一种生物标志物GSDME的应用

一种生物标志物gsdme的应用
技术领域
1.本发明涉及了一种生物标志物gsdme的应用，具体涉及一种生物标志物 gsdme在用于制备骨关节炎亚型诊断试剂盒上的应用。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis，oa)作为老年人常见的关节退行性疾病，会影响滑膜和软骨从而导致关节破坏和临床一系列症状。目前认为骨关节炎的病理过程包括软骨的进行性丢失和破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成、不同程度的滑膜炎症、韧带和半月板退变等，临床表现为关节疼痛、短暂的晨僵、活动障碍，发展至终末期时不得不进行关节置换。这也使得膝关节骨关节炎成为中老年人致残的主要原因之一。目前，由于对骨关节炎的病理机制还不太明确，导致有关骨关节炎早期的诊断、治疗方法依然没有取得突破性的进展。当前所常用的骨关节炎的诊断方式可大致分为两类，一类是x线、超声及mri等借助影像进行诊断，另一类是通过骨关节炎相关生物标志物进行诊断。当前，可用于诊断骨关节炎的生物标志物有ii型胶原c-端肽、基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子-α (tnf-α)以及白细胞介素-1(il-1)等。但由于大多数生物标志物会随着多种病理生理驱动，也受到药物干预的影响，造成测量不准确，且部分无法有效预测标志关节炎的严重程度及进展，亟需新的可靠的生物标志物用以实现可靠的骨关节炎诊断。
3.此外，当前对骨关节炎中生物标志物的检测，常通过qpcr、组织切片免疫组化等方式进行，检测过程步骤多、耗时长多，且需要在具有专业条件的实验室中开展，因而在一些未配备实验室条件的基层医院中无法实现，故亟需一种方便可靠的骨关节炎诊断方式。
4.细胞凋亡和自噬是骨关节炎发病的两大机制，而细胞焦亡(pyroptosis)是区别于它们的一种细胞程序性炎症死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放并引起强烈的炎症反应。最近研究人员在细胞焦亡领域取得新突破，揭示gasdermin家族中gsdme(gasdermin e)介导细胞焦亡的机制，该蛋白主要受caspase3或caspase8激活，能诱导非炎症性细胞凋亡向细胞焦亡转变。目前已有gsdme在骨关节炎中的相关研究，揭示了骨关节炎与gsdme 表达水平的相关性。因而gsdme作为骨关节炎诊断生物标志物具有极大潜力。


技术实现要素：

5.为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物标志物 gsdme在用于制备骨关节炎亚型诊断试剂盒在骨关节炎诊断及预后评估上的用途。为了实现上述目的及其他相关目的，本发明在细胞、动物以及人体层面证明了骨关节炎后gsdme蛋白显著增加，因此可通过检测受试个体关节液中的gsdme蛋白的水平，以诊断和预示骨关节炎，为关节炎的诊断提供新的途径。本发明第一方面提供gsdme蛋白作为生物标志物用以检测骨关节炎严重程度及预后和/或对骨关节炎严重程度及疾病疗效进行评估的检测试剂盒上的用途。本发明第二方面提供一种检测骨关节炎亚型的诊断试剂盒。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一、生物标志物gsdme的应用
8.所述的生物标志物gsdme蛋白在用于制备诊断骨关节炎oa亚型的试剂盒上的用途。
9.所述的生物标志物gsdme蛋白为gasdermin e蛋白。
