一种提高乌菜同源四倍体诱导率及乌菜倍性鉴定的方法与流程

1.本发明涉及蔬菜化控领域，尤其涉及一种提高乌菜同源四倍体诱导率及乌菜倍性鉴定的方法。


背景技术：

2.乌菜(brassica campestris l.ssp.chinensis var.rosularis tsen et lee)，别名乌塌菜、黑菜、塌棵菜等，是属于十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种。其性耐寒，不耐高温，主要在秋冬季节我国长江流域广泛种植，尤其经霜雪后味甜鲜美而有“雪下乌菜赛羊肉”的美称，深受消费者的喜爱。到目前为止，对乌菜的育种通常采用常规的传统杂交育种技术，但常规育种不仅费时费力，并且许多优良性状无法通过此方法进行改良。倍性育种正日益成为一种提供理想性状的多倍体植物并提高其对非生物胁迫耐受性的有效方法。因此，利用多倍体育种手段创建新种质，丰富种质资源，培育优产、高质、抗逆性强的新品种已然成为迫切需要。
3.目前，利用秋水仙素诱导多倍体是一种常见的倍性育种方式，且已取得显著成果，但仍存在着死亡率高、诱变率低的缺点。同时，由于国内外对乌菜多倍体种质资源的研究较少，目前鉴定乌菜多倍体的技术也不够完善。因此，目前迫切需要摸索探究出一种能提高乌菜同源四倍体诱导率的方法以及能够对诱导出的乌菜四倍体进行倍性鉴定的方法。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高乌菜同源四倍体诱导率及乌菜倍性鉴定的方法。
5.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
6.一种提高乌菜同源四倍体诱导率的方法，包括如下步骤：
7.(1)对二倍体乌菜种子进行温水浸种催芽处理；
8.(2)待种皮胀破露白后，将种子浸泡在秋水仙素-吐温80混合液中1h进行诱变处理，每天处理2次，连续处理1～3天；诱变处理后，用清水冲洗4～5遍；其中，所述秋水仙素-吐温80混合液中，秋水仙素的质量分数为0.1％～0.3％，吐温80的质量分数为0.5％～1.5％；
9.(3)将处理完的乌菜种子播种于穴盘中育苗。
10.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选取的乌菜种子为外形饱满、大小均匀。
11.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，对二倍体乌菜种子进行温水浸种催芽处理的时间为12h。
12.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，秋水仙素-吐温80混合液的秋水仙素质量分数具体为0.1％，吐温80质量分数为1％；将种子浸泡在所述秋水仙素-吐温80混合液中1h进行诱变处理，每天处理2次，连续处理2天。
13.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，每天上午7点和下午5点各诱变处理一次。
14.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，在育苗期间控制环境温度，使幼苗生长白天温度24～28℃，夜温18～22℃，光周期为14h光照/10h黑暗，光照强度300μmol
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，相对湿度70％～80％。
15.作为本发明的优选方式之一，还包括步骤(4)，对获得的乌菜植株进行倍性鉴定。
16.一种乌菜倍性鉴定方法，采用该方法对上述方法获得的乌菜同源四倍体植株进行倍性鉴定，具体步骤如下：
17.(1)形态学鉴定：
18.以“生长缓慢、叶色加深、叶片增厚、花器官外观增大”这些外观表型特征为选择标准，对培养的各乌菜植株进行初步筛选，获得初步筛选疑似四倍体乌菜；
19.(2)光合测定：
20.对初步筛选的疑似四倍体乌菜，分别使用便携式光合测定仪测定其在不同光强下的单位叶面积下的净光合速率；以二倍体乌菜植株的测定结果为对照，当所述初步筛选的疑似四倍体乌菜净光合速率显著高于二倍体乌菜植株时，获得经二次筛选的疑似四倍体乌菜；
21.(3)流式细胞术鉴定：
22.称量出二次筛选的疑似四倍体乌菜新鲜叶片0.2～0.3g，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入2ml解离液，使整个叶片全部浸没在解离液中，使细胞核能充分解离；接着，用单面刀片切成长条状，切碎后吸取培养皿中的解离液，以使叶片中的细胞核进入解离液，再加入3ml的解离液进行稀释；最后，加入碘化丙啶染色液，避光染色2小时，再将滤液移置流式细胞试管中，上机测定。
23.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，在晴天上午9点至11点，分别使用便携式光合测定仪测定不同光强下的单位叶面积下的净光合速率，每次测3片叶片，重复三次。
24.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，解离液的配方为：20mmol
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mgso4·
7h2o，100mmol
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kcl，10mmol
