一种多组学组织样本的预处理方法

1.本发明涉及分析化学和多组学领域，具体涉及一种多组学组织样本的预处理方法。


背景技术：

2.蛋白组是某种生物所能表达的所有蛋白质，蛋白质是生命功能的执行者，其含量的变化在生物体的生长、环境应激、疾病发生发展等过程中发挥着重要的作用，是生命活动执行者。代谢组学是研究生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后代谢组的变化的科学，而代谢组是指某个时间点上一个细胞或一个组织上所有代谢物的集合，主要是小分子产物。脂质组学是专门研究生物体内所有脂质分子的特性，以及它们在蛋白表达和基因调控中发挥的作用。在目前各种类型的组学中，蛋白组学告诉我们将要发生什么（发掘生命现象的表层原因），而代谢组学告诉我们正在发生什么（发掘生命现象的分子结果）。将不同组学结果进行深入整合，实现从原因和结果两个层面探究生命现象的分子本质，使研究更全面、更可靠。
3.在多组学研究中，由于生物体样本十分珍贵，所以样本的预处理方法至关重要，尤其是在进行多组学研究中如何达到一份样品完成多组学的分析测定，目前常用的提取方法是分别提取法，样品用量大，提取和处理方法过程繁琐，效率低。


技术实现要素：

4.针对上述技术问题，本发明提供了一种多组学组织样本的预处理方法，该方法提取过程简单，操作性强，样品用量少，可广泛用于多组学的研究。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：一种多组学组织样本的预处理方法，其中，所述的预处理方法包含有以下步骤：步骤1：选取组织样本，用生理盐水洗净；步骤2：取上述的组织样本10mg至30 mg置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入与组织样本的质量或体积比为2倍至4倍的生理盐水进行研磨，研磨至所述的组织样本呈均匀液体状态；步骤3：将上述的均匀液体状态的所述的组织样本转移至收集管中，加入提取试剂，涡旋混匀1小时至2小时，混匀后加入水，涡旋混匀9分钟至11分钟，然后置于4℃至5℃的离心机中进行离心，离心速度10000 rpm至15000 rpm，离心时间为10分钟至20分钟；步骤4：上述的离心机离心后所得的组织样本分上中下三层，分别为脂质组学组织样本，代谢组学组织样本和蛋白质组学组织样本；步骤5：上述的脂质组学组织样本和代谢组学组织样本在真空离心浓缩仪中浓缩至干燥；步骤6：上述的蛋白质组学组织样本加入trypsin酶消解后浓缩至干燥，过c18小柱脱盐后，再真空离心浓缩仪浓缩至干燥；
步骤7：将步骤5和步骤6样本上机进行分析，即完成多组学组织样本的预处理过程。
6.所采用的技术措施还包括：上述的组织样本为心、肝、脾、肺、肾、结肠、盲肠、小肠、睾丸、大脑或小脑。
7.上述的提取试剂为甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液或甲醇与氯仿的混合溶液，体积比为1:1.5至1:4。
8.上述的步骤3中加入水的量为所述的甲醇的0.5倍。
9.上述的真空离心浓缩仪温度设置为45℃至50℃，浓缩时间为12小时至24小时。
10.上述的步骤6中的trypsin酶浓度与蛋白浓度的比值为20:1至50:1。
11.上述的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液是按体积比例1:3.3进行混合的溶液。
12.上述的甲醇与氯仿的混合溶液是按体积比例1:2进行混合的溶液。
13.与现有技术相比，本发明提供了一种多组学组织样本的预处理方法，其中，所述的预处理方法包括以下步骤：步骤1：选取组织样本，用生理盐水洗净；步骤2：取上述的组织样本10mg至30 mg置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入与组织样本的质量或体积比为2倍至4倍的生理盐水进行研磨，研磨至所述的组织样本呈均匀液体状态；步骤3：将上述的均匀液体状态的所述的组织样本转移至收集管中，加入提取试剂，涡旋混匀1小时至2小时，混匀后加入水，涡旋混匀9分钟至11分钟，然后置于4℃至5℃的离心机中进行离心，离心速度10000 rpm至15000 rpm，离心时间为10分钟至20分钟；步骤4：上述的离心机离心后所得的组织样本分上中下三层，分别为脂质组学组织样本，代谢组学组织样本和蛋白质组学组织样本；步骤5：上述的脂质组学组织样本和代谢组学组织样本在真空离心浓缩仪中浓缩至干燥；步骤6：上述的蛋白质组学组织样本加入trypsin酶消解后浓缩至干燥，过c18小柱脱盐后，再真空离心浓缩仪浓缩至干燥；步骤7：将步骤5和步骤6样本上机进行分析，即完成多组学组织样本的预处理过程。一份样本同时完成多组学样本的提取分离，样本损失小，操作过程简单方便，为组织样本多组学研究提供了可靠的实验基础。
附图说明
14.图1 肝组织代谢物液相色谱-质谱分析谱图；图2 肝组织脂质液相色谱-质谱分析谱图；图3 肝组织蛋白质液相色谱-质谱分析谱图；图4 app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏组织差异代谢物分析列表示意图；图5app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏组织差异脂质化合物分析列表示意图；图6app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏组织差异蛋白质分析列表示意图。
具体实施方式
15.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，实施例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。
16.本发明解决上述技术问题所采用的技术措施为：一种多组学组织样本的预处理方法，包括以下步骤：步骤1：选取组织样本，用生理盐水洗净；步骤2：取上述的组织样本10mg至30 mg置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入
