意指对于多肽的编码序列的表达为必要的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是天然的或异源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0041]
缺陷：术语“缺陷”意指将编码本发明的rho-gtp酶raca蛋白的raca基因在亲本丝状真菌细胞中修饰以产生突变体，使得与未修饰raca基因的亲本丝状真菌细胞相比，当在相同条件下培养时，该突变体在rho-gtp酶raca蛋白的产生方面有部分缺陷(至少少25％、更优选地至少少50％、甚至更优选地至少少75％、和最优选地至少少95％的rho-gtp酶raca蛋白)或完全缺陷(少100％的rho-gtp酶raca蛋白)。可以使用本文所述的或本领域已知的方法确定由丝状真菌细胞、亲本或突变体产生的rho-gtp酶raca蛋白的水平。
[0042]
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(e.c.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-d-糖苷键，混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-d-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(zhang等人,2006,biotechnology advances[生物技术进展]24:452-481)。还可以根据ghose,1987,pure and appl.chem.[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在ph 5，40℃下，使用羧甲基纤维素(cmc)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
[0043]
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0044]
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0045]
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指一种4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(ec 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(fae)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、fae-iii、肉桂酸酯水解酶、faea、cinnae、fae-i、或fae-ii。可以在50mm乙酸钠(ph 5.0)中，使用0.5mm对硝基苯基阿魏酸酯作为底物确定对阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在ph 5、25℃下，每分钟能够释放1μmol的对硝基酚根阴离子的酶的量。
[0046]
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种酶。参见例如，shallom和shoham,2003,current opinion in microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、和木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和直链多糖的异质性组，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维
相结合，从而将它们交联成稳健的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(gh)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(ce)。这些催化模块基于其一级序列的同源性，可以分配到gh和ce家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步分组为宗族(clan)，以字母标记(例如，gh-a)。在碳水化合物活性酶(cazy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最详实和最新的分类。半纤维素分解酶活性可根据ghose和bisaria,1987,pure&appi.chem.[理论与应用化学]59:1739-1752，在适合的温度(如40℃-80℃)和适合的ph(如4-9)下进行测量。
[0047]
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含编码目的多肽的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的突变体丝状真菌细胞，该丝状真菌细胞包含经修饰的raca基因且表达gtp酶rac2变体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与细胞不相同的任何细胞子代。
[0048]
提高的生产力：术语“提高的生产力”和其变型意指当在与不具有经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的亲本丝状真菌细胞相同的培养基组成、温度、ph、细胞密度、溶解氧、和时间的条件下培养时，由本发明的突变体丝状真菌细胞(其包含经修饰的raca基因且表达gtp酶rac2变体)产生的目的多肽的量增加了至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。在一方面，与亲本丝状真菌细胞相比，突变体丝状真菌细胞在目的多肽的产生量方面的生产力提高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。
[0049]
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、或肽的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
[0050]
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
[0051]
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0052]
rho-gtp酶raca蛋白：术语“rho-gtp酶raca蛋白”意指rho-gtp酶家族的成员。rho-gtp酶是信号传导g蛋白(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)，并起到分子开关的作用。rho-gtp酶存在于所有真核生物界，并已被证明可调节细胞内肌动蛋白动力学，在细胞器发育、细胞骨架动力学、细胞运动和其他细胞功能中发挥作用。
[0053]
ras2蛋白：术语“ras2蛋白”意指ras-gtp酶家族的成员。ras-gtp酶是信号传导g蛋白(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)，并起到分子开关的作用。ras-gtp酶在控制细胞增殖、形态发生、囊泡运输和基因表达的各种信号通路中发挥重要作用。在里氏木霉中，ras2蛋白在纤维素酶诱导条件下调节纤维素酶基因的表达。
[0054]
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
[0055]
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如emboss软件包(emboss：the european molecular biology open software suite[欧洲分子生物学开放软件套件],rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或其后的版本)的尼德尔(needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0056]
(相同的残基
×
100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0057]
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性，如emboss软件包(emboss：the european molecular biology open software suite[欧洲分子生物学开放软件套件],rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或其后的版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：
[0058]
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0059]
严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0060]
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0061]
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0062]
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0063]
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印
迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0064]
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃，于5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2x ssc、0.2％sds，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
[0065]
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-d-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-d-xylan-xylohydrolase)(e.c.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-d-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃在0.01％x-100和200mm磷酸钠(ph 6)中用0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、ph 6，在200mm磷酸钠(ph 6)中从作为底物的0.2％azcl-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。
[0066]
变体：术语“变体”意指在对应于seq id no:11的位置16的位置处包含取代的gtp酶ras2蛋白。取代意指用不同的氨基酸替换占据某一位置的氨基酸。本发明的变体在纤维素酶诱导条件下具有组成型活性。
[0067]
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
[0068]
本文提及“约”值或参数包括针对该值或参数本身的方面。例如，提及“约x”的描述包括方面“x”。
