一种氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上残留检测方法

1.本发明涉及一种氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上残留检测方法，属于农药残留检测技术领域。


背景技术：

2.人参(panax ginseng c.a.mey)，是五加科多年生草本植物。在中国，人参历来被视为百草之王，滋补上品。人参提取物是从五加科植物人参的根、茎叶中提取精制而成，其富含十八种人参单体皂甙，主要适用于冠心病、心绞痛、心率过缓或过快、室性早博、血压失调、神经衰弱、更年期综合症、疲劳过度，病后、产后或术后身体虚弱等症状；久服可以延年益寿，并能增强体力，治疗癌症患者因放疗和化疗引起的免疫功能低下等症，同时还具有增强人体表面细胞的活力，抑制衰老等作用。近些年来，人参提取物出口成逐年增长之势，而欧美等国对进口的人参提取物的农残限量把控的很严。
3.氟吡菌胺，化学名：2,6-二氯-n-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺，是一种吡唑酰胺类广谱杀菌剂，能从植物叶基向叶尖方向传导，该药保护性好、渗透性强，对卵菌真纲菌病害有较高的生物活性，其代谢产物主要是2,6-二氯苯甲酰胺。研究表明，氟吡菌胺可以用于防治人参根茎腐烂病、黑斑病等。
[0004]
氰霜唑，化学名：4-氯-2-氰基-n,n-二甲基-5-对甲苯基咪唑-1-磺酰胺，为线粒体呼吸抑制剂，对卵菌所有生长阶段均有抑制作用，对霜霉病、疫病、根肿病、猝倒病等有特效，其代谢产物主要是4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈，研究表明，氰霜唑可以防治人参疫病。
[0005]
目前，我国正在进行氟吡菌胺防治人参腐烂病、黑斑病的正式登记，氰霜唑正在进行防治人参疫病的探索，急需提供氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上安全使用的技术支持。欧盟规定氟吡菌胺在人参中的mrl是7mg/kg，氰霜唑是0.05mg/kg；美国规定氰霜唑在人参中的mrl是0.3mg/kg，到目前为止还未有在人参中同时检测氟吡菌胺及代谢物2,6-二氯苯甲酰胺，氰霜唑及其代谢物4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的残留方法的报道。本发明首次建立了人参中氟吡菌胺及其代谢物2,6-二氯苯甲酰胺，氰霜唑及其代谢物4-氯-5-(4-甲苯基)
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1h-咪唑-2-腈的残留量分析方法，为其在人参上的风险评估及其安全使用研究提供检测依据。


技术实现要素：

[0006]
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上残留检测方法。该方法改良了quechers前处理技术，结合超高效液相色谱-质谱联用仪 (ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，uplc-ms/ms)，建立了一套同时检测人参中药材中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的残留检测方法，该方法前处理过程快速简单，仪器分析灵敏度好，方法准确度高，可为开展氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上的风险评估及
其安全使用研究提供检测依据。
[0007]
本发明的技术方案是：一种氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物在人参上残留检测方法，其特征是，
[0008]
1)前处理
[0009]
将干人参加入提取液(乙腈：水：乙酸＝79：20：1)进行提取后，取上清液，加入柠檬酸钠、氯化钠、psa和c18进行分散固相萃取(quechers)，然后高速离心，取上清液，加水稀释，过滤，得到待测液；
[0010]
2)检测
[0011]
以acquity uplc beh c18为色谱柱，采用超高效液相色谱-质谱联用仪对人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈共4种目标化合物的残留进行定量。
[0012]
上述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：acquity uplc beh c18，2.1
×
50mm, i.d.1.7μm；柱温：40℃；进样体积：2.0μl；流动相a：水(0.1％甲酸)，流动相b：甲醇(0.1％甲酸)；流速：0.3ml/min；梯度洗脱，洗脱程序如下表1。
[0013]
上述超高效液相色谱-质谱联用仪的质谱条件为：离子源：电喷雾电离源(esi