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hepes，体积分数为0.5％triton-x，2％pvp。
25.设计思路及原理：
26.秋水仙素，最初从百合科植株秋水仙中提取出来，能够有效抑制有丝分裂，使染色体加倍，但目前市面上利用秋水仙素诱导多倍体死亡率高，诱变率较低；吐温80是一种非离子型表面活性剂，具有良好的乳化增溶作用和较强的亲水性，外添加吐温80可以增加药剂成分溶解度，从而提高植物组织的渗透性，使药物容易进入植物细胞，使加倍效果提高。
27.本发明相比现有技术的优点在于：
28.(1)本发明填补了国内外乌菜多倍体育种的空白，提供了一种操作简单、方法有效的乌菜同源四倍体诱变方法，创制出了优质、高产的乌菜四倍体新种质；
29.(2)本发明对乌菜倍性鉴定的方法也进行改良，在形态学鉴定中增加了一种通过测定叶片净光合速率的方法，能够更为准确的初步筛选疑似四倍体乌菜，减少后续鉴定工作量；进一步摸索出了流式细胞术鉴定乌菜四倍体的体系，使得操作简单，出峰迅速，为大规模高效的鉴定提供了基础与依据。
附图说明
30.图1是实施例4中二倍体乌菜与四倍体乌菜的植株、叶片和花瓣差异对比(图中，a表示植株，b表示叶片、c表示花瓣)；
31.图2是实施例4中二倍体乌菜与四倍体乌菜植株叶片光合作用的光响应曲线图；
32.图3是实施例4中二倍体乌菜与四倍体乌菜的dna相对含量曲线图。
具体实施方式
33.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
34.实施例1
35.本实施例的一种提高乌菜同源四倍体诱导率的方法，包括如下步骤：
36.(1)选取外形饱满、大小均匀的二倍体乌菜种子，温水浸种催芽12h。
37.(2)待种皮胀破露白后，将种子浸泡在秋水仙素-吐温80混合液中1h进行诱变处理，每天上午7点和下午5点各诱变处理一次，连续处理3天，每次处理100粒种子；诱变处理后，用清水冲洗4～5遍，避免药剂残留对种子的毒害作用以及对环境的污染；其中，所述秋水仙素-吐温80混合液中，秋水仙素的质量分数为0.2％，吐温80的质量分数为1.5％。
38.(3)擦干水分后，将处理完的乌菜种子播种于72孔穴盘中育苗；在育苗期间控制环境温度，晴天光照强需加盖遮阳网，避免阳光直射，使幼苗生长白天温度24℃，夜温18℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol
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，相对湿度70％，避免湿度过大导致幼苗徒长。
39.(4)待乌菜植株长出4～5片真叶后，对其进行倍性鉴定。
40.实施例2
41.本实施例的一种提高乌菜同源四倍体诱导率的方法，包括如下步骤：
42.(1)选取外形饱满、大小均匀的二倍体乌菜种子，温水浸种催芽12h。
43.(2)待种皮胀破露白后，将种子浸泡在秋水仙素-吐温80混合液中1h进行诱变处理，每天上午7点和下午5点各诱变处理一次，处理1天，每次处理100粒种子；诱变处理后，用清水冲洗4～5遍，避免药剂残留对种子的毒害作用以及对环境的污染；其中，所述秋水仙素-吐温80混合液中，秋水仙素的质量分数为0.3％，吐温80的质量分数为0.5％。
44.(3)擦干水分后，将处理完的乌菜种子播种于72孔穴盘中育苗；在育苗期间控制环境温度，晴天光照强需加盖遮阳网，避免阳光直射，使幼苗生长白天温度28℃，夜温22℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol
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，相对湿度80％，避免湿度过大导致幼苗徒长。
45.(4)待乌菜植株长出4～5片真叶后，对其进行倍性鉴定。
46.实施例3
47.本实施例的一种提高乌菜同源四倍体诱导率的方法，包括如下步骤：
48.(1)选取外形饱满、大小均匀的二倍体乌菜种子，温水浸种催芽12h。
49.(2)待种皮胀破露白后，将种子浸泡在秋水仙素-吐温80混合液中1h进行诱变处理，每天上午7点和下午5点各诱变处理一次，连续处理2天，每次处理100粒种子；诱变处理
后，用清水冲洗4～5遍，避免药剂残留对种子的毒害作用以及对环境的污染；其中，所述秋水仙素-吐温80混合液中，秋水仙素的质量分数为0.1％，吐温80的质量分数为1％。
50.(3)擦干水分后，将处理完的乌菜种子播种于72孔穴盘中育苗；在育苗期间控制环境温度，晴天光照强需加盖遮阳网，避免阳光直射，使幼苗生长白天温度26℃，夜温20℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol
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，相对湿度75％，避免湿度过大导致幼苗徒长。
51.(4)待乌菜植株长出4～5片真叶后，对其进行倍性鉴定。
52.实施例4
53.本实施例的一种乌菜倍性鉴定方法(以实施例3获得的乌菜植株为例)：
54.一、形态学鉴定
55.待被处理乌菜植株长大后，对其进行形态学鉴定，初步筛选疑似四倍体乌菜。如图1所示，四倍体植株在外观上主要表现在生长缓慢、叶色加深、叶片增厚、花器官等植株外观巨大等明显变异(以二倍体植株为对照)，以这些外观表型特征为选择标准，将变异植株筛选出来，可获得初步筛选疑似四倍体乌菜。依据上述形态学变异，从存活的株乌菜植株中初步筛选得到疑似变异植株278。