[0069]
如本文和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/个(a/an)”、“或”以及“该/这些(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚表明。应理解的是，本文所述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
[0070]
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0071]
变体命名惯例
[0072]
出于本发明的目的，将seq id no:11中披露的gtp酶ras2蛋白用作参考，来确定另一种gtp酶ras2蛋白中的相对应氨基酸位置。另一种gtp酶ras2蛋白的氨基酸序列与在seq id no:11中披露的gtp酶ras2蛋白进行比对，并且基于比对，使用尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于seq id no:11中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如emboss软件包(emboss：the european molecular biology open software suite[欧洲分子生物学开放软件套件],rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或其后的版本)的尼德尔(needle)程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。
[0073]
在描述本发明的gtp酶ras2蛋白变体中，调整以下所述的命名法以方便参考。采用了已接受的iupac单字母或三字母的氨基酸缩写。
[0074]
对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。相应地，将在位置16处的甘氨酸被缬氨酸取代表示为“gly16val”或“g16v”。
具体实施方式
[0075]
本发明涉及亲本丝状真菌细胞的分离的突变体，该突变体包含：
[0076]
(a)编码目的多肽的多核苷酸；
[0077]
(b)编码rho-gtp酶raca蛋白的raca基因，其中该raca基因在该亲本丝状真菌细胞中经修饰以产生该突变体，使得该突变体在该rho-gtp酶raca蛋白的产生方面部分或完全缺陷；以及
[0078]
(c)编码gtp酶ras2蛋白的ras2基因，其中该gtp酶ras2蛋白在该亲本丝状真菌细胞中经修饰以产生gtp酶ras2变体，该变体在与seq id no:11的位置16相对应的位置处包含取代；
[0079]
其中经修饰的raca基因和该gtp酶ras2变体的组合协同地增加了该突变体在该目的多肽产生中的生产力。
[0080]
本发明的优势在于经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合协同地增加了突变体在目的多肽产生中的生产力。在一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合使得突变体丝状真菌细胞具有更多分枝的菌丝体表型。在另一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合增加了突变体丝状真菌细胞中目的多肽的分泌。在另一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合增加了突变体丝状真菌细胞在发酵中产生的总蛋白质的量。在另一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合增加了突变体丝状真菌细胞产生的纤维素酶的量。在优选的实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合增加了突变体丝状真菌细胞产生的β-葡糖苷酶的量。在另一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合降低了发酵中突变体丝状真菌细胞的粘度。在另一个实施例中，与亲本细胞相比，经修饰的raca基因和gtp酶ras2变体的组合增加了发酵期间可以供应给突变体丝状真菌细胞的补料的总量。
[0081]
rho-gtp酶raca蛋白
[0082]
在本发明中，gtp酶raca蛋白可以是任何gtp酶raca蛋白。
[0083]
在一方面，gtp酶raca蛋白选自由以下组成的组：
[0084]
(i)rho-gtp酶raca蛋白，其包含与seq id no:2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
[0085]
(ii)rho-gtp酶raca蛋白，其由包含与seq id no:1具有至少70％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及
[0086]
(iii)rho-gtp酶raca蛋白，其由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列在高严格条件下与seq id no:1的全长互补序列杂交。
[0087]
在另一方面，rho-gtp酶raca蛋白与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
[0088]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含与seq id no:2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[0089]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含与seq id no:2具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[0090]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含与seq id no:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含与seq id no:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0091]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含seq id no:2或由其组成。
[0092]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白与seq id no:2的氨基酸序列相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
[0093]
在另一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含seq id no:2的氨基酸序列或其等位基因变体。在另一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白包含seq id no:2的氨基酸序列。在另一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由seq id no:2的氨基酸序列组成。
[0094]
在另一方面，rho-gtp酶raca蛋白由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与seq id no:1或其cdna序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
[0095]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸包含seq id no:1的核苷酸序列。在另一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸由seq id no:1的核苷酸序列组成。
[0096]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由包含与seq id no:1具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0097]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由包含与seq id no:1具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0098]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由包含与seq id no:1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0099]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由包含与seq id no:1具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0100]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸包含seq id no:1或由其组成。
[0101]
在一个实施例中，rho-gtp酶raca蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常高严格条件下与seq id no:1的全长互补序列杂交。
[0102]
在另一方面，rho-gtp酶raca蛋白由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)seq id no:1，(ii)其cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(sambrook等人,1989,molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆实验指南],第2版,cold spring harbor[冷泉港]，纽约)。
[0103]
包含seq id no:1的核苷酸序列或其子序列的多核苷酸，以及包含seq id no:2的
氨基酸序列或其片段的多肽可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码rho-gtp酶raca蛋白的dna。特别地，可以遵循标准dna印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组dna或cdna杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。dna和rna探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用
32
p、3h、
35
s、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。
[0104]
可以针对与上文所述的探针杂交并编码rho-gtp酶raca蛋白的dna来筛选由此类其他菌株制备的基因组dna或cdna文库。来自此类其他菌株的基因组dna或其他dna可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的dna或分离的dna转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与seq id no:1的核苷酸序列或其子序列杂交的克隆或dna，将运载体材料用于dna印迹中。
