医用温敏性水凝胶敷料及其制备方法

1.本发明涉及的是一种医用材料领域的技术，具体是一种医用温敏性水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.现有的医用水凝胶制备方法及产品的缺陷和不足在于无法同时完成杀菌、止血、消炎、促愈等功能，从而协同解决微生物(特别是耐药菌)引起的创面持续感染难以治愈问题。改进的水凝胶则有利用光热剂的光热效果以产生多种功能，但增加的光热剂本身的可降解性与生物相容性，光热治疗引起的创面周围正常体细胞的炎症反应等。


技术实现要素：

3.本发明针对现有创面敷料功能单一，难以同时抗菌消炎止血修复的不足，提出一种医用温敏性水凝胶敷料及其制备方法，具备广谱杀菌、有效调节炎症反应、快速止血、促进创面愈合的特点，并且有效封闭创面的多功能创面敷料及其制备方法，以解决目前创面敷料功能单一，难以同时抗菌消炎止血修复的问题。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明涉及一种医用温敏性水凝胶敷料的制备方法，通过将聚乙二醇与作为光热剂的金属有机框架化合物混合加热后反应得到聚乙二醇分子原位吸附在金属有机框架化合物内，通过聚乙二醇分子中的氧原子与金属有机框架化合物中的金属离子近距离接触，形成配位键；然后向其中进一步加入己内酯、丙交酯与作为催化剂的辛酸亚锡进行原位开环反应得到聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物与金属有机框架化合物的聚合物；沉淀聚合物后进行冻干，将作为免疫调节剂的抗炎促愈分子与聚合物共同溶解混合均匀后蒸干，溶解于盐水溶液制得抗菌、止血、促愈水凝胶敷料。
6.所述的金属有机框架化合物为四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物(cu(ii)tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin mof)。
7.所述的混合加热，具体为20℃真空搅拌环境下进行1小时。
8.所述的原位开环，具体为130℃环境下加热12小时。
9.所述的沉淀，具体为80℃热水加热环境下进行。
10.所述的沉淀聚合物为聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物(pela)与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物。
11.所述的抗炎促愈分子，采用但不限于二甲基姜黄素、姜黄素异恶唑和吡唑衍生物、hispolon(桑黄多酚化合物)、大黄素以及姜黄素及其衍生物与类似物。
12.所述的溶解，优选为在生理盐水或磷酸缓冲液中形成25％的水凝胶溶液。技术效果
1.相比现有技术一般采用将金属有机框架化合物与凝胶聚合物直接混合，或者在凝胶聚合物网络内原位合成金属有机框架化合物的方法进行合成，本发明先将聚乙二醇分子
原位吸附在金属有机框架化合物内，然后在进行进一步聚合反应的方法合成聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物与金属有机框架化合物聚合物。本发明同时包含光热剂(如：四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物)与免疫调节剂(如：姜黄素)，在通过光热效应杀死创面病原体的同时调节创面免疫，消除光热以及病原体引起的炎症。
2.与现有技术相比，本发明采用金属有机框架化合物作为光热剂，更易自发降解，减少积累毒性；同时可以减少光热作用以及病原体引起的炎症，促进创面治愈。具体原理如下：1、相较于水凝胶直接与金属有机框架化合物混合的方法，采用聚乙二醇分子先吸附再聚合的方法使得聚乙二醇分子可以更大机会进入金属有机框架化合物网络中，形成更多的金属配位键，使金属有机框架化合物可以更强的结合在水凝胶聚合物中，形成宏观上均匀分散且稳定结合的金属有机框架化合物水凝胶敷料；同时也降低金属有机框架化合物内部金属离子与有机物(如：卟啉环)的作用强度，使水凝胶中的金属有机框架化合物在一定时间内自发降解，从而防止临床使用时金属有机框架化合物在体内的长时间大量积累所引起的可能毒性。另一方面，在水凝胶中原位合成金属有机框架化合物难度较高，受水凝胶本身聚合物的影响，很难制备具有一定空间尺寸的完整金属有机框架化合物。2、使用光热剂进行光热治疗时，往往会对治疗区域周围的正常体细胞产生热刺激，引起一定的炎症反应，从而阻碍创面的快速愈合，进而增加进一步被感染的风险。因此，在敷料中加入姜黄素等的免疫调节剂可以有效降低创面及周围的炎症反应，从而与光热治疗协同配合，对微生物感染创面产生治疗与调理相整合的效果，促进创面在短时间内去感染、降炎症、快速愈合。
