急性心力衰竭诊断生物标志物及其治疗用途的制作方法

1.本发明涉及急性心力衰竭诊断的技术领域，尤指一种急性心力衰竭诊断生物标志物及其治疗用途。


背景技术：

2.心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。心力衰竭作为心脏病发展的严重阶段，在全球范围内不仅拥有2250万的患者，并且还在以每年200万的速度持续增长。心力衰竭和恶性肿瘤的5年生存率相同，冠心病作为心力衰竭主要病因，发病人群的逐渐扩大使得心力衰竭的筛查和防治在我国显得越来越重要。
3.心衰是复杂的临床综合征，单纯结合病史、体格检查和超声心动图诊断心衰通常是不够的，其诊断和危险分层还需要更多有效的检测方法。采用实验室方法快速简单地检测心衰患者血液中的生物标志物，对于判断心力衰竭和评价心衰的治疗效果有重要影响。目前，心衰指南多以bnp或nt-probnp作为心衰的生物标志物，但心力衰竭的病理机制十分复杂，单靠一种类型的生化标志物检测有一定的局限性。目前认为，联合多种心力衰竭标志物联合测定将有助于提高危险分层的效果，是今后心衰诊断的发展趋势。
4.生物标志物(biomarker)是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”，作为个体化医疗的“关键词”之一，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为当前医学领域的研究热点。代谢组学是一门新兴的生物学分支，代谢组学着重研究代谢物质的代谢途径及其所受到各种内、外在因素影响下代谢途径的变化来研究某些病理生理过程中所产生的系列事件。近年来，代谢组学在各研究领域也显现出了广阔的应用前景包括疾病诊断、药物研发、药效和毒性评价、药物作用机理研究及植物代谢组学等。
5.血清是代谢组学中一种理想的用来寻找生物标记物的生物流体。作为一种新的组学研究手段，代谢组学可从整体水平研究机体对内源和外源刺激的反应，将表观现象及其在分子水平上的变化联系起来，揭示在疾病发生发展过程中的代谢变化规律并挖掘可能的致病机制辅助临床诊断与治疗具有非常重要的意义。
6.如专利申请201911135287.8公开了一种具有较高特异性的心衰lncrna生物标志物及其检测方法和应用，所述的生物标志物为lncrna-b和lncrna-c，lncrna-b和lncrna-c的表达量与均与心衰发展程度具有相关性，lncrna-b和-c的表达量定量来诊断受试者是否患有心衰，或者是否具有更高的发生心衰的风险。所述的lncrna-b的序列为seqno1，所述的lncrna-c的序列为seqno2。所述的lncrna-b和lncrna-c均分离自外周静脉血血浆；所述的lncrna生物标志物能用于制备心衰诊断试剂或生物芯片；采用实时荧光定量pcr分别检测lncrna-b和lncrna-c的表达水平。
7.在生物标志物的体系中还包含细胞生物标志物，特定的细胞类型不仅可以辅助疾病的诊断还可以对疾病的细胞疗法起到帮助。因此，筛选合适的生物标志物一直是研发的重点。