[0105]
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)seq id no:1；(ii)其cdna序列，(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如x-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
[0106]
在一个实施例中，核酸探针是seq id no:1或其cdna序列。
[0107]
在另一个实施例中，核酸探针是编码seq id no:2的rho-gtp酶raca蛋白或其片段的多核苷酸。
[0108]
gtp酶ras2蛋白
[0109]
在本发明中，gtp酶ras2蛋白可以是任何gtp酶ras2蛋白。
[0110]
在一方面，gtp酶ras2选自下组，该组由以下组成：
[0111]
(i)rho-gtp酶raca蛋白，其包含与seq id no:2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
[0112]
(ii)rho-gtp酶raca蛋白，其由包含与seq id no:1具有至少70％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及
[0113]
(iii)rho-gtp酶raca蛋白，其由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列在高严格条件下与seq id no:1的全长互补序列杂交。
[0114]
在另一方面，gtp酶ras2蛋白与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
[0115]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含与seq id no:11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
[0116]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含与seq id no:11具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
[0117]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含与seq id no:11具有至少90％序列同一性
的氨基酸序列。
[0118]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含与seq id no:11具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0119]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含seq id no:11或由其组成。
[0120]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白与seq id no:11的氨基酸序列相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
[0121]
在另一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列或其等位基因变体。在另一个实施例中，gtp酶ras2蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列。在另一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由seq id no:11的氨基酸序列组成。
[0122]
在另一方面，gtp酶ras2蛋白由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与seq id no:10或其cdna序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
[0123]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由包含与seq id no:10具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0124]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由包含与seq id no:10具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0125]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由包含与seq id no:10具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0126]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由包含与seq id no:10具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0127]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸包含seq id no:10或由其组成。
[0128]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常高严格条件下与seq id no:10的全长互补序列杂交。
[0129]
在一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸包含seq id no:10的核苷酸序列。在另一个实施例中，gtp酶ras2蛋白由如下多核苷酸编码，该多核苷酸由seq id no:10的核苷酸序列组成。
[0130]
在另一方面，gtp酶ras2蛋白由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)seq id no:10，(ii)其cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(sambrook等人,1989,molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆实验指南],第2版,cold spring harbor[冷泉港]，纽约)。
[0131]
包含seq id no:10的核苷酸序列或其子序列的多核苷酸，以及包含seq id no:11的氨基酸序列或其片段的多肽可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码gtp酶ras2蛋白的dna。特别地，可以遵循标准dna印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组dna或cdna杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷
酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。dna和rna探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用
32
p、3h、
35
s、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。
[0132]
可以针对与上文所述的探针杂交并编码gtp酶ras2蛋白的dna来筛选由此类其他菌株制备的基因组dna或cdna文库。来自此类其他菌株的基因组dna或其他dna可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的dna或分离的dna转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与seq id no:10的核苷酸序列或其子序列杂交的克隆或dna，将运载体材料用于dna印迹中。
[0133]
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)seq id no:10；(ii)其cdna序列，(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如x-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
[0134]
在一个实施例中，该核酸探针是seq id no:10或其cdna序列。
[0135]
在另一个实施例中，核酸探针是编码seq id no:11的gtp酶ras2蛋白或其片段的多核苷酸。
[0136]
gtp酶ras2变体
[0137]
在一方面，该变体在对应于seq id no:11的位置16的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，对应于位置16的位置处的氨基酸是被ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr、或val取代，优选被val取代。在另一方面，该变体包含seq id no:11的多肽的取代g16v。在另一方面，该变体由seq id no:11的多肽的取代g16v组成。
[0138]
在另一方面，gtp酶ras2变体与亲本gtp酶ras2蛋白的氨基酸序列具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列同一性。
[0139]
在另一方面，该变体与seq id no:11的gtp酶ras2蛋白具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
[0140]
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变体分子的生物活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，hilton等人,1996,j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de vos等人,1992,science[科学]255:306-312；smith等人,1992,j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899-904；wlodaver等人,1992,febs lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
[0141]
本发明还涉及用于获得gtp酶ras2变体的方法，这些方法包括：(a)在对应于seq id no:11的多肽的位置16的位置处向亲本gtp酶ras2蛋白引入取代，其中该gtp酶ras2变体在纤维素酶诱导条件下具有组成型调节活性；以及(b)回收该变体。
[0142]
可以通过由任何rna指导的dna内切核酸酶组成的crispr基因组编辑，使用例如mad7(美国专利9,982,279)、mad2(美国专利9,982,279)、cas9(doudna等人,2014,science[科学]346:1258096)、“死”cas9(dcas9；qi等人,2013,cell[细胞]152(5):1173)、cas9切口酶(satomura等人2017,sci.rep.[科学报告]7(1):2095)、或cpf1内切核酸酶(zetsche等人2015,cell[细胞]163(3):759)(通过适当地设计的指导rna和适当地设计的修复dna被引导至基因的核苷酸序列)来构建丝状真菌细胞的ras gtp酶ras2变体。