与组织样本的质量或体积比为2倍至4倍的生理盐水进行研磨，研磨至所述的组织样本呈均匀液体状态；步骤3：将上述的均匀液体状态的所述的组织样本转移至收集管中，加入提取试剂，涡旋混匀1小时至2小时，混匀后加入水，涡旋混匀9分钟至11分钟，然后置于4℃至5℃的离心机中进行离心，离心速度10000 rpm至15000 rpm，离心时间为10分钟至20分钟；步骤4：上述的离心机离心后所得的组织样本分上中下三层，分别为脂质组学组织样本，代谢组学组织样本和蛋白质组学组织样本；步骤5：上述的脂质组学组织样本和代谢组学组织样本在真空离心浓缩仪中浓缩至干燥；步骤6：上述的蛋白质组学组织样本加入trypsin酶消解后浓缩至干燥，过c18小柱脱盐后，再真空离心浓缩仪浓缩至干燥；步骤7：将步骤5和步骤6样本上机进行分析，即完成多组学组织样本的预处理过程。
17.所采用的技术措施还包括：组织样本为心、肝、脾、肺、肾、结肠、盲肠、小肠、睾丸、大脑或小脑；提取试剂为甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液或甲醇与氯仿的混合溶液，体积比为1:1.5至1:4；步骤3中加入水的量为所述的甲醇的0.5倍；真空离心浓缩仪温度设置为45℃至50℃，浓缩时间为12小时至24小时；步骤6中的trypsin酶浓度与蛋白浓度的比值为20:1至50:1；甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液是按体积比例1:3.3进行混合的溶液；甲醇与氯仿的混合溶液是按体积比例1:2进行混合的溶液。
18.实施例1：一种多组学组织样本处理方法，它包括以下步骤：1.1取app/ps1小鼠肝组织样本，生理盐水清洗干净。
19.1.2精密称取20 mg洗净的小鼠肝组织样本，置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入60
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l生理盐水进行研磨，研磨至组织样本呈均匀液体状态；将均匀液体状态的组织样本转移至收集管中，加入1.3 ml按照体积1:3.3的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液，涡旋混匀1小时，混匀后加入200
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l水，涡旋混匀10分钟，然后置于4℃的离心机中进行离心，离心速度12000 rpm，离心时间为10分钟。
20.1.3离心后样本为三层，上层为脂质组学样本，中层代谢组学样本，底层蛋白质组学样本，其中上层和中层样本在真空离心浓缩仪45℃下浓缩至干燥；下层样本加入trypsin酶消解后浓缩至干，过c18小柱脱盐后，真空离心浓缩仪45℃下浓缩至干。
21.1.4将上述样本上机进行分析。
22.实验结果见图1，图2和图3。从图中可以看出，大量的小分子代谢物，脂质和蛋白质分别被提取，提取效率高。
23.实施例2：一种多组学组织样本处理方法，它包括以下步骤：2.1取app/ps1小鼠大脑组织样本，生理盐水清洗干净；2.2精密称取10 mg洗净的小鼠脑组织样本，置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入30
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l生理盐水进行研磨，研磨至组织样本呈均匀液体状态；将均匀液体状态的组织样本转移至收集管中，加入1 ml按照体积1:2的甲醇和氯仿的混合溶液，涡旋混匀1小时，混匀后加入150
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l水，涡旋混匀10分钟，然后置于4℃的离心机中进行离心，离心速度15000 rpm，离心时间为20分钟；2.3离心后样本为三层，上层为代谢组学样本，中层脂质组学样本，底层蛋白质组学样本，其中上层和中层样本在真空离心浓缩仪45℃下浓缩至干燥；下层样本加入trypsin酶消解后浓缩至干，过c18小柱脱盐后，真空离心浓缩仪45℃下浓缩至干；
2.4将上述样本上机进行分析。
24.实施例3：多组学组织样本处理方法在差异生物标志物筛选中的应用，它包括以下步骤：3.1取app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏组织样本，生理盐水清洗干净；3.2精密称取30 mg洗净的小鼠肝脏组织样本，置于匀浆器皿中，然后在匀浆器皿中加入60
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l生理盐水进行研磨，研磨至组织样本呈均匀液体状态；将均匀液体状态的组织样本转移至收集管中，加入1.3 ml按照体积1:3.3的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶液，涡旋混匀2小时，混匀后加入200
ꢀµ
l水，涡旋混匀10分钟，然后置于4℃的离心机中进行离心，离心速度14000 rpm，离心时间为15分钟；3.3离心后样本为三层，上层为代谢组学样本，中层脂质组学样本，底层蛋白质组学样本，其中上层和中层样本在真空离心浓缩仪50℃下浓缩至干燥；下层样本加入trypsin酶消解后浓缩至干，过c18小柱脱盐后，真空离心浓缩仪50℃下浓缩至干；3.4将上述app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏样本上机进行分析。
25.实验结果见图4，图5和图6。在app/ps1小鼠和wt小鼠肝脏样本中共提取47834个特征代谢物峰，其中在两组间有显著差异的有3710个代谢物峰，共鉴定50个代谢物；共提取39084个特征脂质峰，其中在两组间有显著差异的有4569个脂质峰，共鉴定53个脂质；共提取2970个蛋白质，其中在两组间有显著差异的有21个蛋白质。
26.综上，一种多组学组织样本的预处理方法，在保证提取效率的情况下，一次提取完成多组学的分离，操作简单，样本用量小，样本提取全面无损失，提取效率高，应用范围广，能真实的反映代谢物，脂质及蛋白质在生物体内的浓度，为组织样本多组学研究提供了可靠的实验基础。
27.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的普通技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。