56.二、光合测定
57.对初步筛选的疑似四倍体乌菜，在晴天上午9点至11点，分别使用便携式光合测定仪测定其在不同光强下的单位叶面积下的净光合速率，每次测3片叶片，重复三次，获得的结果如图2所示。图2结果表明四倍体植株的光合特性更强，净光合速率高于二倍体。由测定的光合指标，进一步从278株植株中筛选出93株疑似四倍体乌菜，提高了形态学初步鉴定四倍体乌菜的准确度，缩小后续鉴定数量。
58.三、流式细胞术鉴定
59.称量出初步筛选出的四倍体乌菜新鲜叶片0.2～0.3g，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入2ml解离液(20mmol
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7h2o，100mmol
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kcl，10mmol
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hepes，体积分数为0.5％triton-x，2％pvp)，整个叶片全部浸没在解离液中，使细胞核能充分解离；用单面刀片切成长条状，每个样品在切碎时用的刀片、镊子必须酒精消毒，并用干净的纸擦拭干净，以防止相互影响；切碎后吸取培养皿中的解离液，以使叶片中的细胞核进入解离液，再加入3ml的解离液进行稀释(依据制备的染液溶度而定，如果颜色较深，浓度过高，则需要解离液稀释多次)；最后，加入碘化丙啶染色液，避光染色2h后，滤液移置流式细胞试管中，用流式细胞仪对植株dna含量进行分析(以二倍体植株为对照)。
60.分析结果如图3可知，纵坐标代表测定细胞数的相对值，横坐标代表荧光的通道值，峰值的位置可以反应植株的倍性，发现二倍体dna相对含量的主峰值在200处，四倍体dna相对含量的主峰值在400处，为二倍体的两倍。
61.实施例5
62.本实施例用以验证“不同秋水仙素、吐温80诱变浓度”以及“不同诱变处理次数”对乌菜同源四倍体诱导结果的影响：
63.试验方法：选取外形饱满、大小均匀的“7-2”乌菜种子为试验材料，温水浸种催芽12h。待种皮胀破露白后，分别浸没在秋水仙素(质量分数分别为0.1％、0.2％、0.3％)和吐温80(质量分数分别为0、0.5％、1％、1.5％)混合液中，浸泡1h，每天上午7点和下午5点各处
理一次，连续处理1d、2d、3d，每次处理100粒种子。待用药剂浸泡结束后用清水冲洗4～5遍，避免药剂残留对种子的毒害作用以及对环境的污染。擦干水分后，将处理完的乌菜种子播种于72孔穴盘中育苗，在育苗期间控制环境温度，晴天光照强需加盖遮阳网，避免阳光直射，使幼苗生长白天温度26℃，夜温20℃，光周期为14h/10h(光照/黑暗)，光照强度300μmol
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，相对湿度75％。待乌菜植株长出4～5片真叶后，采用实施例4乌菜倍性鉴定方法对其进行倍性鉴定。
64.存活率(％)＝(存活植株数/处理植株数)
×
100；
65.变异率(％)＝(变异植株数/处理植株数)
×
100；
66.加倍率(％)＝(四倍体植株数/处理植株数)
×
100。
67.试验结果：不同秋水仙素浓度、不同诱变处理次数下的乌菜同源四倍体诱导结果如表1所示，不同秋水仙素与吐温80浓度、不同诱变处理次数下的乌菜同源四倍体诱导结果如表2所示。
68.表1不同秋水仙素浓度、不同处理次数下的乌菜四倍体诱导结果
[0069][0070]
由表1可知，不同秋水仙素浓度(0.1％、0.2％、0.3％)、不同处理次数(2、4、6次)对应条件下，虽然均可获得同源四倍体乌菜，但其加倍效果不同。在药剂浓度低，处理次数少的情况下，存活率虽然高，但加倍效果差。在药剂浓度过高，处理次数多的情况下，不仅存活率低，存活株数的加倍率也不高。在一定范围，随着秋水仙素浓度和处理次数的增加，乌菜存活率和加倍率均上升，但当浓度达到0.2％并且处理次数过长时，存活率与变异率反而开始明显降低，这可能使因为秋水仙素的毒害对乌菜种子造成的影响过大，导致种子发芽率
低，幼苗存活率下降。其诱变效果，因处理次数长短和秋水仙素浓度的不同而异。从表1中可以看出，最佳的秋水仙素处理浓度为0.2％，处理次数为6次，此条件下，乌菜植株加倍率达到最大，为5.78％，可获得最佳的诱变效果。
[0071]
表2不同秋水仙素与吐温80浓度、不同处理次数下的乌菜四倍体诱导结果
[0072]
[0073][0074]
结合表1和表2可知，单纯使用秋水仙素处理乌菜，染色体的加倍效果很低，而添加吐温80可以增加药剂成分溶解度，从而提高植株组织的渗透性。由表2可知，施用吐温80能够有效促进秋水仙素进入植物细胞，从而可以缩短处理时间，提高加倍效果；并且当吐温80浓度为1％，秋水仙素浓度为0.1％，处理4次即达到最大的加倍率。这样在使用秋水仙素处理植株时，外施吐温80就可以降低秋水仙素浓度与使用次数，减少它对植株的毒害作用，反而能提高植株的变异率与加倍率，具有较好的效果。
[0075]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。