[0143]
还可以使用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。
[0144]
定点诱变是其中在编码亲本gtp酶ras2蛋白的多核苷酸的限定位点上引入突变的技术。
[0145]
通过涉及使用含有所需突变的寡核苷酸引物的pcr可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本gtp酶ras2蛋白的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，scherer和davis,1979,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和barton等人,1990,nucleic acids res.[核酸研究]18:7349-4966。
[0146]
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；storici等人,2001,nature biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；kren等人,1998,nat.med.[自然医学]4:285-290；以及calissano和macino,1996,fungal genet.newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
[0147]
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
[0148]
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由tian等人(2004,nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
[0149]
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由reidhaar-olson和sauer,1988,science[科学]241:53-57；bowie和sauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；wo 95/17413；或wo 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如lowman等人,1991,biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo 92/06204)以及区域定向诱变(derbyshire等人,1986,gene[基因]46：145；ner等人,1988,dna 7:127)。
[0150]
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(ness等人,1999,nature biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
[0151]
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合pcr技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错pcr或非易错pcr扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
[0152]
目的多肽
[0153]
目的多肽可以是任何对于突变体丝状真菌细胞是天然或外源(异源)的多肽。该多肽可以由单个基因或两个或更多个基因编码。术语“异源多肽”在本文定义为对宿主细胞不是天然的多肽；已进行结构修饰以改变天然多肽(例如，天然多肽的蛋白质序列)的天然多肽；或由于通过重组dna技术(例如，不同的启动子、编码多肽的dna的多拷贝)操纵多核苷酸或宿主细胞使其表达发生数量上变化的天然多肽。因此，本发明术语“异源多肽”的范围还涵盖了天然多肽的重组产生，其程度使得此种表达涉及使用对于丝状真菌细胞并非天然的遗传元件，或使用经操纵以丝状真菌细胞中非天然发生的方式起作用的天然元件。
[0154]
在一方面，该多肽对于丝状真菌细胞是天然的。在另一方面，该多肽对于丝状真菌细胞是异源的。
[0155]
该多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”还涵盖组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。多肽还包括融合多肽，其包含自至少两种不同多肽(其中一个或多个多肽对于丝状真菌细胞可以是异源的)获得的部分或完整多肽序列的组合。多肽进一步包括杂合多肽，这些杂合多肽包含来自两个或更多个多肽的结构域，例如，来自一个多肽的结合结构域和来自另一个多肽的催化结构域。结构域可以在n末端或c末端融合。
[0156]
在一方面，该多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白或转录因子。
[0157]
在另一方面，该多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在另一方面，该多肽是乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱酰胺酶、脱氧核糖核酸酶、分散素(dispersin)、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、aa9溶解性多糖单加氧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、黄原胶酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
[0158]
在另一方面，该多肽是纤维素酶。在另一方面，该纤维素酶选自由以下组成的组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
[0159]
在另一方面，该多肽是半纤维素酶。在另一方面，该半纤维素酶选自由以下组成的组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0160]
在另一方面，该多肽是内切葡聚糖酶。在另一方面，该多肽是纤维二糖水解酶。在另一方面，该多肽是β-葡糖苷酶。在另一方面，该多肽是aa9溶解性多糖单加氧酶。在另一方
面，该多肽是木聚糖酶。在另一方面，该多肽是β-木糖苷酶。在另一方面，该多肽是乙酰木聚糖酯酶。在另一方面，该多肽是阿魏酸酯酶。在另一方面，该多肽是阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一方面，该多肽是葡糖醛酸糖苷酶。在另一方面，该多肽是乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面，该多肽是阿拉伯聚糖酶。在另一方面，该多肽是香豆酸酯酶。在另一方面，该多肽是半乳糖苷酶。在另一方面，该多肽是葡糖醛酸酯酶。在另一方面，该多肽是甘露聚糖酶。在另一方面，该多肽是甘露糖苷酶。
[0161]
在本发明的方法中，突变体丝状真菌细胞是重组细胞，其包括编码异源多肽的多核苷酸，该突变体有利地用于多肽的重组产生。该细胞优选用包含编码异源多肽的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化，随后将该载体整合入染色体。“转化”意指将包括多核苷酸的载体引入进宿主细胞中，这样使得该载体被维持为染色体整合体或维持为自主复制的染色体外载体。通常认为整合是有利的，因为多核苷酸更有可能稳定地保持在细胞中。载体整合入染色体可以通过同源重组、非同源重组或转座发生。
[0162]
编码异源多肽的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源例如古细菌(archaeabacteria)获得。出于本发明的目的，如在此与给定来源结合使用的术语“从
……
中获得”应意指该多肽由该来源或有其中已经插入来自该来源的基因的细胞产生。
[0163]
用来分离或克隆编码目的多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组dna分离、从cdna制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(pcr)实现从此类基因组dna中克隆此类多核苷酸。参见例如，innis等人,1990,pcr protocols:a guide to methods and application[pcr：方法和应用指南],academic press[学术出版社],纽约。克隆程序可涉及将包括编码多肽的多核苷酸的所需核酸片段切除并分离、将片段插入载体分子、以及将重组载体并入本发明的突变体丝状真菌细胞，其中会复制多核苷酸的一个或多个拷贝或克隆。多核苷酸可以是基因组、cdna、rna、半合成、合成来源的，或其任何组合。
[0164]
可以使用本领域中的标准方法将编码目的多肽的多核苷酸引入突变体丝状真菌细胞。
[0165]
亲本丝状真菌细胞
[0166]
在本发明中，亲本丝状真菌细胞可以是任何丝状真菌细胞。丝状真菌细胞可以是野生型细胞或其突变体。
[0167]“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。
[0168]
在一方面，亲本丝状真菌细胞是枝顶孢霉属(acremonium)、伞菌属(agaricus)、链格孢属(alternaria)、曲霉属、短梗霉属(aureobasidium)、葡萄座腔菌属(botryospaeria)、拟蜡菌属(ceriporiopsis)、毛喙壳属(chaetomidium)、金孢子菌属(chrysosporium)、麦角菌属(claviceps)、旋孢腔菌属(cochliobolus)、鬼伞属(coprinopsis)、乳白蚁属(coptotermes)、棒囊壳属(corynascus)、隐丛赤壳菌属(cryphonectria)、隐球菌属(cryptococcus)、色二孢属(diplodia)、黑耳属(exidia)、线黑粉酵母属(filibasidium)、镰孢属(fusarium)、赤霉属(gibberella)、全鞭毛虫属
(holomastigotoides)、腐质霉属(humicola)、耙齿菌属(irpex)、香菇属(lentinula)、小腔球菌属(leptospaeria)、梨孢菌属(magnaporthe)、黑果菌属(melanocarpus)、亚灰树花菌属、毛霉属(mucor)、毁丝霉属(myceliophthora)、新美鞭菌属(neocallimastix)、链孢菌属(neurospora)、拟青霉属(paecilomyces)、青霉菌属、平革菌属(phanerochaete)、瘤胃壶菌属(piromyces)、poitrasia、假黑盘菌属(pseudoplectania)、假披发虫属(pseudotrichonympha)、根毛霉属(rhizomucor)、裂褶菌属(schizophyllum)、柱顶孢属(scytalidium)、篮状菌属(talaromyces)、嗜热子囊菌属(thermoascus)、梭孢壳霉属(thielavia)、弯颈霉属(tolypocladium)、木霉属(trichoderma)、长毛盘菌属(trichophaea)、轮枝孢属(verticillium)、小包脚菇属(volvariella)、或炭角菌属(xylaria)细胞。
[0169]