技术实现要素：

8.针对上述的问题，本发明提供一种急性心力衰竭诊断生物标志物及其治疗用途，该生物标志物既容易检测、又便于预测急性心力衰竭的风险，该生物标志物应用流式细胞术首次鉴定出外周血样本中cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭中的诊断价值，并发现cd170 中性粒细胞具有早期诊断急性心力衰竭的作用。
9.本发明提供一种急性心力衰竭诊断生物标志物及其治疗用途，该生物标志物应用流式分选技术将cd170 中性粒细胞分选出来，应用高分辨质谱检测检测cd170 中性粒细胞特有的代谢物，在血浆样本中进行验证，最后用酶联免疫法检测外周血cd170蛋白的含量，该方法是将细胞免疫疗法、酶联免疫法和液相色谱的物理分离能力与质谱的质量分析能力结合起来的技术，不仅可以作为急性心力衰竭疾病早期诊断特异性指标而且可以在急性心力衰竭的治疗方面发挥作用。
10.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
11.一种急性心力衰竭诊断生物标志物，所述生物标志物为cd170 中性粒细胞。
12.一种急性心力衰竭诊断生物标志物的治疗用途，是cd170蛋白在诊断急性心力衰竭的应用。
13.一种急性心力衰竭诊断生物标志物的治疗用途，其特征在于该生物标志物cd170特异代谢产物在诊断急性心力衰竭的应用。
14.进一步，所述应用，是用酶联免疫法检测外周血cd170蛋白含量，用高分辨质谱对cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭的疾病中的特有代谢产物进行定量检测，此方法从cd170蛋白，细胞类型、代谢产物三个方面为急性心力衰竭的早期诊断提供帮助。
15.本发明的有益效果在于：
16.本发明通过生物标志物可以识别急性心力衰竭的高发人群，据此改变这类患者的生活方式，促进其以健康的方式生活。针对急性心力衰竭患者的代谢异常，给予相应的生物标志物及生物标志物组合的治疗，能够有针对性的治疗急性心力衰竭。
17.本发明可具有风险预测价值及治疗价值，还可通过合并多个生物标志物的值来提高本发明方法的质量和/或预测能力及治疗能力。
附图说明
18.图1是本发明所实现cd170 中性粒细胞健康人和急性心力衰竭患者外周血中占白细胞百分比示意图。
19.图2是本发明所实现cd170蛋白在健康人和急性心力衰竭患者外周血血浆中含量示意图。
20.图3是本发明所实现cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭患者外周血中的分选策略示意图。
21.图4是本发明所实现健康人与急性心力衰竭患者cd170 中性粒细胞代谢组学离子
提取图。
22.图5是本发明所实现健康人与急性心力衰竭患者cd170 中性粒细胞代谢组学离子主成分分析图。
23.图6是本发明所实现健康人与急性心力衰竭患者cd170 中性粒细胞代谢组差异代谢产物热图。
24.图7是本发明所实现健康人与急性心力衰竭患者血浆中差异代谢产物含量示意图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
26.本发明所实现的急性心力衰竭诊断生物标志物，为cd170 中性粒细胞。
27.本发明所实现的急性心力衰竭诊断生物标志物的治疗用途，为cd170 中性粒细胞在治疗急性心力衰竭的应用。
28.具体地说，所述应用，是用酶联免疫法检测外周血cd170蛋白含量，用高分辨质谱对cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭的疾病中的特有代谢产物进行定量检测，此方法从cd170蛋白，细胞类型、代谢产物三个方面为急性心力衰竭的早期诊断提供帮助。
29.下面从临床数据对上述生物标志物及其应用进行说明。
30.受试群体。
31.本发明所使用的研究方案也得到了医院伦理委员会的批准，并取得参试患者的知情同意，时间为2020-2021年。
32.本实验临床样本包括急性心力衰竭组50例、对照组50例。两组在年龄和性别上匹配。
33.入组标准：
34.患者有喘憋、夜间阵发性呼吸困难等心力衰竭表现，伴或不伴肺部湿罗音，下肢水肿等体征，辅助检查有心力衰竭的客观证据，超声心动图示左室射血分数(lvef)、左房内径≥4cm,同时nt-probnp》450pg/ml。
35.排除标准：
36.急性心肌梗死的急性心力衰竭、肿瘤、慢性肝脏疾病、怀孕、哺乳期妇女、正在接受激素替代疗法患者、服用避孕药。
37.收集信息：
38.年龄、bmi(身高、体重)、腰围、是否吸烟、是否饮酒、饮食习惯、教育程度、体力活动时间、家族史(心脏病、糖尿病、高血压、高脂血症)、血糖、血压、尿酸、胰岛素水平、血脂、心脏病、中风、其他疾病、用药史、药敏史、巨细胞病毒。
39.样品采集及处理方法：
40.每位受试者采血2-3ml，edta抗凝，其中100ul用于血细胞用于流式细胞术，其余4℃冰箱保存，血清分离后于-80℃保存。
41.检测方法。
42.一.流式细胞术及酶联免疫法
43.应用流式细胞数术对受试者的外周血cd170 中性粒细胞进行检测，比较急性心力
衰竭患者、健康人外周血cd170 中性粒细胞比例寻找急性心力衰竭的细胞学生物标志物。
44.储存条件：全血4℃冰箱，血浆于-80℃冻存。
45.检测方法：流式细胞术及elisa。
46.仪器信息：流式细胞仪仪器型号：bd facscantii，制造商：美国bd公司。
47.酶标仪仪器型号：mltiskan fc，制造商：thermofisher。
48.实验参数：流式荧光通道：使用405nm的fl2通道，488nm的fl7、fl8和fl10通道，640nm的fl12通道。荧光电压：fsc:300v，ssc:450v，pe:350v，bv515:300v，apc-cy7:420v，fitc:450v，amcyan:300v。
49.样本处理：