)；干燥气温度(gas temp)：130℃；干燥气流量(gas flow)：11l/min；雾化器压力(nebulizer)： 25psi；鞘气温度(sheath gas temp)：400℃；鞘气流量(sheath gas flow)：12l/min；毛细管电压(capilary)：3500v；喷嘴电压(nozzle voltage)：500v(正离子)；扫描模式：正离子扫描；监测模式：多反应监测(mrm)；定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)和扫描模式如表2所示。
[0014]
优选的，所述步骤1)的提取和分散固相萃取均采用涡旋震荡的方式。
[0015]
优选的，所述步骤1)的前处理步骤如下：称取1.0g粉碎后的干人参于塑料离心管中，加入10ml提取液(乙腈：水：乙酸＝79：20：1)，涡旋震荡5min后，取上清液5ml，加入柠檬酸钠0.1g，氯化钠2g，psa 0.1g，c18 0.1g，涡旋振荡5min后静置30min，4000r/min 高速离心5min后，取1ml上清液，加入1ml水，涡旋振荡30s，过0.22μm的有机滤膜，上机备用。
[0016]
进一步的，本发明采用基质匹配的标准溶液曲线对4种目标化合物进行定量。
[0017]
本发明的技术效果是：
[0018]
1、经试验证明，改良后的quechers法(样品经提取液(乙腈：水：乙酸＝79：20：1) 提取，采用psa和c18净化处理)是检测人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑、4
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氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2腈残留量的最佳预处理方法。同时为减少溶剂效应，提取完上清液加入1：1的水，可以获得更好的峰形。
[0019]
2、经试验证明，采用acquity uplc beh c18为色谱柱，以水(0.1％甲酸)和甲醇(0.1％甲酸)作为流动相，4种目标化合物的峰形好，灵敏度高。
[0020]
3、试验证明：氟吡菌胺在人参中回收率为74％～104％，测定相对标准偏差为7.3％～8.7％； 2,6-二氯苯甲酰胺在人参中的回收率为86％～119％，测定相对标准偏差为1.7％～8.0％；氰霜唑在人参中回收率为74％～102％，测定相对标准偏差为4.6％～10.0％；4-氯-5-(4-甲苯基)-1h
‑ꢀ
咪唑-2腈在人参中的回收率为74％～106％，测定相对标准偏差为8.4％～10.8％；回收率的rsd 均符合精密度要求。
[0021]
4、本发明的方法前处理过程快速简单，仪器分析灵敏度好，方法准确度高，可用于
人参中药材中氟吡菌胺、氰霜唑及其代谢物残留的检测分析。
附图说明
[0022]
图1为氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的基质标准曲线；其中，a图：2,6-二氯苯甲酰胺的基质标准曲线；b图：氟吡菌胺的基质标准曲线；c图：氰霜唑的基质标准曲线；d图：4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2腈的基质标准曲线；
[0023]
图2为氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的总离子色谱图；其中a图：总定量离子色谱图(b～e)(0.01mg/l)；b图：2,6-二氯苯甲酰胺的定量离子峰色谱图；c图：4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的定量离子峰色谱图；d 图：氟吡菌胺的定量离子峰色谱图；e图：氰霜唑的定量离子峰色谱图。
[0024]
图3为吸附剂用量筛选试验结果，其中系列1-5分别为表8的实验组1-5。
具体实施方式
[0025]
以下结合实施例和附图来说明其效果。
[0026]
实施例1
[0027]
1材料和方法
[0028]
1.1材料和试剂
[0029]
甲醇(色谱纯，美国飞世尔科技公司)；水(纯净水，杭州哇哈哈集团有限公司)；甲酸(色谱纯，阿沙埃莎(天津)化学有限公司)；氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国飞世尔科技公司)；乙酸胺(色谱纯，美国飞世尔科技公司)。乙二胺-n-丙基硅烷(psa，40～60μm，)填料(天津博纳艾杰尔公司)；cleanertods c18固相萃取柱(c18，40～60μm，)填料(天津博纳艾杰尔公司)；speedtesttm活性炭(gcb， 120-400目)填料(北京美正检测技术有限公司)；copure quechers clean-up kit(900mgmgso4 150mg psa 15mg gcb)净化管(深圳逗点生物技术有限公司)；wglabs quechers (900mg mgso4 150mg psa)净化管(美国wg-labs公司)；wglabs quechers(900mgmgso4 150mg psa 150mg c18)净化管(美国wg-labs公司)。