附图说明
3.图1a为本发明制备流程示意图；图1b为制备得到的四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物原子力显微镜图像；
4.图2为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)的1h-nmr核磁谱；
5.图3为水凝胶敷料(25％包含姜黄素的聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物(pela)与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cur/cupp-pela))在22℃(液态溶胶)与37℃(固态凝胶)下的状态照片；
6.图4为聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cupp-pela)和卟啉铜金属有机框架化合物(cupp)分别在室温下放置不同时间后透射电镜图；
7.图5为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)在不同功率808nm激光下温度随时间变化；
8.图6为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)在大鼠伤口形成的凝胶；
9.图7为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)在大鼠伤口形成的凝胶在不同功率808nm激光下温度随时间变化；
10.图8为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)在体外抑菌圈实验中形成的无耐三氯生绿脓杆菌生长区域的面积统计；
11.图9为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)对于小鼠成纤维细胞(l929)毒性实验(cck-8)结果；
12.图10为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)的小鼠成纤维细胞体外划痕愈合实验结果；
13.图11为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)对于巨噬细胞极化作用的实验结果；
14.图12为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)对于大鼠受损肝脏的止血效果；
15.图13为水凝胶敷料(cur/cupp-pela)对于大鼠耐三氯生绿脓杆菌感染创面的治疗效果；
16.图14为实施例效果图。
具体实施方式
17.本实施例涉及一种促进创面愈合的多功能水凝胶敷料，所述的水凝胶敷料为负载姜黄素的聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物(pela)与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cur/cupp-pela)，姜黄素通过疏水作用结合分散在水凝胶中。其具体制备步骤如下：
18.步骤1)如图1所示，将0.5g四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物与2.95g聚乙二醇2000在120℃的条件下抽真空搅拌1小时。
19.步骤2)在通氮气的条件下加入3.22g的己内酯和3.20g丙交酯。混合均匀以后加入20mg的辛酸亚锡，并在130℃下进行开环反应12小时。将反应产物在80℃热水中反复沉淀沉淀3次，然后冻干，从而获得聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物(pela)与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cupp-pela)，制备得到的cupp-pela的1h-nmr谱见图2。
20.步骤3)然后将80mg姜黄素和1g的cupp-pela共同溶解到10ml的丙酮溶液中。随后，通过旋转蒸发除去丙酮，从而得到负载姜黄素的cupp-pela(cur/cupp-pela所示。
21.步骤4)将上述制备获得的cur/cupp-pela溶解在磷酸缓冲液中形成25％的cur/cupp-pela液态溶胶，将其该液态溶胶在37℃下加热5分钟或滴加在大鼠体表5分钟，其将转变为固态凝胶，如图3、图4所示。
