一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法与流程

1.本发明涉及一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法。快速定量方法是指用高效液相色谱方法，双通道不同检测波长，对莫诺苷、马钱苷、芒果苷的一测三评定量测定。


背景技术：

2.本发明所涉及的中药组合物，由山萸肉、五味子、白芍、酸枣仁、牡丹皮、北柴胡、炒栀子、地黄、知母和莲子心，10味中药组成。具有治疗失眠、焦虑、抑郁和更年期综合征的作用。
3.中药及其复方制剂中，由于药味多，各药味的剂量低，众多的微量有效成分之间相互干扰，定量测定指标少，而众多的药材与有效成分是无法控制其投料情况与含量的，质量标准识别水平太低，无法给质量监督提供有力支撑。为更好的控制本药物的质量，稳定药物的疗效，需要对该中药组合物的质量指标和质量检测方法进行研究。


技术实现要素：

4.本发明的原理如下。
5.通过调整流动相的组分、比例以及检测波长，使性质不同的有效成分能在同一流动相中，不同的检测波长下，都能呈现波峰分离良好、无干扰，峰面积适宜，而且其波峰面积与含量呈良好线性关系，而得以定量测定。
6.解决的技术问题。
7.建立的莫诺苷、马钱苷和芒果苷的一测三评定量方法，以双通道，芒果苷在318 nm 、莫诺苷与马钱苷在240nm检测，既解决了芒果苷阴性干扰问题，使各波峰大小适宜，互不干扰，一测三评，效率高，成本低。
8.技术方案。
9.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，包括以下步骤。
10.第一步：色谱柱为c18柱，以乙腈为流动相a，以0.1%磷酸溶液（v/v）为流动相b，a b=100%，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0~30min，a7%，b93%，流速1.0ml/min； 30~60min，a7%
→
10%，b93%
→
90%，流速0.5ml/min；60~62min，a10%
→
90%，b90%
→
10%，流速1.0ml/min；62~72min， a90%，b10%，流速1.0ml/min；72~73min，a90%
→
7%，b10%
→
93%，流速1.0ml/min，检测波长为：莫诺苷、马钱苷的检测波长为240nm，芒果苷的检测波长为318nm；柱温为35℃，进样量10μl。
11.第二步：对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品适量，加80%甲醇制成每1ml含莫诺苷100μg、马钱苷130μg、芒果苷48μg的混合对照品溶液。
12.第三步：供试品溶液制备：取该中药组合物，研细，取1.0g，精密称定，精密加入80%甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率20khz）20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
13.第四步：分别制备缺山萸肉药材的制剂、缺知母药材的制剂，再根据第三步分别制备缺山萸肉阴性对照溶液；缺知母阴性对照溶液。
14.第五步：方法学考察，所述方法学考察包括线性关系考察、专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验、耐用性试验，所述线性关系考察中的对照品溶液为：精密称取莫诺苷、马钱苷对照品适量，分别置于不同的25ml量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/ml的莫诺苷对照品储备液和浓度为0.6mg/ml的马钱苷对照品储备液；精密称取芒果苷对照品适量，置于25ml量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/ml的芒果苷对照品储备液；分别精密吸取上述对照品储备液适量置于10ml量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成35.70、52.29、79.53、106.04、132.56、159.70μg/ml莫诺苷系列浓度溶液；43.14、64.39、96.10、128.14、160.17、192.98μg/ml马钱苷系列浓度溶液和16.46、24.57、36.67、48.90、61.12、73.64μg/ml芒果苷系列浓度溶液，各进样10μl，以各对照品的浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
15.所述专属性试验为分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl进样，记录色谱图。
16.所述精密度试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，分别在所述第一步中的色谱条件下连续进样6次，测定莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的rsd值。