[0030]
氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑、4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈标准品购自 first standard公司(天津，中国)。氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑贮备原液(1000mg/l)， 4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈(0.1g)保存于-18℃。
[0031]
1.2仪器
[0032]
超高效液相色谱系统：agilent 1290infinityⅱ(安捷伦公司)；三重四级杆串联质谱仪： agilent 6470(安捷伦公司)，配esi源；多管式漩涡混合器：tboys multi-tubevortexer std 230v；超声波清洗器：kq-500b(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平电子天平(万分之一)：tp-a500(华志(福建)电子科技有限公司)；离心机：tdz5-ws(湘仪离心机仪器有限公司)；高速万能粉碎机：fw-100型(北京永光明医疗仪器有限公司)； yp097(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；氮吹仪：efaa-dc24型(上海安谱实验科技股份有限公司)；微孔滤膜(混合膜，0.22μm，美国pall公司)。
[0033]
1.3标准溶液配制
[0034]
氟吡菌胺标准曲线工作液：使用刻度吸量管移取适量标准溶液至10ml容量瓶中，用乙腈溶解稀释成100mg/l储备液；将100mg/l储备液依次梯度配置成10mg/l、1mg/l中间液，中间液依次梯度配制成不同浓度的标准工作液。
[0035]
2,6-二氯苯甲酰胺标准曲线工作液：使用刻度吸量管移取适量标准溶液至10ml容量瓶中，用甲醇溶解稀释成100mg/l储备液；将100mg/l储备液依次梯度配置成10mg/l、1mg/l 中间液，中间液依次梯度配制成不同浓度的标准工作液。
[0036]
氰霜唑标准曲线工作液：使用刻度吸量管移取适量标准溶液至10ml容量瓶中，用乙腈溶解稀释成100mg/l储备液；将100mg/l储备液依次梯度配置成10mg/l、1mg/l中间液，中间液依次梯度配制成不同浓度的标准工作液。
[0037]
4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈标准曲线工作液：准确称取0.01g(精确到0.0001)4
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氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈标准品粉末至50ml的小烧杯中，用乙腈溶解并转移至10ml 容量瓶中，用乙腈稀释配制成1000.00mg/l、100.00mg/l、10.00mg/l储备液；将100mg/l 储备液依次梯度配置成10mg/l、1mg/l中间液，中间液依次梯度配制成不同浓度的标准工作液。
[0038]
2检测步骤
[0039]
2.1前处理步骤
[0040]
2.1.1人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的提取和净化
[0041]
称取1.0g粉碎后的干人参于50ml塑料离心管中，加入10ml提取液(乙腈：水：乙酸＝79：20：1)，涡旋震荡5min后。取上清液5ml，加入柠檬酸钠0.1g，氯化钠2g，psa 0.1g， c18 0.1g，涡旋振荡5min后静置30min，4000r/min高速离心5min后。取1ml上清液，加入1ml水，涡旋振荡30s，过0.22μm的有机滤膜，得到待测液上机备用。
[0042]
2.2液相色谱测定条件
[0043]
色谱柱：acquity uplc beh c18，2.1
×
50mm，i.d.1.7μm；
[0044]
柱温：40℃；
[0045]
进样体积：2.0μl；
[0046]
流动相a：水(0.1％甲酸)，流动相b：甲醇(0.1％甲酸)；流速：0.3ml/min；梯度洗脱，洗脱程序如下表1。
[0047]
表1梯度洗脱程序
[0048]
时间(min)a(％)b(％)流速(ml/min)0.0090100.3001.0090100.3003.5010900.3004.0010900.3005.0090100.300
[0049]
2.3质谱测定条件
[0050]
离子源：电喷雾电离源(esi