10.所述的试剂盒中放置有用于检测生物标志物gsdme蛋白的表达水平的检测试剂和检测用具，所述的检测试剂包括：人gsdme蛋白标准品、抗gsdme 抗体、兔抗人igg h&g抗体、显色反应底物溶液以及反应终止溶液；所述的检测用具包括：酶标板。
11.所述的人gsdme蛋白标准品具体为重组人gsdme蛋白；
12.所述的显色反应底物溶液具体为四甲基联苯胺溶液；
13.所述的反应终止溶液具体为2m的硫酸溶液。
14.所述的试剂盒还用于对骨关节炎oa亚型进行预后评估。gsdme蛋白的表达水平与骨关节炎oa亚型预后成负相关。
15.二、一种诊断主体骨关节炎亚型的方法
16.方法包括：获取样品溶液，检测样品溶液中的生物标志物gsdme蛋白的表达水平是否异常升高，若出现异常升高，则表明属于骨关节炎oa亚型的骨关节炎。
17.所述的生物标志物gsdme蛋白为gasdermin e蛋白；样品溶液具体为关节液。
18.所述的生物标志物gsdme蛋白的表达水平使用酶联免疫吸附elisa法进行定量检测。
19.所述的生物标志物gsdme蛋白来源于体外溶液，例如可以来源于非活体的组织液中。
20.本发明的有益效果是：
21.本发明提供了一种生物标志物gsdme在用于制备骨关节炎亚型诊断试剂盒，建立了实用的、灵敏的、特异的关节液gsdme免疫学检测方法。本发明的研究表明，gsdme蛋白是一种具有较高特异性、通用性、可靠性，易于推广普及的预测骨关节炎的严重程度及预后评估的生物标志物，可为判断骨关节炎患者预后，制定合理治疗方案提供客观依据；而且，相较于活检获取软骨组织样本来检测gsdme蛋白的表达，关节液样本更容易获取，更便于gsdme蛋白的表达水平的检测，且gsdme蛋白的检测方法更为简便，更易于在临床性或基层医院推广应用；此外，本发明建立的gsdme蛋白免疫检测方法提供了一类可靠的骨关节炎生物学诊断依据，为当前基于临床数据的诊断方式提供帮助。
附图说明
22.图1为本发明收集近百例oa患者与其它患者的关节液的转录组测序 rna-seq技术的分析结果，以及基于gsdme蛋白分类的临床数据示意图；
23.图2为本发明动物实验中对手术组及假手术组的膝关节组织样本中gsdme 蛋白的表达水平的免疫荧光结果示意图；
24.图3为本发明动物实验中免疫印迹法(western blotting，wb)检测手术组的软骨组织gsdme蛋白的表达水平的示意图；
25.图4为本发明主体实验中酶联免疫吸附elisa法检测骨关节炎主体和非骨关节炎
主体关节液样本中gsdme蛋白的表达水平的两组随机对比实验结果示意图。
具体实施方式
26.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
27.实施例：
28.进行人体实验，取实施例2中收集的一医院近百例骨关节炎oa亚型患者和其它患者的关节液以及若干份非活体动物中的关节液，对于上述所述的骨关节炎oa亚型患者的纳入标准为：年龄≥18岁，同时满足a)根据国际上公认的诊断标准诊断为膝关节骨性关节炎；2)k/l评分为2至3级；3)慢性膝关节源性疼痛；b)无局部或全身感染；c)血液学检测及生化检测无明显的关节腔穿刺禁忌；d)抽取患者关节积液0.5ml，若不能抽到关节积液，则不入组；排除标准为，a)年龄大于75岁或小于18岁；b)hiv、肝炎病毒或梅毒病毒感染或血清学检验阳性；c)体重质量指数(bmi)大于30kg/m2；d)先天性或获得性膝关节畸形；e)怀孕或哺乳期女性；f)肿瘤患者；g)免疫缺陷症患者；h)目前仍在参加其他临床试验的患者；i)其他研究者认为不适合入组的患者。本研究是根据医学伦理学原则进行。