17.所述稳定性试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，每隔一定时间测定峰面积，考察了24h内的稳定性，测莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的rsd值。
18.所述重复性试验为精密称取以高、中、低剂量9份样品，分别按所述第二步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
19.所述加样回收试验为精密称取已知含量的同一批样品9份，按高、中、低比例精密加入一定量的对照品，按所述第三步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
20.所述耐用性试验为考察了同一品牌不同批号的色谱柱，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
21.（三）有益效果。
22.本发明的创新点及有益效果如下。
23.(1) 本发明针对多药味组成的制剂其定量测定提高到3种成分，而且是以最常用的梯度洗脱的方式，同一流动相，不同检测波长下的同时测定。检测波长：莫诺苷、马钱苷240nm，芒果苷318nm。在不同的波长下检测不同的成分，各波峰大小适宜，互不干扰，一测三评，简便、快捷、准确，成本低、效率高，有利于市场监督。
24.（2）本发明提高了检测效率，降低检测成本，减少环境污染，形成了一套简便、快捷、高效、低耗、低污染、多指标控制药品质量的现代化标准。
附图说明
25.图1 莫诺苷对照品线性关系图。
26.图2 马钱苷对照品线性关系图。
27.图3 芒果苷对照品线性关系图。
28.图4莫诺苷、马钱苷对照品的hplc色谱图。
29.图5芒果苷对照品的hplc色谱图。
30.图6中药组合物样品莫诺苷、马钱苷hplc色谱图。
31.图7中药组合物样品芒果苷hplc色谱图。
32.图8缺山萸肉的空白样品hplc色谱图。
33.图9缺知母的空白样品hplc色谱图。
34.图10waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03253008313852中药组合物中莫诺苷和马钱苷hplc色谱图。
35.图11waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03253008313852中药组合物中芒果苷hplc色谱图。
36.图12waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03333031512401中药组合物中莫诺苷和马钱苷hplc色谱图。
37.图13waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03333031512401中药组合物中芒果苷hplc色谱图。
38.图14waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03333032932466中药组合物中莫诺苷和马钱苷hplc色谱图。
39.图15waterssymmetryc18（4.6
×
250mm）s.n.03333032932466中药组合物中芒果苷hplc色谱图。
40.图1、图2、图3中，横坐标为进样量μg,纵坐标为峰面积。
41.图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15中，1.为莫诺苷，2.芒果苷3.马钱苷。
42.本发明具体实施方式如下：莫诺苷、马钱苷和芒果苷一测三评快速测定方法。
43.第一步：色谱柱为c18柱，以乙腈为流动相a，以0.1%磷酸溶液（v/v）为流动相b，a b=100%，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0~30min，a7%，b93%，流速1.0ml/min；30~60min，a7%
→
10%，b93%
→
90%，流速0.5ml/min；60~62min，a10%
→
90%，b90%
→
10%，流速1.0ml/min；62~72min，a90%，b10%，流速1.0ml/min；72~73min，a90%
→
7%，b10%
→
93%，流速1.0ml/min，检测波长为：莫诺苷、马钱苷的检测波长为240nm，芒果苷的检测波长为318nm；柱温为35℃，进样量10μl。
44.第二步：对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品适量，加80%甲醇制成每1ml含莫诺苷100μg、马钱苷130μg、芒果苷48μg的混合对照品溶液。
45.第三步：供试品溶液制备：取该中药组合物，研细，取1.0g，精密称定，精密加入80%甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理（功率250w，频率20khz）20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
46.第四步：分别制备缺山萸肉药材的制剂、缺知母药材的制剂，再根据第三步分别制备缺山萸肉阴性对照溶液；缺知母阴性对照溶液。
47.第五步：方法学考察，所述方法学考察包括线性关系考察、专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验、耐用性试验，所述线性关系考察中的对照品溶液为：精密称取莫诺苷、马钱苷对照品适量，分别置于不同的25ml量瓶中，加80%甲醇使溶解