在实施例中，亲本丝状真菌细胞是解纤维枝顶孢霉(acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、臭曲霉(aspergillus foetidus)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、日本曲霉(aspergillus japonicus)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金孢子菌(chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(fusarium cerealis)、库威镰孢(fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(fusarium culmorum)、禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)、禾赤镰孢(fusarium graminum)、异孢镰孢(fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、多枝镰孢(fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(fusarium roseum)、接骨木镰孢(fusarium sambucinum)、肤色镰孢(fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(fusarium sulphureum)、圆镰孢(fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(fusarium venenatum)、灰腐质霉(humicola grisea)、特异腐质霉(humicola insolens)、疏棉状腐质霉(humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(irpex lacteus)、米黑毛霉(mucor miehei)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、绳状青霉菌(penicillium funiculosum)、产紫青霉(penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)、埃默森篮状菌(talaromyces emersonii)、无色梭孢壳(thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(thielavia australeinsis)、粪梭孢壳(thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(thielavia peruviana)、毛梭孢壳(thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(thielavia terrestris)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、康宁木霉(trichoderma koningii)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(trichoderma reesei)、或绿色木霉
(trichoderma viride)细胞。
[0170]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是嗜热毁丝霉细胞。
[0171]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是埃默森篮状菌细胞。
[0172]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是哈茨木霉细胞。
[0173]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是康宁木霉细胞。
[0174]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是长枝木霉细胞。
[0175]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是里氏木霉细胞。
[0176]
在另一个实施例中，亲本丝状真菌细胞是绿色木霉细胞。
[0177]
在优选的实施例中，亲本里氏木霉细胞是里氏木霉rut-c30。
[0178]
在另一个优选的实施例中，亲本里氏木霉细胞是里氏木霉的突变体。
[0179]
在另一个优选的实施例中，亲本里氏木霉细胞是里氏木霉的形态突变体(参见wo 97/26330)。
[0180]
在另一个优选的实施例中，亲本里氏木霉细胞是里氏木霉的蛋白酶缺陷突变体(参见wo 2011/075677)。
[0181]
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其他分类学等同物，例如无性型，而与它们已知的物种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
[0182]
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh，dsmz)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureau voor schimmelcultures，cbs)、和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(agricultural research service patent culture collection,northern regional research center，nrrl)。
[0183]
突变体丝状真菌细胞
[0184]
可通过使用本领域熟知的方法减少或消除(使失活)编码rho-gtp酶raca蛋白的基因的表达来构建在rho-gtp酶raca蛋白的产生方面存在缺陷的突变体丝状真菌细胞。可以修饰该基因的一部分，如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的此类控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为更弱的启动子以减少编码序列的表达。
[0185]
可以通过基因缺失技术来构建突变体丝状真菌细胞，以减少或消除这些基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而减少或消除其表达。在此类方法中，使用已经构建为邻接地含有侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。
[0186]
也可以通过任何rna指导的dna内切核酸酶使用，例如，mad7(美国专利9,982,279)、mad2(美国专利9,982,279)、cas9(doudna等人,2014,science[科学]346:1258096)、“死”cas9(dcas9；qi等人,2013,cell[细胞]152(5):1173)、cas9切口酶(satomura等人2017,sci.rep.[科学报告]7(1):2095)、或cpf1内切核酸酶(zetsche等人2015,cell[细胞]163(3):759)(通过适当地设计的指导rna被引导至基因的核苷酸序列)来构建突变体丝状真菌细胞。
[0187]
还可以通过引入、取代和/或缺失该基因或为其转录或翻译所需的其控制序列中的一个或多个核苷酸来构建突变体丝状真菌细胞。例如，可以插入或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或pcr产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如botstein和shortle,1985,science[科学]229:4719；lo等人,1985,proceedings of the national academy of sciences usa[美国国家科学院院刊]81:2285；higuchi等人,1988,nucleic acids research[核酸研究]16:7351；shimada,1996,meth.mol.biol.[分子生物学方法]57:157；ho等人,1989,gene[基因]77:61；horton等人,1989,gene[基因]77:61；以及sarkar和sommer,1990,biotechniques[生物技术]8:404。
[0188]
还可以通过基因破坏技术，通过将破坏性核酸构建体插入进该基因中而构建突变体丝状真菌细胞，该破坏性核酸构建体包括与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体dna。这样的基因破坏可以消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定含有破坏的基因的转化体。
[0189]
还可以通过基因转化过程构建突变体丝状真菌细胞(参见例如，iglesias和trautner,1983,molecular general genetics[分子普通遗传学]189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进丝状真菌细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包含用于选择含有缺陷基因的转化体的标记可以是令人希望的。
[0190]
还可以使用与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列，通过已建立的反义技术构建突变体丝状真菌细胞(parish和stoker,1997,fems microbiology letters[fems微生物学快报]154:151-157)。更确切而言，可以通过引入与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列来减少或消除该基因的表达，该核苷酸序列可以在该细胞中转录并且能够与在该细胞中产生的mrna杂交。由此在允许互补反义核苷酸序列与mrna杂交的条件下，减少或消除翻译的蛋白的量。
[0191]
还可以通过已确立的rna干扰(rnai)技术来构建突变体丝状真菌细胞(参见，例如wo 2005/056772和wo 2008/080017)。
[0192]
可以使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变)，通过随机或特异诱变进一步构建突变体丝状真菌细胞(参见，例如hopwood,the isolation of mutants in methods in microbiology[微生物学方法中的突变体分离](j.r.norris和d.w.ribbons,编辑)第363-433页,academic press[学术出版社],纽约,1970)。可以通过使亲本细胞经受诱变并筛选其中该基因的表达已经失活的突变体细胞来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使dna序列经受pcr产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。
[0193]
适合本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(uv)照射，羟胺，n-甲基-n'-硝基-n-亚硝基胍(mnng)，n-甲基-n'-亚硝基胍(ntg)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(ems)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并选择展现出该基因的减少表达
