抗湿免疫检测玻纤探针制备方法、抗湿保护液及其制备方法与流程

1.本发明涉及医疗器械领域，尤其是抗湿免疫检测玻纤探针制备方法、抗湿保护液及其制备方法。


背景技术：

2.硅烷偶联剂是四大常用有机硅产品(硅油、硅橡胶、硅树脂和硅烷偶联剂)中的一种，其主要应用于玻璃纤维等基质表面的处理和改性、酶或者蛋白质在玻璃质表面的固定化、无机填料填充剂、密封剂和增粘剂等。硅烷偶联剂种类有上百种，其一般结构式：y-r-six3，其中y为活性有机官能团，如氨基、环氧基、巯基等，r为饱和或者不饱和脂肪族碳链骨架，x为硅原子结合的特性基团，如甲氧基、氯基、乙氧基、乙酰氧基等，其可以连接玻璃纤维等基质表面。
3.硅烷偶联剂作为玻璃纤维等无机基质表面的改性剂时，在无机粒子表面键入疏水性的基团从而使其表面性质发生变化，表面能降低，疏水性显著提高，水接触角可以做到》100o。而由于硅烷偶联剂本身包含有机基团,酶或者蛋白质等既可以通过其表面的疏水性而物理吸附在玻璃纤维等无机基质表面，也能通过有机基团共价偶联到其表面，实现酶类或者蛋白质类的固定化。
4.但是在实际使用中发现，硅烷偶联剂作为玻璃纤维等无机基质表面的改性剂时，确实能够大大增强其表面的疏水性，但其长期储存的环境需要密闭的干燥环境，即使在普通的湿度环境也会逐渐水解硅烷偶联剂，并进一步影响固定化后的蛋白或者酶类在玻璃纤维等基质表面的固定化和活性。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种抗湿免疫检测玻纤探针制备方法、抗湿保护液及其制备方法。
6.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
7.抗湿免疫检测玻纤探针制备方法，包括如下步骤：
8.s10,在玻纤探针表面沉积硅烷偶联剂；
9.s20,准备进行玻纤探针包被所需的磷酸盐缓冲溶液、抗体或抗原溶液、封闭液、清洗液及抗湿保护液；所述抗湿保护液包括表面活性剂、稳定剂、防腐剂、ph值调节剂及纯化水；
10.s30,将所述玻纤探针上沉积有硅烷偶联剂的区域依次浸入所述磷酸盐缓冲溶液、抗体或抗原溶液、封闭液、第一清洗液、第二清洗液及抗湿保护液中一定时间完成抗原或抗体包被；
11.s40,将完成包被的玻纤探针烘干，得到抗湿免疫检测玻纤探针。
12.优选的，所述的加工方法中，所述抗湿保护液包括0.01％～0.1％(v/v)的表面活性剂、0.01％～0.1％(v/v)防腐剂、1％～20％(m/v)的稳定剂及0.01～0.1m的缓冲液。
13.优选的，所述的加工方法中，所述表面活性剂是曲拉通x-100、曲拉通x-405及吐温-20中的至少一种；
14.优选的，所述的加工方法中，所述稳定剂是海藻糖、甘露醇、蔗糖中的至少一种。
15.优选的，所述的加工方法中，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或mes缓冲液。
16.优选的，所述的加工方法中，所述s30中，在玻纤探针浸入到任一液体中时，通过晃动台使承装有液体的容器及固定玻纤探针的托架晃动。
17.优选的，所述的加工方法中，所述玻纤探针在抗湿缓冲液中停留时间在20-40秒之间。
18.抗湿保护液，包括0.01％～0.1％(v/v)的表面活性剂、0.01％～0.1％(v/v)防腐剂、1％～20％(m/v)的稳定剂及0.01～0.1m的缓冲液。
19.优选的，所述抗湿保护液中，所述表面活性剂是曲拉通x-100、曲拉通x-405及吐温-20中的至少一种。
20.优选的，所述抗湿保护液中，所述稳定剂是海藻糖、甘露醇、蔗糖中的至少一种。
21.优选的，所述抗湿保护液中，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或mes缓冲液。
22.优选的，所述抗湿保护液中，所述抗湿保护液的ph值在4.0～6.5之间。
23.抗湿保护液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
24.s1,按照配方准备相应量的蔗糖、冰醋酸、吐温-20、防腐剂、纯化水及氢氧化钠溶液；
25.s2,将蔗糖置于容器中，加入冰醋酸、吐温-20、防腐剂，然后加纯化水至指定体积得到混合物；
26.s3,通过磁力搅拌器对s2得到混合物进行搅拌；