并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/ml的莫诺苷对照品储备液和浓度为0.6mg/ml的马钱苷对照品储备液；精密称取芒果苷对照品适量，置于25ml量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/ml的芒果苷对照品储备液；分别精密吸取上述对照品储备液适量置于10ml量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成35.70、52.29、79.53、106.04、132.56、159.70μg/ml莫诺苷系列浓度溶液；43.14、64.39、96.10、128.14、160.17、192.98μg/ml马钱苷系列浓度溶液和16.46、24.57、36.67、48.90、61.12、73.64μg/ml芒果苷系列浓度溶液，各进样10μl，以各对照品的浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。通过方法学考察，莫诺苷进样量在0.3570~1.5970μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：y=17357144x-112533(r=0.99987,n=6)（表1、图1）；马钱苷进样量在0.4314~1.9298μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：y=3199039x-253582(r=0.99978,n=6) （表2、图2）；芒果苷进样量在0.1647~0.7364μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：y=4720572x-158941(r=0.99976,n=6) （表3、图3）。
48.所述专属性试验为分别量取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl进样，记录色谱图（图4、5、6、7、8、9），供试品与对照品在同一保留时间有相同的色谱峰出现，而阴性样品则没有相应的峰出现。
49.所述精密度试验为精密量取混合对照品溶液，分别在所述第一步中的色谱条件下连续进样6次，记录峰面积：莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品6次测定的峰面积平均值分别为1613588、3580945、1965209，rsd分别为0.61%、0.56%、0.63%；供试品中莫诺苷、马钱苷、芒果苷的平均值分别为1700339、3281806、1427129，rsd为0.27%、0.38%、0.23%。结果表明：本方法精密度较好（见表4）。
50.所述稳定性试验为取混合对照溶液和供试品溶液，每隔一定时间测定峰面积，考察了48h内的稳定性，对照品莫诺苷、马钱苷在30h内的rsd分别为1.65%、1.65%，芒果苷在20h内的rsd为1.72%；供试品莫诺苷、马钱苷、在48h内的rsd分别为0.30%、0.45%，芒果苷在24h内的rsd为1.85%。结果表明：对照品溶液在20h内、供试品溶液在24h内稳定。莫诺苷和马钱苷稳定性（表5）、芒果苷稳定性（表6）。
51.所述重复性实验为精密称取以高、中、低剂量9份样品，分别按所述第二步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定，莫诺苷、马钱苷、芒果苷的平均含量分别2.460mg/g、2.577mg/g、0.774mg/g，rsd分别为0.381%、0.373%、0.433%。结果表明：本方法的重现性良好（表7）。
52.所述加样回收试验为精密称取已知含量的同一批样品9份，按高、中、低比例精密加入一定量的对照品，按所述第三步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定，计算回收率。采用加样回收实验，结果表明：莫诺苷的平均回收率为101.94%，rsd为1.47%（表8）、马钱苷的平均回收率为101.25%，rsd为1.48%（表9）、芒果苷的平均回收率为96.67%，rsd为1.47%，rsd为1.84%（表10）。
53.所述耐用性试验为考察了不同品牌的色谱柱【waters symmetry c18（4.6*250mm）、agilent zorbax sb-aq（4.6*250mm）、thermo acclaim c18（4.6*250mm）】，所得的检测结果没有明显的差异，且rsd值均在2%以下，且各色谱峰分离度较好，说明此方法耐用性良好（表11、图10、11,图12、13，图14、15）。
54.表1莫诺苷进样量与峰面积表 2 马钱苷进样量与峰面积表 3 芒果苷进样量与峰面积表 4 精密度实验结果表 5 莫诺苷、马钱苷稳定性试验结果表 6 芒果苷稳定性试验结果
表 7 重复性试验结果 ( mg/g )表 8 样品中莫诺苷加样回收率试验结果表 9 样品中马钱苷加样回收率试验结果
表 1 0 样品中芒果苷加样回收率试验结果表 1 1 不同色谱柱耐用性试验结果 ( mg/g )