22.步骤5)将步骤4制备得到的25％包含姜黄素的聚(乙二醇-l-乳酸)二嵌段共聚物与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cur/cupp-pela)或聚(乙二醇-l-乳酸)二嵌段共聚物与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物(cupp-pela所示。
23.步骤5.1聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物与四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物相互作用的聚合物中卟啉铜金属有机框架化合物的降解性测试：将制备得到的cupp-pela放置在室温下0、1、3、5、7天后使用透射电镜进行成像获得四(羧基苯基)卟啉铜金属有机框架化合物形貌结构，金属有机框架化合物随着放置时间逐渐降解(图5所示。使用x射线光电子能谱分析(xps)，对cupp-pela中铜离子价态进行分析(图6)，结果显示在cupp-pela中铜离子更接近一价，这表明聚乙二醇中的氧原子更多的与金属有机框架化合物中的铜离子形成配位键，从而降低铜的价态，进而导致金属有机框架化合物内部铜离子与卟啉环的相互作用减弱，金属有机框架化合物整体稳定性下降。
24.步骤5.2cur/cupp-pela光热效应测试：通过测量cur/cupp-pela凝胶在不同功率近红外激光照射下的升温速度，可以判断材料的光热转化能力。首先，将待测0.5ml cur/cupp-pela溶胶(溶在磷酸缓冲液中，浓度25％)装入到的1.5ml的离心管中。以盛有相同体
积的25％pela的离心管为对照，使用不同功率密度的808nm近红外激光在距离心管10mm处照射材料。在照射的同时，使用非接触式近红外线探测仪记录离心管相关部位的温度变化。使用功率密度为0.4mw/cm2的激光照射5分钟后，凝胶温度升高至31.7℃；当照射激光功率密度达到0.8mw/cm2时，5分钟后凝胶升温到41.2℃；当照射激光功率密度达到1mw/cm℃时，5分钟后凝胶升温达到46.3℃，如图7所示。
25.将6-8周龄sd雄性大鼠麻醉(2.5％异氟烷)，使用电动修剪器小心地刮除毛发并用直径为10mm的打孔器制造出开放性创面。然后，将0.3ml cur/cupp-pela溶胶(溶在磷酸缓冲液中，浓度25％)滴入皮肤损伤处，静置5分钟后形成凝胶。使用808nm的近红外激光器在距离心管10mm处照射伤口。在照射的同时，使用非接触式近红外线探测仪记录相关部位的温度变化。当使用功率密度1mw/cm2激光照射5分钟后，伤口温度达到48.5℃，如图8所示。
26.步骤5.3水凝胶敷料(cur/cupp-pela)抑菌性测试：使用具有三氯生抗性的绿脓杆菌通过固态的kirby-bauer扩散试验检测水凝胶敷料(cur/cupp-pela)抑菌性。首先在60℃下预热配置好的含有三氯生的lb固体培养基(25g/l lb培养基、18g/l agrose、25μg/ml三氯生)。待其完全溶化后，按照每个培养皿10ml固体培养基的量，趁热浇铸至培养皿中来制备细菌培养板。待培养基冷却至室温后，将20μl具有三氯生抗性绿脓杆菌悬浮液(1
×
106将cfu/ml)用涂布棒均匀涂布在培养皿上。同时，用打孔器在培养皿上制造直径为8mm的孔并将25％cur/cupp-pela或者cupp-pela加入到孔中，使用1mw/cm
2 808nm激光照射后，培养皿在37℃下培养24小时。培养后的平板通过自动图像处理系统测量并记录每个样品的抑菌环直径，经过激光照射后凝胶周围区域无细菌生长，如图9所示。
27.步骤5.4水凝胶敷料(cur/cupp-pela)促进创面愈合测试：使用小鼠成纤维细胞体外划痕实验测试cur/cupp-pela对于创面愈合的作用。首先，以1
×
105细胞/孔的密度将l929细胞种植于6孔板中。待细胞在孔板中达到80％融合时，使用20微升移液器枪头均匀笔直的沿着孔板的正中央划出一条约200微米宽的间隙。随后，插入含有预先固化好的cur/cupp-pela凝胶(溶在磷酸缓冲液中，浓度25％，0.5ml)的transwell小室。12小时后，在cur/cupp-pela组中观察到的边界变得模糊，划痕面积减小，而cupp-pela组和空白组的边界仍然清晰可见。到24小时，cur/cupp-pela组中划痕区域已完全被细胞重新覆盖，而cupp-pela和空白组的缺口区域的基底仍有一部分暴露。结果表明，cur/cupp-pela可以明显地加快小鼠成纤维细胞迁移，促进体外划痕愈合，如图10所示。
28.步骤5.5水凝胶敷料(cur/cupp-pela)的免疫调节作用测试：使用巨噬细胞极化实验测试cur/cupp-pela的免疫调节作用。raw264.7巨噬细胞以6
×