27.s4，向经过搅拌的混合液中添加氢氧化钠溶液以将混合液的ph调节至目标范围后，定容至目标体积得到抗湿保护液。
28.本发明技术方案的优点主要体现在：
29.本发明的玻纤探针在通过硅烷偶联剂改性后，在进行包被时，通过将固定有抗原或抗体的玻纤探针浸入抗湿保护液后烘干，从而可以使包被后的玻纤探针的抗湿性能大大提高，显著延长了通过硅烷偶联剂固定于玻纤探针表面的抗原或抗体对湿度抵抗的时间，使得抗原或抗体的活性寿命显著延长，有效保证了检测的可靠性。
30.本发明制备得到的测试探针有效降低了对生产环境及储存环境的湿度控制要求，有利于产品的生产、储存、运输及使用。
31.本发明的测试探针便于批量进行生成制造，可以进行规模化量产及使用。
32.本发明的抗湿保护液通过对组分、用量的研究并进行设计从而能够使得抗湿保护液具有最佳的效用，且本方案的抗湿保护液易于制备，便于推广应用。
附图说明
33.图1是本发明中利用测试探针进行免疫测试反应的原理图；
34.图2是本发明中经实施例1的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行免疫测试的检测荧光信号的对比图；
35.图3是本发明中经实施例2的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行
免疫测试的检测荧光信号的对比图；
36.图4是本发明中经实施例3的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行免疫测试的检测荧光信号的对比图。
具体实施方式
37.本发明的目的、优点和特点，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行图示和解释。这些实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
38.在方案的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“纯化水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。并且，在方案的描述中，以操作人员为参照，靠近操作者的方向为近端，远离操作者的方向为远端。
39.下面对本发明揭示的抗湿免疫检测玻纤探针制备方法进行详细阐述，其包括如下步骤：
40.s10,在玻纤探针表面沉积硅烷偶联剂；
41.s20,准备进行玻纤探针包被所需的磷酸盐缓冲溶液、抗体或抗原溶液、封闭液、清洗液及抗湿保护液；
42.s30,将所述玻纤探针上沉积有硅烷偶联剂的区域依次浸入所述磷酸盐缓冲溶液、抗体或抗原溶液、封闭液、第一清洗液、第二清洗液及抗湿保护液中一定时间完成抗原或抗体包被；
43.s40,将完成包被的玻纤探针烘干，得到抗湿免疫检测玻纤探针。
44.本发明的测试探针在通过硅烷偶联剂进行表面改性后，在包被过程中，增加了浸入抗湿保护液的过程，从而在测试探针烘干后，显著延长了通过硅烷偶联剂固定与玻璃纤维类基质表面的抗原或抗体对湿度抵抗的时间，使得抗原或抗体的活性寿命显著延长。
45.所述玻纤探针例如是20mm*ф1mm的纯石英探针，通过已知的气相沉积方法在所述纯石英探针的表面均匀沉积硅烷偶联剂，所述硅烷偶联剂例如是3-氨基丙基三甲氧基硅烷，其提高了探针表面的疏水性，从而可以更高效的吸附蛋白类物质，并且表面的氨基(nh2)可以作为共价偶联的有机基团与蛋白进行共价偶联。
46.所述抗原或抗体原液以降钙素原(pct)抗体溶液为例，其浓度为20ug/ml。
47.所述封闭液可以是已知的可行材料，例如是bsa封闭液，此处不作限定。所述第一清洗液、第二清洗液可以是已知的可行材料，例如是pbst溶液，此处不作限定。
48.所述抗湿保护液可以采用已知的材料。本发明中，所述抗湿保护液包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂及防腐剂。更具体的，所述抗湿保护液包括0.01％～0.1％(v/v)的表面活性剂、0.01％～0.1％(v/v)防腐剂、1％～20％(m/v)的稳定剂及0.01～0.1m的缓冲液。