29.针对骨关节炎oa亚型患者的关节液以及其它患者的关节液，在下述步骤中均统称为对比样本，均使用酶联免疫吸附elisa法对对比样本中的gsdme 蛋白的表达水平进行检测：
30.1)制备酶联免疫吸附elisa法所需的试剂盒，试剂盒中放置有用于检测 gsdme蛋白的表达水平的检测试剂和检测用具，检测试剂包括：人gsdme蛋白标准品、抗gsdme抗体、兔抗人igg h&g抗体、显色反应底物溶液以及反应终止溶液；检测用具包括：酶标板；人gsdme蛋白标准品具体为重组人 gsdme蛋白；显色反应底物溶液具体为四甲基联苯胺溶液(tmb)；反应终止溶液具体为2m的硫酸溶液。
31.2)在试剂盒中拿取抗gsdme抗体，使用抗gsdme抗体将酶标板上的每个孔均进行包被；在每个孔中均加入100μl对比样本或重组人gsdme蛋白，在37℃下温育30分钟，重复抽吸/冲洗每个孔3次。
32.3)在试剂盒中拿取兔抗人igg h&g抗体，稀释兔抗人igg h&g抗体至体积比为1:5000-1:200000，在酶标板上的每个孔中均加入100μl稀释的兔抗人iggh&g抗体，在37℃下温育30分钟，重复抽吸/冲洗每个孔3次。
33.4)在试剂盒中拿取四甲基联苯胺溶液，在酶标板上的每个孔中均加入 100μl的四甲基联苯胺溶液，在常温下温育30分钟。
34.5)在试剂盒中拿取2m的硫酸溶液，在酶标板上的每个孔中均加入50μl 的2m的硫酸溶液。
35.6)使用微孔板读板仪，在最大吸收波长为450nm下，测量酶标板的吸光度。
36.针对重组人gsdme蛋白，已知重组人gsdme蛋白的蛋白浓度，使用线性回归拟合的方法构建上述步骤中使用重组人gsdme蛋白测得的吸光度与重组人gsdme蛋白的蛋白浓度之间的吸光度-gsdme蛋白浓度标准曲线。
37.针对对比样本，在上述步骤中使用对比样本测得吸光度，将对比样本测得的吸光度代入吸光度-gsdme蛋白浓度标准曲线中，获得对比样本的gsdme 蛋白浓度，即获得骨关节炎oa亚型患者和其它患者的关节液中的gsdme蛋白浓度的表达水平。
38.如图4所示，为随机抽取的两组对比组对比示意图，左图中为2个其它患者和5个骨关节炎oa亚型患者的对比，右图中为4个其它患者和16个骨关节炎oa亚型患者的对比，结果发现，骨关节炎oa亚型患者的关节液中gsdme蛋白的表达水平相较其它患者的关节液中的gsdme蛋白的表达水平要更加高，并且在骨关节炎oa亚型患者中，gsdme蛋白的表达水平随着关节炎的严重程度而升高，并且随着关节炎严重程度的增加，骨关节炎oa亚型患者的关节液中的gsdme蛋白的表达水平是其它患者的关节液中的gsdme蛋白的表达水平的约2-6倍，这表明关节液中的gsdme蛋白可作为骨关节炎诊断的生物标志物，发明所制备的gsdme蛋白的试剂盒方便有效地实现了对关节液样本中gsdme蛋白的表达水平的检测。
39.本发明首先发现了在骨关节炎oa亚型中的gsdme蛋白的表达水平较不患关节炎的样本中要更加高，证明了gsdme蛋白可作为一种生物标志物用以诊断骨关节炎。进一步，验证了本发明所制备的gsdme蛋白的试剂盒的临床使用价值，可利用gsdme蛋白的试剂盒方便快捷地检测关节液样本中gsdme蛋白的表达水平。
40.其他实验测试：
41.本发明还进行了细胞实验，取若干未患关节炎的受试体关节处的软骨细胞，使用酶联免疫吸附elisa法测量软骨细胞上清液中的gsdme蛋白的表达水平；再将软骨细胞置于焦亡刺激条件下，使用酶联免疫吸附elisa法测量软骨细胞上清液中的gsdme蛋白的表达水平，结果发现，在焦亡刺激条件下的软骨细胞的上清液中的gsdme蛋白的表达水平较正常条件下的软骨细胞的上清液中的gsdme蛋白的表达水平显著提高。