105细胞/孔接种到6孔板中。在培养48小时后，在孔板上方插入含有预热凝固的cur/cupp-pela凝胶(溶在磷酸缓冲液中，浓度25％，0.5ml)的transwell小室。凝胶被1.0mw/cm2的808nm近红外光照射5分钟后，巨噬细胞消化收集作为光热刺激组。另外一组的巨噬细胞继续在6孔板中与带cur/cupp-pela凝胶transwell小室共培养24小时，然后消化收集并标记为处理组。提取所收集的2组细胞mrna，并通过qrt-pcr分析m1和m2巨噬细胞标记物表达水平，评估巨噬细胞极化情况。在光热刺激5分钟后，巨噬细胞显示出m1相关标记物inos表达升高，表明巨噬细胞在光热刺激下分泌大量的炎症因子。在和凝胶共培养24小时后，处理组细胞中m2相关标记物arg-1、vegf、il-10、tgf-β1表达升高，而m1相关标记物tnf-α以及il-1β出现下调，如图11所示。这些结果表明，光热治疗可能导致出现炎性m1型巨噬细胞，而在cur/cupp-pela继续治
疗24小时后，炎性m1型巨噬细胞可以被逆转为促进修复的m2巨噬细胞。
29.步骤5.6水凝胶敷料(cur/cupp-pela)体内止血效果测试：8周龄雄性sd大鼠8只随机平均分成对照组和cur/cupp-pela治疗组2组。实验前，将器具在80℃下真空干燥24小时，并用环氧乙烷灭菌，所有后续操作均在无菌条件下进行。首先用2.5％异氟醚麻醉动物，并将其背部放在加热垫(37℃)上。打开腹部，用手术剪刀沿头尾方向切开肝脏的左叶，沿切口将肝叶的两半分开。待肝脏出血3秒后，实验组将25％cur/cupp-pela涂于损伤部位。从材料给药开始记录止血时间。如图12，cur/cupp-pela治疗组在平均止血时间为15秒，明显快于未加药对照组。
30.步骤5.7水凝胶敷料(cur/cupp-pela)对于耐药菌感染创面的治疗测试：6-8周龄sd雄性大鼠随机平均分成正常组、感染组、cur/cupp-pela治疗组，每组8只。2.5％异氟烷麻醉大鼠，刮除背部毛发并用直径为10mm的打孔器制造出开放性创面。将0.2ml的三氯生抗性的绿脓杆菌悬液(2
×
108cfu/ml)滴加接种到感染组和cur/cupp-pela治疗组大鼠创面上。接种后的第二天，皮肤发生脓肿，形成感染性的皮肤缺损。随后，将0.3ml 25％的cur/cupp-pela溶液滴入cur/cupp-pela治疗组大鼠皮肤损伤处，静置5分钟后形成凝胶，使用808nm波长的激光(1.0mw/cm2)照射凝胶5分钟。其后没两天重复上述施加凝胶敷料并激光照射治疗过程，并拍照记录创面情况，直至第14天结束治疗，如图13所示。在接种细菌后，大鼠皮肤创面呈现出明显的溃烂和渗出等感染症状，cur/cupp-pela治疗组的大鼠在第4天创面开始结痂，这意味着感染的抑制和创面的修复；到第14天时，创面几乎完全愈合。而未治疗的感染组大鼠创面则在实验周期内一直出现渗出和溃烂，皮肤很难结痂，创面的感染一直存在，从而很难愈合。动物感染创面实验表明cur/cupp-pela在近红外光的照射下可以有效的抑制感染、消除炎症和促进伤口的愈合。治疗结束后，用0.5ml无菌磷酸缓冲液冲洗伤口收集创面细菌，并加入2.5ml lb培养基中，然后去100μl该细菌悬浮液涂抹在含三氯生的lb培养板上(lb培养基25g/l、琼脂糖18g/l、三氯生25μg/ml)并在37℃下培养12小时。然后对每个培养板进行菌落计数，从而检测创面的细菌残留量。如图14所示，从经过cur/cupp-pela治疗的伤口中很少检测到耐三氯生的细菌，而未治疗感染组存在大量细菌残留。该结果验证cur/cupp-pela水凝胶敷料在近红外照射下可以有效清除伤口上的耐药菌，促进伤口愈合。
31.与现有技术相比，本方法采用聚乙二醇分子先吸附在金属有机框架化合物中，再引发与己内酯和丙交酯的原位开环聚合，制备聚(乙二醇-l-乳酸)嵌段共聚物与金属有机框架化合物相互作用的聚合物的方法，使得聚乙二醇分子可以更大机会进入金属有机框架化合物网络中，形成更多的金属配位键，使金属有机框架化合物可以更强的结合在水凝胶聚合物中，形成宏观上均匀分散且稳定结合的金属有机框架化合物水凝胶敷料；同时也降低金属有机框架化合物内部金属离子与有机物(如：卟啉环)的作用强度，使水凝胶中的金属有机框架化合物在一定时间内自发降解，从而防止临床使用时金属有机框架化合物在体内的长时间大量积累所引起的可能毒性。另一方面，使用光热剂进行光热治疗时，往往会对治疗区域周围的正常体细胞产生热刺激，引起一定的炎症反应，从而阻碍创面的快速愈合，进而增加进一步被感染的风险。因此，在敷料中加入姜黄素等的免疫调节剂可以有效降低创面及周围的炎症反应，从而与光热治疗协同配合，对微生物感染创面产生治疗与调理相整合的效果，促进创面在短时间内去感染、降炎症、快速愈合。
32.上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。