49.其中，所述缓冲液主要用于保证该体系的ph值，使其具有一定的酸性，从而抗湿保护液中带正电荷，以此保护硅烷偶联剂中的有机基团(如氨基、巯基等)不会被中和或者水解。所述缓冲液可以是醋酸-醋酸钠缓冲液或mes缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。
50.所述醋酸-醋酸钠缓冲液使所述抗湿保护液的ph值保持在4.0～6.5左右，这是由于发明人研究发现：ph值超过6.5时，会导致硅烷类粘合剂水解或者被中和，从而导致其表面失去疏水性，无法固定蛋白等物质；而ph值低于4.0时，则会导致酸性过强，固定的蛋白类物质被变性从而失活。同时，在ph值较低时，例如ph值在大于4.0，小于5.5时，醋酸-醋酸钠缓冲液缓冲能力更强，可以更好抵抗大部分样品、空气或者水分等的干扰。
51.所述表面活性剂主要是为了降低玻纤探针表面的张力，在玻纤探针表面形成束胶，对胶束内部的憎水基团产生保护作用，避免固定化的酶类或者蛋白类物质变性。较优的，所述表面活性剂是曲拉通x-100、曲拉通x-405及吐温-20中的至少一种，较优为吐温-20，其能够增加亲水性，阻止非特异结合，发明人经过研究发现，当所述吐温-20过少则无法起到抵抗非特异的作用，其过多则会影响蛋白质之间结合。
52.所述稳定剂主要是为了使固定化的酶类或者蛋白类物质可以保持相对稳定，不会因为表面的处理措施而变性或者失活。所述稳定剂是海藻糖、甘露醇、蔗糖中的至少一种，优选是蔗糖，这是由于相比之下，蔗糖水溶性和稳定性更好，并且会在基质表面形成涂层隔绝空气，从而保护和硅烷粘合剂结合的蛋白类物质，防止被空气氧化变性。
53.按照较优的配方进行抗湿保护液配置，其配置过程如下：
54.s1,按照配方准备相应量的蔗糖、冰醋酸、吐温-20、防腐剂、纯化水及氢氧化钠溶液；
55.s2,将蔗糖置于容器中，加入冰醋酸、吐温-20、防腐剂，然后加纯化水至指定体积得到混合物；
56.s3,通过磁力搅拌器对s2得到混合物进行搅拌；
57.s4，向经过搅拌的混合液中添加氢氧化钠溶液以将混合液的ph调节至目标范围后，定容至目标体积得到抗湿保护液。
58.在各种所需材料准备到位后，对所述玻纤探针进行包被处理，对应的，所述s30包括如下步骤：
59.将上述的沉积有硅烷偶联剂的玻纤探针安装到探针托架中，玻纤探针在探针托架上的分布形式与96孔板的孔分布形式和孔间距一致。
60.将包被用的磷酸盐缓冲溶液，pct抗体溶液，封闭液，第一清洗液、第二清洗液及抗湿保护液分别按照250ul分装至96孔板内。
61.将装有磷酸盐缓冲溶液的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的磷酸盐缓冲溶液中，晃动台以设定的速度晃动第一目标时间，所述第一目标时间可以根据需要设计，例如10秒。
62.晃动台晃动第一目标时间后，从晃动台上取下探针托架及装有磷酸盐缓冲溶液的96孔板；将装有pct抗体溶液的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的磷酸盐缓冲溶液中，晃动台以设定的速度晃动第二目标时间，所述第二目标时间可以根据需要设计，此处优选在170-200秒之间，较优的在180秒左右。
63.晃动台晃动第二目标时间后，从晃动台上取下探针托架及装有pct抗体溶液的96孔板；将装有封闭液的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的封闭液中，晃动台以设定的速度晃动第三目标时间，所
述第三目标时间可以根据需要设计，此处优选在60秒左右。
64.晃动台晃动第三目标时间后，从晃动台上取下探针托架及装有封闭液的96孔板；将装有第一清洗液(pbst溶液)的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的第一清洗液中，晃动台以设定的速度晃动第四目标时间，所述第四目标时间可以根据需要设计，此处优选在10秒左右。
65.晃动台晃动第四目标时间后，从晃动台上取下探针托架及装有第一清洗液的96孔板；将装有第二清洗液(pbst溶液)的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的第二清洗液中，晃动台以设定的速度晃动第四目标时间，所述第四目标时间可以根据需要设计，此处优选在10秒左右。