或无表达的突变体来进行的。
[0194]
编码rho-gtp酶raca蛋白的基因的表达减少或消除可由本领域普通技术人员通过熟知的方式，例如，定量实时pcr(qrt-pcr)、rna印迹杂交、使用cdna或寡核苷酸阵列杂交(oligo array hybridization)的全局基因表达谱(global gene expression profiling)、或深度rna测序(rna-seq)分析选择的mrna或转录水平来测量。可替代地，编码本发明的rho-gtp酶raca蛋白的基因的修饰可以通过使用如本文所述的基因座特异性引物的真菌孢子pcr来确定。
[0195]
在一方面，当在相同条件下培养时，与未经修饰的亲本丝状真菌细胞相比，该突变体在rho-gtp酶raca蛋白的产生方面存在部分缺陷。在优选的方面，当在相同条件下培养时，该突变体产生比未经修饰的亲本丝状真菌细胞至少少25％、更优选地至少少50％、甚至更优选地至少少75％、和最优选地至少少95％的rho-gtp酶raca蛋白。
[0196]
在另一方面，当在相同条件下培养时，与未经修饰的亲本丝状真菌细胞相比，该突变体在rho-gtp酶raca蛋白的产生方面存在完全缺陷。换句话说，编码rho-gtp酶raca蛋白的基因失活(例如基因的缺失、破坏等)。
[0197]
可以使用如本文所述的本领域标准方法将编码gtp酶ras2变体的多核苷酸引入具有经修饰的rho-gtp酶raca基因的突变体丝状真菌细胞中。
[0198]
核酸构建体
[0199]
本发明还涉及包含编码本发明的目的多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在本发明的突变体丝状真菌细胞中表达。
[0200]
多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供目的多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0201]
控制序列可以是启动子、由本发明的突变体丝状真菌细胞识别的多核苷酸，用于表达编码目的多肽的多核苷酸。启动子包含介导目的多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在突变体细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与突变体细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0202]
用于指导核酸构建体在突变体丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo 00/56900)、镶片镰孢daria(wo 00/56900)、镶片镰孢quinn(wo 00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及na2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米
曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
[0203]
控制序列还可以是由突变体丝状真菌宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码目的多肽的多核苷酸的3'末端。在本发明的突变体丝状真菌宿主细胞中起作用的任何终止子都可以使用。
[0204]
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。
[0205]
控制序列也可以是前导序列，即对突变体丝状真菌宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码目的多肽的多核苷酸的5'末端。在突变体丝状真菌宿主细胞中起作用的任何前导序列都可以使用。
[0206]
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
[0207]
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由突变体丝状真菌宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mrna的信号的序列。在突变体丝状真菌宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。
[0208]
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0209]
控制序列还可以是编码与目的多肽的n末端连接的信号肽并指导目的多肽进入细胞的分泌通路的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码目的多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’末端可以包含对编码序列是外源(异源)的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强目的多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达的目的多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0210]
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0211]
控制序列还可以是编码位于目的多肽n末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性目的多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：嗜热毁丝霉漆酶(wo 95/33836)、和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0212]
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻目的多肽的n末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的n末端。
[0213]
还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的目的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶i启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶ii启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码目的多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
[0214]
表达载体
[0215]
本发明还涉及重组表达载体，这些重组表达载体包含编码目的多肽的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码目的多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0216]
重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
[0217]
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。
[0218]
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
[0219]
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adea(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeb(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adea、adeb、amds、hpt、和pyrg基因。
[0220]
选择性标记可以是如wo 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hpt-tk双选择性标记系统。
[0221]
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
[0222]
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码目的多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以
含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
[0223]
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0224]
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人,1991,gene[基因]98:61-67；cullen等人,1987,nucleic acids res.[核酸研究]15:9163-9175；wo 00/24883)。可根据wo 00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
[0225]
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入宿主细胞中以增加目的多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的提高的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
[0226]
用于连接本文所述的元件以构建重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，j.sambrook,e.f.fritsch,和t.maniatis,1989,molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第2版,冷泉港,纽约)。
[0227]
载体可以通过例如转化引入该丝状真菌细胞中，这样使得该载体被维持为染色体整合体或被维持为自主复制的染色体外载体。通常认为整合是有利的，因为核苷酸序列更有可能稳定地保持在细胞中。通过同源重组、非同源重组或转座将载体整合入染色体中。
[0228]
将表达载体引入丝状真菌细胞中可能涉及由原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生组成的以本身已知的方式进行的程序。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：ep 238023,yelton等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及christensen等人,1988,bio/technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由malardier等人,1989,gene[基因]78:147-156和wo 96/00787描述。
[0229]
产生目的多肽的方法
[0230]
本发明还涉及产生目的多肽的方法，该方法包括(a)培养本发明的突变体丝状真菌细胞用于产生该目的多肽，并且任选地(b)回收该目的多肽。
[0231]