42.实验表明，在焦亡刺激条件下，即在骨关节炎病变过程中，会伴随着软骨基质的丢失及软骨细胞的死亡，大量的细胞内容物会被释放进入到关节液中，因而细胞内容物胞质中高表达的非分泌蛋白gsdme蛋白将会被释放进入到关节液中；其次，骨关节炎环境中具有氧化应激条件，会作为胞外刺激方式诱导gsdme蛋白介导的细胞焦亡，细胞膜裂解破坏，gsdme蛋白大量直接释放到血液中。即可通过关节液检测gsdme蛋白的表达水平。
43.本发明还进行了生物学分析以及临床表现评估：
44.1)收集一医院近百例骨关节炎oa亚型患者和其它患者的关节处的软骨组织和关节液，并进行下述生物学分析(转录组测序rna-seq技术、实时荧光定量pcr法和酶联免疫吸附elisa法)以及临床表现评估(临床特征对比)；其它患者为患有除关节炎外的其它疾病的患者，并且在诊断过程中也需要抽取关节处的软骨组织和关节液进行后续检测。
45.2)使用转录组测序rna-seq技术处理骨关节炎oa亚型患者的软骨组织，获得转录组图谱，如图1的a)所示，为骨关节炎oa亚型的单中心软骨组织差异表达基因转录组图谱，如图1的c)所示，为骨关节炎oa亚型的多中心软骨组织差异表达基因转录组图谱；
46.3)使用聚类分析方法处理单中心软骨组织差异表达基因转录组图谱和多中心软骨组织差异表达基因转录组图谱，将骨关节炎oa亚型分为1-4类(cluster1-4：糖胺聚糖代谢紊乱亚型(cluster1)，胶原蛋白代谢紊乱亚型(cluster2)，激活的感觉神经元亚型(cluster3)和炎症亚型(cluster4))，1-4类的骨关节炎oa亚型依次对应由低到高临床表现恶化程度；
47.4)使用实时荧光定量pcr法检测骨关节炎oa亚型患者和其它患者各自的软骨组织，获得软骨组织gsdmemrna表达水平，如图1的b)所示，为其它患者(normal)以及骨关节炎oa亚型(cluster1-4)的单中心软骨组织gsdmemrna表达水平，如图1的d)所示，为其它患
者(normal)以及骨关节炎oa 亚型(cluster1-4)的多中心软骨组织gsdme mrna表达水平；即对应骨关节炎oa亚型患者的软骨组织的gsdme蛋白的表达水平；
48.5)使用酶联免疫吸附elisa法测量骨关节炎oa患者关节液中的gsdme 蛋白的表达水平；
49.6)进行临床表现评估，将cluster1-3类的骨关节炎oa亚型患者和cluster4 类的骨关节炎oa亚型患者进行临床特征对比：临床特征对比中分别使用 womac评分和vas评分(图1的f))、kellgren-lawrence(k-l)分级评分系统(图1的g))、骨赘评分(图1的h))、关节间隙评分(图1的i))以及滑膜炎评分(图1的j))；
50.通过上述步骤，分析gsdme蛋白在骨关节炎oa亚型患者关节处的软骨组织和关节液中的表达水平与临床表现恶化程度的相关性，结果发现gsdme 蛋白在cluster4类(oa炎症亚型)的患者关节处的软骨组织和关节液中呈现高表达，(如图1的a)-e))，并且伴随着临床表现程度的恶化(图1的f)-j))。如图1的a)-e)，表明在cluster4类(oa炎症亚型)中具有gsdme蛋白的表达水平较其它患者显著升高的特征，如图1的f)-j)，表明高gsdme蛋白的表达水平的cluster4类(oa炎症亚型)患者的临床表现恶化程度更高。证明gsdme 蛋白可以作为一种骨关节炎生物标志物。
51.骨关节炎oa亚型患者的关节液中的gsdme蛋白的表达水平的升高会伴随临床表现程度的恶化，骨关节炎oa亚型患者中的gsdme蛋白的表达水平是其它患者(即不患关节炎的患者)中的gsdme蛋白的表达水平的2-5倍。