)；
[0051]
干燥气温度(gas temp)：130℃；
[0052]
干燥气流量(gas flow)：11l/min；
[0053]
雾化器压力(nebulizer)：25psi；
[0054]
鞘气温度(sheath gas temp)：400℃；
[0055]
鞘气流量(sheath gas flow)：12l/min；
[0056]
毛细管电压(capilary)：3500v；
[0057]
喷嘴电压(nozzle voltage)：500v(正离子)；
[0058]
扫描模式：正离子扫描；
[0059]
监测模式：多反应监测(mrm)；
[0060]
其他质谱条件如下：
[0061]
表2质谱条件
[0062][0063]
4检测方法确证
[0064]
4.1添加回收率及精密度试验
[0065]
依据农业行业标准“农作物中农药残留试验准则”(ny/t 788-2018)要求，本试验设计了三个添加水平。在人参空白基质中添加氟吡菌胺0.01mg/kg、0.1mg/kg、7.0mg/kg三档浓度回收，添加2,6-二氯苯甲酰胺0.01mg/kg、0.1mg/kg、7.0mg/kg三档浓度回收，添加氰霜唑 0.01mg/kg、0.05mg/kg、1.0mg/kg三档浓度回收，添加4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈 0.01mg/kg、0.05mg/kg、1.0mg/kg三档浓度回收，每档重复5次，用上述检测步骤进行分析测定回收率，结果如表3-6所示。
[0066]
表3人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑、4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈的添加回收率
[0067][0068][0069]
试验结果表明，氟吡菌胺在人参中回收率为74％～104％，测定相对标准偏差为 7.3％～8.7％；2,6-二氯苯甲酰胺在人参中的回收率为86％～119％，测定相对标准偏差为 1.7％～8.0％；氰霜唑在人参中回收率为74％～102％，测定相对标准偏差为4.6％～10.0％；4-氯
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5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2腈在人参中的回收率为74％～106％，测定相对标准偏差为 8.4％～10.8％；回收率的rsd均符合精密度要求。
[0070]
4.2标准曲线
[0071]
分别将氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈标准溶液用人参空白基质溶液和溶剂分别稀释，配制成0.001mg/l、0.01mg/l、0.05mg/l、0.1 mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l系列标准工作溶液，在上述液相色谱/质谱条件下进行测定，以氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈标准溶液浓度与定量监测离子峰面积做标准曲线，试验结果见表4和图1，其线性相关系数均大于0.999，线性范围为0.001～1mg/l，定量限为0.0001～0.001mg/kg(根据仪器自带软件十倍信噪比s/n得出定量限)。
[0072]
表4化合物在人参中的线性方程、线性范围、定量限及基质效应
[0073][0074]
4.3基质效应
[0075]
利用uplc-ms/ms检测过程中，由样品基质成分引起的基质效应常见且难以避免。基质成分的存在可以增强或抑制分析物在电离过程中的响应，因此可能干扰定量，产生错误的结果。在本研究中，按下列公式计算基质效应(me)，当me》0时为基质增强效应，反之为基质减弱效应。
[0076][0077]
式中：sm为基质匹配标准溶液曲线斜率；ss为溶剂标准溶液曲线斜率。
[0078]
氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4-氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2-腈在人参中均表现为基质减弱效应(表7)，为减少基质效应对方法准确度的影响，采用基质匹配标准曲线定量来消除基质效应造成的影响。
[0079]
5结果与讨论
[0080]
5.1样品前处理方法的优化
[0081]
本发明采用提取液1(乙腈：水＝2：1)、提取液2(乙腈：水：甲酸＝79：20：1)、提取液3(乙腈：水：乙酸＝79：20：1)分别提取。
[0082]
因为是人参是干粉，需要加入适量水进行浸湿，之后用乙腈提取，用这种方法同时提取四种化合物，发现氰霜唑和它的代谢物回收率低(小于70％)，这可能是氰霜唑和它的代谢物在酸性溶液下更容易溶解；用提取液1提取，氟吡菌胺和它的代谢物回收率低(氟吡菌胺 35％，2,6-二氯苯甲酰胺42％)，这可能氟吡菌胺和它的代谢物更容易溶于酸性溶液；用提取液2提取，氟吡菌胺和它的代谢物回收率有所上升(氟吡菌胺55％，2,6-二氯苯甲酰胺64％)，但是仍然不能达满足要求(70％～120％)，这可能氟吡菌胺和它的代谢物在浓度较强的酸性溶液中不稳定；采用提取液3，并且加入少量柠檬酸钠，四种目标化合物回收率都能满足要求(70％～110％)，柠檬酸钠作为缓冲剂，利于氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺的提取。实验证明：改良后的quechers法是检测人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑、4-氯-5-(4
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甲苯基)-1h-咪唑-2腈残留量的最佳预处理方法。同时为减少溶剂效应，提取完上清液加入 1：1的水，可以获得更好的峰形。
[0083]
在样品前处理的研究中，对于不同基质的样品一般选用quechers提取方法，试验通过比较涡旋振荡法、超声波法和匀浆法提取人参中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、氰霜唑和4
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氯-5-(4-甲苯基)-1h-咪唑-2腈的回收率发现，三者的回收率均在90％左右，但由于匀浆过程中需要反复清洗刀头，操作过程复杂，且易产生交叉污染。超声跟涡旋振荡虽不存
0.1g，涡旋振荡5min后静置30min，4000r/min高速离心5min后，取1ml上清液，加入1ml水，涡旋振荡30s，过0.22μm的有机滤膜，得到待测液上机备用。
[0094]
2)将获得的待测液，采用超高效液相色谱-质谱联用仪，在实施例1的2.2和2.3的色谱条件和质谱条件下进行检测，获得4种目标化合物的定量监测离子峰面积，根据标准曲线获得试样溶液中4种目标化合物浓度，进一步计算出试样中农药残留量。
[0095]
检测结果发现，5份中药材样品中4种农药残留均未检出。