50.1)取全血200μl用于检测外周血中cd170阳性中性粒细胞亚群的比例。首先200μl全血加入1ml红细胞裂解液2ml裂解15分钟，再以1000rpm转速离心5分钟，移除上清液，保留细胞沉淀。其次用200μl的磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀并依次加入5μl fixable viability stain，5μl anti-humanpe-cd45，5μl anti-human bv515-cd11b，5μl anti-human fitc-cd66b，5μlanti-human apc-cy7-cd170抗体，避光孵育10分钟，再以1000rpm转速离心5分钟，移除上清液保留细胞沉淀。最后用1ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞清洗未结合细胞的染色抗体，再以1000rpm的转速离心5分钟，移除上清液，用500μl的磷酸盐缓冲液重悬细胞，准备上机检测cd170阳性中性粒细胞免疫亚群比例。
51.2)取外周血1ml，以3500rpm转速离心10分钟，取上层血浆200μl，用于外周血血浆中cd170蛋白定量检测。将cd170抗体包被与检测板上15min,加入血浆样本10ul,室温孵育30min,用清洗液洗涤检测板2次，加入荧光二抗孵育5min,上机检测即可，酶标仪检测波长：450nm。
52.二.代谢组(检测方法是利用高分辨质谱检测，检测条件为自己构建)
53.1.血清常规氨基酸前处理：取40ul血清，加入200ul乙腈，涡旋混匀。10000/min离心10min。取100ul上清液用乙腈水4：1稀释后进样检测。
54.2.血清常规脂质前处理：取50ul血清,加入450ul含有普萘洛尔内标的三氯甲烷/甲醇(4：1)，蛋白沉淀。12000rpm，4度，离心5分钟，取上层溶液200ul。向干燥后的样品中加入200ul异丙醇/甲醇(5：1)，震荡混匀40s。12000rpm离心5分钟，取上清液200ul，上机待测。
55.部分质谱参数如下：
56.57.脱洗程序为：
[0058][0059]
质谱条件：质量扫描范围为50-1200m/z，数据采集采用thermohfx数据管理软件。
[0060]
液相条件：色谱柱:waters uplc csh c18(3um 2.1mm*100mm)；
[0061]
流动相:a(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mm甲酸铵)和b(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mm甲酸铵)；洗脱程序:见上表；流速：0.3ml/min；进样量为10.0μl；
[0062]
柱温：60℃。
[0063]
峰挑选、峰对齐、去噪音、生成标志物表。分类和连续变量分别用百分数和标准误表示。所有浓度在急性心力衰竭组与对照组之间进行统计学分析。通过roc曲线等统计学方法与目前临床生化标志物进行比较和评估其对cd170 中性粒细胞代谢产物在进行心力衰竭中的预测和诊断价值。
[0064]
6、代谢组学数据预处理。
[0065]
数据预处理(峰挑选、峰对齐、去噪音、生成标志物表)，应用软件thermohfx，设定峰强度大于：15000count，最小保留时间宽度：0.7分钟，删除保留时间小于0.3分钟，和大于22分钟的数据。
[0066]
原始预数据处理(步骤包括：excel读取文件、调整数据格式和数据过滤)。
[0067]
(1)变异系数过滤；(排除检测噪音干扰，保证marker的稳定性，cv《10％)。
[0068]
(2)峰面积小于20万过滤；(目的排除峰强度较低含量低的非特异性产物)。
[0069]
(3)比较时候选marker最小cv》10％值过滤掉。
[0070]
(4)p值小于0.05，比较符合显著性差异的候选marker。
[0071]
实验结果：
[0072]
cd170 中性粒细胞健康人和急性心力衰竭患者外周血中占白细胞百分比如图1所示，cd170蛋白在健康人和急性心力衰竭患者外周血血浆中含量如图2所示，cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭患者外周血中的分选策略如图3所示。健康人与急性心力衰竭患者cd170 中性粒细胞代谢组学离子提取图及主成分分析如图4、图5所示。健康人与急性心力衰竭患者cd170 中性粒细胞代谢组差异代谢产物热图如图6所示，健康人与急性心力衰竭患者血浆中差异代谢产物含量如图7所示。
[0073]
1)基于临床病人样本结果发现cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭中的特异变化，证明cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭中的诊断特异性。
[0074]
2)基于临床病人样本结果发现cd170蛋白在急性心力衰竭中的特异变化，证明cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭中的诊断特异性。
[0075]
3)分选出体内的cd170 中性粒细胞，对其代谢产物进行检测，发现在急性心力衰竭中cd170 中性粒细胞的特有代谢产物，并在人、动物血浆样本进行验证。
[0076]
4)证明cd170 中性粒细胞及cd170 中性粒细胞的特有代谢产物可以作为急性心力衰竭特异性的诊断标志物。
[0077]
脂质：pc18:0,fahfa(14:0/16:2),lpc 18:3。
[0078]
氨基酸：苹果酸，柠檬酸、丙氨酸，丙酮酸。
[0079]
总之，本发明通过生物标志物可以识别急性心力衰竭的高发人群，据此改变这类患者的生活方式，促进其以健康的方式生活。针对急性心力衰竭患者的代谢异常，给予相应的生物标志物及生物标志物组合的治疗，能够有针对性的治疗急性心力衰竭。
[0080]
该生物标志物既容易检测、又便于预测急性心力衰竭的风险，该生物标志物应用流式细胞术首次鉴定出外周血样本中cd170 中性粒细胞在急性心力衰竭中的诊断价值，并发现cd170 中性粒细胞具有治疗急性心力衰竭的作用。
[0081]
应用流式分选技术将cd170 中性粒细胞分选出来，应用高分辨质谱检测检测cd170 中性粒细胞特有的代谢物，在血浆样本中进行验证，最后用酶联免疫法检测外周血cd170蛋白的含量，该方法是将细胞免疫疗法、酶联免疫法和液相色谱的物理分离能力与质谱的质量分析能力结合起来的技术，不仅可以作为急性心力衰竭疾病早期诊断特异性指标而且可以在急性心力衰竭的治疗方面发挥作用。
[0082]
以上实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。