52.本发明还进行了动物实验，将若干未患病的野生型c57小鼠分为两组，分别为内侧半月板失稳dmm手术组以及假手术组，并分别进行内侧半月板失稳 dmm手术和假手术，并建立c57小鼠骨关节炎模型；内侧半月板失稳dmm手术组简称手术组；分别取c57小鼠骨关节炎模型中的手术组和假手术组各自的术后两个月的关节液、软骨组织和膝关节：
53.a)提取手术组和假手术组的关节液，使用酶联免疫吸附elisa法检测两组各自的关节液中的gsdme蛋白的表达水平；
54.b)提取手术组和假手术组的膝关节并制作成石蜡切片，使用免疫荧光技术检测两组各自的石蜡切片中的gsdme蛋白的表达水平，如图2所示；
55.c)提取手术组和假手术组的软骨组织并研磨，使用免疫印迹wb法检测两组各自的研磨的软骨组织中的gsdme蛋白的表达水平，如图3所示；
56.通过上述动物实验，结果发现，野生型c57小鼠在进行内侧半月板失稳 dmm手术后患有关节炎，其关节液、软骨组织和膝关节中的gsdme蛋白的表达水平均较假手术组更加高。
57.其中，上述b)中在使用免疫荧光技术后，在手术组中的小鼠中发现gsdme 蛋白的荧光信号更强，表明手术组中的膝关节的gsdme蛋白的表达水平较假手术组更加高，并且gsdme蛋白在膝关节中具有高表达的特性。
58.上述c)中在使用免疫印迹wb法检测后，获得手术组和假手术组的对比蛋白检测条带，如图3中，gsdme蛋白中的gsdme-fl为全长gsdme，gsdme-n 为活性化gsdme，均与骨关节炎的发生存在相关性；其中，gapdh为内参蛋白，用以体现蛋白浓度。利用imagej软件对对比蛋白检测条带的深度进行测量，以表征手术组和假手术组中的gsdme蛋白的相对表达水平。结果表明，手术组中的软骨组织的gsdme-n(活性化gsdme)的表达水平相较假手术组中更加
高。
59.本发明中，gsdme蛋白作为生物标志物在骨关节炎的诊断及预后评估上的应用方式如下：
60.1、骨关节炎的诊断：
61.构建一种检测骨关节炎的诊断试剂盒。采集患者的关节液，使用试剂盒检测关节液中的gsdme蛋白的表达水平，并将gsdme蛋白的检测结果进行反馈，最后根据关节液中的gsdme蛋白的表达水平，对骨关节炎进行实现诊断。
62.2、骨关节炎的预后评估：
63.(1)建立关节液gsdme蛋白的定量检测方法：利用构建的试剂盒，使用酶联免疫吸附elisa法检测gsdme蛋白的表达水平。
64.(2)对已经明确患有关节炎的患者，采集关节液，送实验室检测。
65.(3)实验室利用发明制备的gsdme蛋白表达检测的试剂盒定量检测关节液中的gsdme蛋白的表达水平，并将gsdme蛋白的检测结果进行反馈。
66.(4)根据关节液中gsdme蛋白的实时表达水平，对骨关节炎治疗效果做出预后评估。
67.(5)治疗过程中，实时监测关节液中gsdme蛋白的实时表达水平，实现对骨关节炎oa患者治疗疗效的实时监测，及时调整药物类型及其治疗剂量，达到最佳治疗效果。
68.本发明在细胞、动物以及人体层面证明了骨关节炎后gsdme表达水平显著增加，验证了gsdme作为生物标记物检测骨关节炎的可行性；建立了实用的、灵敏的、特异的关节液gsdme化学发光免疫学检测方法；通过临床样本试用，验证了关节液中的gsdme能用于对关节炎严重程度进行诊断，并评价了关节液gsdme作为骨关节炎严重程度及诊断预后评估标志物的临床价值；因此可通过检测受试人个体关节液中的gsdme的表达水平，以诊断和预示骨关节炎，为关节炎的诊断提供新的途径。
69.本发明提供关节液中的gsdme作为生物标志物，用以检测骨关节炎严重程度及预后上的用途，和/或对骨关节炎严重程度及疾病疗效进行评估的检测试剂盒上的用途。
70.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。