使用本领域已知的方法在适合于产生该多肽的营养培养基中培养突变体丝状真菌细胞。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养丝状真菌细胞，该培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的
组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
[0232]
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该目的多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
[0233]
可以使用以上方法测量突变体丝状真菌细胞的目的多肽的生产力的提高。可以通过熟知的方式，例如，定量实时pcr(qrt-pcr)、rna印迹杂交、使用cdna或寡核苷酸阵列杂交的全局基因表达谱、或深度rna测序(rna-seq)分析选择的mrna或转录水平来确定编码目的多肽的基因的表达的增加。
[0234]
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的全发酵液。
[0235]
可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或提取(参见例如，protein purification[蛋白质纯化],janson和ryden编辑,vch publishers[vch出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
[0236]
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
[0237]
实例
[0238]
菌株
[0239]
里氏木霉菌株btr213描述于wo 2013/086633中。
[0240]
里氏木霉菌株o44n7j是btr213衍生菌株，其表达异源烟曲霉纤维二糖水解酶i和烟曲霉β-葡糖苷酶基因。
[0241]
培养基和溶液
[0242]
cove2板由以下构成：30g的蔗糖、20ml的cove盐溶液、10ml的1m乙酰胺、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升。
[0243]
cove盐溶液由以下构成：26g的kcl、26g的mgso4·
7h2o、76g的kh2po4、50ml的cove痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
[0244]
cove痕量金属溶液由以下构成：0.04g的na2b4o7·
10h2o、0.4g的cuso4·
5h2o、1.2g的feso4·
7h2o、0.7g的mnso4·
h2o、0.8g的na2moo2·
2h2o、10g的znso4·
7h2o、以及去离子水补足至1升。
[0245]
发酵分批培养基由以下构成：15.1g的右旋糖、40g的大豆粉、8g的(nh4)2so4、3g的k2hpo4、8g的k2so4、3g的caco3、8g的mgso4·
7h2o、1g的柠檬酸h2o、5.2ml的85％磷酸、1ml的消泡剂、14.7ml的痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。痕量金属溶液由以下构成：26.1g的feso4·
7h2o、5.5g的znso4·
7h2o、6.6g的mnso4·
h2o、2.6g的cuso4·
5h2o、2g的柠檬酸h2o、以及去离子水补足至1升。
[0246]
lb amp培养基由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、50mg的
biolabs inc.))将原型间隔子克隆到bgl ii消化的pgmer263中。质粒pgmer263含有直肠真杆菌(eubacterium rectale)mad7蛋白编码序列(pgmer263中的核苷酸9663-13,478)并经密码子优化以用于在黑曲霉中使用，以及在直肠真杆菌mad7开放阅读框的3'端处的sv40核定位信号(nls；核苷酸13,455-13,478)以确保mad7被定位至细胞核。直肠真杆菌mad7的表达在来自pfc330-333的构巢曲霉tef1启动子(核苷酸8777-9662)和终止子(核苷酸13,479-13,883)的控制之下(等人,2015,plos one[公共科学图书馆
·
综合]10(7):1-18)。
[0263]
质粒pgmer263还具有用于单指导rna(sgrna)表达的所有元件，其由以下组成：稻梨孢菌u6-2启动子(核苷酸7949-8448)、结构trna下游区域被去除的烟曲霉trnagly(gcc)1-6序列(核苷酸8449-8539)、直肠真杆菌单指导rna序列(核苷酸8540-8560)、bgl ii限制酶识别序列(核苷酸8557-8562)和稻梨孢菌u6-2终止子(核苷酸8562-8776)。
[0264]
为了在里氏木霉中进行选择，质粒pgmer263含有来自pht1的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因(cummings等人,1999,curr.genet.[当代遗传学]36:371)(核苷酸6475-7506)从而赋予对潮霉素b的抗性，以及在曲霉属中的自主维持(ama1)序列(gems等人,1991,gene[基因]98:61-67)(核苷酸332-6056)用于pgmer263在里氏木霉中进行染色体外复制。潮霉素抗性基因(cds核苷酸6475-7506)受灰盖鬼伞β-微管蛋白启动子(核苷酸6082-6474)和终止子(核苷酸7503-7929)的转录控制。使用染料-终止子化学法(giesecke等人,1992,j.virol.methods[病毒学方法杂志]38(1):47-60)，用377xl型号自动dna测序仪(应用生物系统公司(applied biosystems inc.))通过dna测序确认了pgmer263中的单指导rna和mad7-sv40 nls表达元件。
[0265]
实例3：pgmer263-raca-proto3的构建
[0266]
质粒载体制备。用限制酶bgl ii(anza
tm 19bgl ii，赛默飞世尔科技公司)消化质粒pgmer263。限制反应物包含15μg的pgmer263质粒dna、1x anza
tm
缓冲液、100个单位的bgl ii和无菌milli-q水，最终体积达200μl。将反应物在37℃下孵育3小时。在限制酶消化后，在tbe缓冲液中对消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶上切除代表消化的pgmer263的条带并根据制造商的说明使用凝胶和pcr清理试剂盒(马歇雷-纳格尔公司(macherey-nagel))进行纯化。
[0267]
原型间隔子设计。通过在里氏木霉raca基因中找到具有序列tttv(其中v代表核苷酸a、c或g)的适当的原型间隔子相邻基序(pam)来选择原型间隔子。一旦鉴定出适当的pam位点，就选择紧邻pam位点3'侧的二十一个碱基对作为原型间隔子。拒绝含有多于三个连续t核苷酸的原型间隔子，以避免rna聚合酶的可能卡壳。将紧邻pam tttc的二十一个碱基对的原型间隔子(鉴定为raca-proto3(seq id no:4))设计用于里氏木霉raca基因的基因座，以将mad7酶引导至位于raca基因第三外显子的3’端的靶位点，并产生双链断裂。
[0268]
raca-proto3：
[0269]
cccggagagtacatcccgacc(seq id no:4)
[0270]
由赛默飞世尔科技公司将延伸序列如下所示(寡核苷酸1229348，seq id no:5)的原型间隔子合成为单链寡核苷酸。寡核苷酸中的加下划线序列突出了二十一个核苷酸的原型间隔子。将原型间隔子寡核苷酸稀释至最终工作浓度为1μm。
[0271]
寡核苷酸1229348：
[0272]
attcacggatgatgcaggaatttctactcttgtagatcccggagagtacatcccgacctttttttggc
tcttgggttcgaactgcccaaggccca(seq id no:5)
[0273]
寡核苷酸1229348中紧邻原型间隔子raca-proto3区域的序列分别代表与bgl ii线性化质粒pgmer263同源的5’和3’区域。需要此类同源区域将原型间隔子raca-proto3克隆到质粒pgmer263中，从而产生功能性mad7指导rna表达盒，靶向raca基因。
[0274]
原型间隔子的组装。使用总体积为10μl的hifi dna组装预混合液试剂盒(新英格兰生物实验室公司)将原型间隔子raca-proto3克隆到bgl ii线性化pgmer263中，该试剂盒由以下构成：1xhifi组装预混合液(新英格兰生物实验室公司)、0.05pmol的bgl ii消化的pgmer263、1.0μl的原型间隔子寡核苷酸1229348(1μm)和无菌milli-q水，最终体积达20μl。将反应在50℃下孵育15分钟，然后置于冰上。使用2μl的组装反应物根据制造商的说明来转化50μl的stellar
tm
化学感受态大肠杆菌细胞(克罗泰克实验室公司(clontech laboratories))。将每种转化反应物涂布到两个2xyt amp板上，并且在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用qiaprep spin miniprep试剂盒(凯杰公司(qiagen inc.))从每种转化体菌落中制备质粒dna并通过使用如下所示引物1228659(seq id no:6)测序来筛选所需原型间隔子的插入。将具有正确原型间隔子序列的质粒命名为pgmer263-raca-proto3(seq id no:7，图2)。
[0275]
引物1228659：
[0276]
cttgcttgtcaagcaatggc(seq id no:6)
[0277]
实例4：使里氏木霉中raca基因失活所需的双链寡核苷酸供体dna的设计
[0278]
为了使用crispr/mad7质粒pgmer263-raca-proto3通过mad7基因组编辑使里氏木霉中的raca基因(seq id no:1)失活，赛默飞世尔科技公司合成了如下所示的反向和互补单链寡核苷酸1229227和1229228。
[0279]
寡核苷酸1229227：
[0280]
ttttgcgcagacctgtcttctcatctcgtacacgaccaattaatgatgttagtttcgcctcccgatatgacacaaccaactctggctcgcgaata(seq id no:8)
[0281]
寡核苷酸1229228：
[0282]
tattcgcgagccagagttggttgtgtcatatcgggaggcgaaactaacatcattaat
[0283]
tggtcgtgtacgagatgagaagacaggtctgcgcaaaa(seq id no:9)
[0284]
1229227和1229228寡核苷酸通过在c1000 touch
tm
型号热循环仪(伯乐实验室有限公司)中在98℃下孵育5分钟进行退火，然后进行在室温下缓慢冷却步骤。所得双链寡核苷酸命名为raca-9227/9228，用于修复由质粒pgmer263-raca-proto3中编码的grna引导至里氏木霉宿主raca基因座的mad7内切核酸酶产生的双链切口。raca基因座基因组编辑使得pam tttc基序(4个核苷酸)缺失，原型间隔子区(21个核苷酸)缺失，位置32处新增第一终止密码子taa，并产生orf移码，这使得在基因的下游部分引入了许多另外的终止密码子。
[0285]
实例5：pgmer263-ras2g16v-proto的构建
[0286]