66.晃动台晃动第五目标时间后，从晃动台上取下探针托架及装有第二清洗液的96孔板；将装有抗湿保护液的96孔板固定在晃动台上，将探针托架固定在晃动台上，并使探针托架上的玻纤探针浸没到所述96孔板的抗湿保护液中，晃动台以设定的速度晃动第六目标时间，所述第六目标时间可以根据需要设计，此处优选在20-40秒之间，更优为30秒，处理完毕后，将探针托架从晃动台上取下。
67.烘干时，将测试探针从探针托架上取出，在40℃温度条件下烘干4小时左右，烘干可以在烘干箱内进行。
68.下面结合具体实施例来分析本发明的抗湿保护液的配方：
69.在以下实施例中涉及到的试剂有：
70.蔗糖，纯度》98％，可以采用sigma品牌的相应产品；
71.吐温-20，可以采用sigma品牌的相应产品；
72.冰醋酸，纯度》99.9995％，采用国药集团生产的相应产品；
73.氢氧化钠溶液，纯度》96％，可以采用ar，国药集团生产的相应产品；
74.proclin300(防腐剂)，可以采用sigma品牌的相应产品。
75.实施例1
76.以配制1l抗湿保护液为例，其具体的组分及含量如下表：
77.组分名称含量蔗糖150g冰醋酸6ml吐温-200.5mlproclin3000.5ml氢氧化钠溶液调节ph至指定范围纯化水定容至1l
78.具体配置时，其过程如下：
79.用电子天平称取150g蔗糖，放入烧杯中；
80.向烧杯中加入6ml冰醋酸，0.5ml吐温-20，0.5ml的proclin300，然后加纯化水至900ml得到混合物,
81.通过磁力搅拌器将混合物搅拌混匀后，用10n的naoh溶液调节ph至相应范围,用容量瓶定容至1l后，得到所述抗湿保护液。
82.实施例2
83.以配制1l抗湿保护液为例，其具体的组分及含量如下表：
84.组分名称含量蔗糖200g冰醋酸3ml吐温-201mlproclin3001ml氢氧化钠溶液调节ph至指定范围纯化水定容至1l
85.实施例2的抗湿保护液的制备过程同上述实施例1，此处不作赘述。
86.实施例3
87.以配制1l抗湿保护液为例，其具体的组分及含量如下表：
88.组分名称含量蔗糖50g冰醋酸1.5ml吐温-200.1mlproclin3000.1ml氢氧化钠溶液调节ph至指定范围纯化水定容至1l
89.实施例3的抗湿保护液的制备过程同上述实施例1，此处不作赘述。
90.根据上述实施例1-实施例3的配方及配置配方配置得到三种抗湿保护液后待用。
91.为了测试抗湿保护液的效果，按照上述的测试探针制备方法制备得到测试探针，为了方便对比，将经普通缓冲液进行包被处理得到的测试探针分别与经上述三种实施例的抗湿保护液进行包被处理得到的测试探针分别裸露在饱和氯化钾制备的87％左右湿度的环境中约4小时，8小时,24小时，48小时。
92.然后使用上述几种测试探针进行免疫检测并对检测荧光信号进行比较，具体免疫检测时，例如可以按照双抗体夹心法进行免疫检测，检测时，需配制相应的清洗液、pct抗原、生物素化的pct检测抗体，亲和素标记的花青染料5(sa-cy5)等。免疫检测的具体过程为已知技术，且不是本方案的创新点，此处不作赘述。进行免疫反应后，按照如附图1所示的结构和原理读取检测荧光信号。
93.免疫测试后，分析检测荧光信号的差异，具体如下表(1)、(2)及(3)。
94.表(1)：经实施例1的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行免疫测试的检测荧光信号数据表：
[0095][0096][0097]
表(2)：经实施例2的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行免疫测试的检测荧光信号数据表：
[0098][0099][0100]
表(3)：经实施例3的抗湿保护液与普通缓冲液处理的两种测试探针进行免疫测试的检测荧光信号数据表：
[0101][0102]
通过上述表(1)、(2)、(3)的数据可以看出，相对于未经抗湿保护液处理的测试探针，经过抗湿保护液处理的测试探针在较大潮湿环境中储存后，在免疫检测中使用时，读取到的检测荧光信号明显更多，检测结果更有效，精度更高；且不同次检测结果的偏差很小，一致性高。
[0103]
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。