将质粒pgmer263用作骨架载体，构建用于修饰里氏木霉ras2基因的质粒pgmer263-ras2g16v-proto(针对dna序列为seq id no:10，针对推导的氨基酸序列为seq id no:11)。
[0287]
质粒载体制备。用限制酶bgl ii消化质粒pgmer263。限制反应物包含15μg的pgmer263质粒dna、1x anza
tm
缓冲液、100个单位的bgl ii和无菌milli-q水，最终体积达200
technologies)合成了如下所示的反向和互补单链寡核苷酸ras2g16-供体f和ras2g16-供体r。
[0300]
寡核苷酸ras2g16-供体f：
[0301]
ggtcgctcctcaaccgctgactctttgcgcccatcatggcaggaaggatggtgctgtacaagctggtggtgctgggagacgttggtgtcggtaagacggccctgaccatccagctgtgcctgcagcacttcgtcgagacg(seq id no:16)
[0302]
寡核苷酸ras2g16-供体r：
[0303]
cgtctcgacgaagtgctgcaggcacagctggatggtcagggccgtcttaccgacaccaacgtctcccagcaccaccagcttgtacagcaccatccttcctgccatgatgggcgcaaagagtcagcggttgaggagcgacc(seq id no:17)
[0304]
这两个反向和互补单链寡核苷酸ras2g16-供体f和ras2g16-供体r通过在touch
tm
热循环仪中在98℃下孵育5分钟进行退火，然后进行在室温下缓慢冷却步骤。所得双链寡核苷酸命名为ras2
g16v-供体，用于修复由质粒pgmer263-ras2
g16v-proto中编码的grna引导至里氏木霉宿主ras2基因座的mad7内切核酸酶产生的双链切口。ras2基因座基因组编辑使得插入点突变g47t，引起氨基酸变化g16v(位置16处的甘氨酸变为缬氨酸)。此外，在ras2 cds的5'端还引入了三个沉默突变，特别是核苷酸6由g变为a，核苷酸9由c变为a，且核苷酸12由a变为g。这三个沉默突变都包含在ras2
g16v-proto区域中，且一旦在位置47处引入所需的snv，这三个沉默突变就可以帮助避免mad7基因组重新切割(针对突变体ras2
g16v
基因的dna序列为seq id no:18，针对ras2
g16v
变体的推导氨基酸序列为seq id no:19)。
[0305]
实例7：pgmer2630raca-proto3、pgmer263-ras2g16v-proto和双链供体寡核苷酸的共转化
[0306]
本实验的目的是以单独和组合的方式通过mad7基因组编辑将raca基因失活和ras2
g16v
变体引入到里氏木霉中，以评估对纤维素酶表达的影响。pgmer263-raca-proto3和pgmer263-ras2g16v-proto质粒是表达mad7的自主复制质粒(包含ama1)，mad7是一种分别靶向里氏木霉中raca基因座和ras2基因座的特定序列的sgrna构建体和一种hpt选择标记(潮霉素b抗性)。相应的供体dna片段是raca-9227/9228(实例4)和ras2
g16v-供体(实例6)，它们被用作双链寡核苷酸。供体dna raca-9227/9228与mad7质粒pgmer263-raca-proto3组合使用，用taa终止密码子替换了raca基因座的pam和原型间隔子区，产生了导致raca基因失活的有意移码。供体dna ras2-供体与mad7质粒pgmer263-ras2g16v-proto组合使用，通过用氨基酸缬氨酸替换位置16处的氨基酸甘氨酸修饰了ras2蛋白氨基酸序列，使ras2基因在纤维素酶表达诱导条件下具有组成型活性。
[0307]
将质粒pgmer263-raca-proto3、pgmer263-ras2g16v-proto、供体dna raca-9227/9228、和供体dna ras2-供体共转化到里氏木霉btr213宿主菌株o44n7j中，该菌株表达异源烟曲霉纤维二糖水解酶i基因和烟曲霉β-葡糖苷酶基因。将o44n7j原生质体在冰上解冻。对于每次转化，将大约2μg的质粒dna和6μl的每种双链供体dna分子(50μm)添加至100μl解冻的原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应物混合并在34℃下孵育30分钟。在转化后，将1ml的stc添加至每种转化反应物中，并且将内容物涂布在pda 1m蔗糖板上并在37℃下孵育过夜。第二天，添加pda 潮霉素b覆盖物至最终浓度为10μg/ml潮霉素b，并且将板在30℃下孵育5-7天。每次转化获得大约15-20个转化体。为了确定编辑频
inc.))上使用2x 150bp化学法进行测序。用clc genomics workbench 11.0.1版本(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。对于每个样品，使用样品读段模块对100,000个修剪的读段采样。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至raca和ras2经编辑基因座的模型。总体上，85％-96％的读段被成功地映射，从而产生100％的模型覆盖率。用基本变体检测(basic variant detection)模块分析了突变的编辑和转移，并在所有突变体菌株中都证实了所需的基因组变化。
[0325]
实例9：rac/ras突变体里氏木霉菌株的表型评估
[0326]
使单突变体里氏木霉o83e59、单突变体里氏木霉o83e58、双突变体里氏木霉o838xe和亲本里氏木霉菌株o44n7j在cove2琼脂板上生长，并记录表型变化。亲本菌株里氏木霉o44n7j在cove2板上表现出特有的里氏木霉表型：大量产孢和菌丝体生长蔓延到整个板表面。单突变体o83e58(ras2
g16v
变体)出现大量产孢，但菌丝体生长未达到板边缘。单突变体里氏木霉o83e59(raca敲除)产孢减少，且生长仅限于板的中间。双突变体里氏木霉o838xe表现出最极端的表型变化，其大量产孢，但菌丝体生长严重受限，仅限于板的中心。
[0327]
实例10：补料分批发酵
[0328]
突变体里氏木霉菌株o83e59、o83e58、和o838xe以及亲本里氏木霉菌株o44n7j在3升补料分批发酵中进行了至少一次测试，以评估菌株性能和蛋白质表达水平。
[0329]
菌株各自在pda板上在28℃下生长5-9天。将各自含有100ml针对每种菌株的摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自各pda板的两个塞子接种。在26℃，将摇瓶在定轨摇床上在250rpm下孵育48小时。将这些培养物用作种子，以用于更大规模发酵。
[0330]
使用共160ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的欧谱生物技术公司(applikon biotechnology)3升玻璃夹套发酵罐。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用欧谱控制系统将ph控制在3.85 /-0.25的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加到容器中，并用以1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由右旋糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至18g/小时的速率，基于溶解氧控制的斜升，给予163小时。从每个发酵罐中每天取1ml样品，离心，并储存于-20℃。
[0331]
实例11：对发酵样品进行的测定
[0332]
将来自实例10的样品提交用于总蛋白测定和β-葡糖苷酶测定，以评估引入的突变是否有益于里氏木霉在3升补料分批发酵中的性能。
[0333]
总蛋白测定。使用10dg脱盐柱(伯乐实验室有限公司)对第7天的发酵样品进行脱盐并将缓冲液交换为50mm乙酸钠-100mm nacl，ph 5.0。脱盐后，使用gallery分析仪(赛默科技公司)对酶组合物的蛋白浓度进行确定。将培养物在水中适当稀释。将白蛋白标准品(牛血清白蛋白；bsa)在水中连续稀释至0.66mg/ml至0.087mg/ml的浓度范围。将总共20μl的每种稀释液(包括标准品在内)转移到含有200μl二辛可宁酸(bca)底物溶液(pierce bca蛋白测定试剂盒；赛默科技公司)的比色皿中，然后在37℃下孵育30分钟。孵育完成后，测量每个样品在540nm处的光密度。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。
[0334]
图4以“箱线图”表示示出了每个菌株相对于第7天总蛋白值的比较。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0335]
基于图4所示的比较，里氏木霉菌株o838xe产生的总蛋白显著高于亲本里氏木霉
菌株o44n7j，而里氏木霉菌株o83e58和o83e59与亲本菌株没有显著差异。与里氏木霉菌株o838xe与亲本里氏木霉菌株o44n7j的这种比较相关的p值为0.0009。平均而言，总蛋白增加了9.2％。
[0336]
β-葡糖苷酶测定。在0.1m琥珀酸盐、0.01％x-100缓冲液ph5.0(样品缓冲液)中适当稀释第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天样品，随后将稀释样品从0倍系列稀释至1/3倍至1/9倍。通过将β-葡糖苷酶标准品稀释至每毫升0.2至0.01纤维二糖酶生物量单位(生物量)(cbu(b))的范围来制备标准曲线。一个cbu(b)是在下面定义的条件下，以纤维二糖为底物，每分钟释放2μmol葡萄糖的酶量。将总共20μl的每种稀释液转移至96孔平底板中。将在0.1m琥珀酸盐ph 5.0缓冲溶液中的二百微升的1mg/ml对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷底物添加到每个孔中，然后在环境温度下孵育45分钟。孵育期结束后，每孔添加50μl淬灭溶液(1mtris缓冲液，ph 9)。针对96孔板在光密度为405nm下测量端点。通过从生成的标准曲线外推来确定样品活性。
[0337]
图5以“箱线图”表示示出了每个菌株相对于第7天β-葡糖苷酶活性值的比较。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0338]
基于图5所示的比较，里氏木霉菌株o838xe产生的β-葡糖苷酶活性显著高于亲本里氏木霉菌株o44n7j，而里氏木霉菌株o83e58和o83e59与亲本菌株没有显著差异。与里氏木霉菌株o838xe与亲本里氏木霉菌株o44n7j的这种比较相关的p值为0.0187。平均而言，β-葡糖苷酶活性增加了32.5％。
[0339]
粘度下降和总补料。图6以“箱线图”表示示出了每个菌株相对于总补料(发酵运行中使用的总补料克数)的比较。黑色箱是第7天的发酵数据。黑色箱代表数据样本在第一和第三四分位数之间的分布。中间的白线代表中值。
[0340]
基于图6所示的比较，里氏木霉菌株o838xe使用的总补料显著高于亲本里氏木霉菌株o44n7j，而里氏木霉菌株o83e58和o83e59与亲本菌株没有显著差异。与里氏木霉菌株o838xe与亲本里氏木霉菌株o44n7j的这种比较相关的p值为0.0005。平均而言，总补料增加了16.1％。由于发酵是使用基于溶解氧斜升的补料曲线运行的，所以总补料实际上是粘度的指标。当粘度下降时，到发酵罐中的氧转移会更好，并且可以向发酵罐中添加更多的补料。当粘度上升时，氧转移会更差，因此总补料会下降。由于里氏木霉菌株o838xe的总补料更高，因此粘度更低。
[0341]
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