囊泡的制作方法

囊泡
1.本技术是申请号为201480043243.1、申请日为2014年7月31日、发明名称为“囊泡”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/ep2014/066545的国家阶段申请，该国际申请要求于2013年7月31日提交的英国专利申请1313734.4和于2013年7月31日提交的英国专利申请1313735.1的权益，这些专利申请中的每一篇的全部内容均通过引用并入本文。
2.本发明涉及用于局部施用治疗性、代谢性、化妆性或结构性目标药剂(“aoi”)中的囊泡制剂以及施用aoi的方法。
3.美国专利号6,165,500描述一种用于施加提供有膜状结构的药剂的制剂，该膜状结构由一个或若干个两亲性分子层或两亲性载体物质组成，以具体地用于将该药剂运输至诸如皮肤和类似物质的天然屏障中并且穿过它们。这些transfersomes
tm
由一种或若干种组分组成，最常见的是碱性物质、一种或若干种边缘活性物质以及药剂的混合物。
4.美国专利申请公开号us 2004/0071767描述基于具有悬浮于药学上可接受的介质中的至少三种两亲性组分的复合聚集物的非甾体抗炎药(nsaid)的制剂。
5.美国专利申请公开号us 2004/0105881描述展开面聚集物，该聚集物可悬浮于适合的液体介质中并且包含至少三种两亲物(两亲性组分)并且能够改善活性物通过诸如皮肤的半渗透屏障的运输，特别是对于通过此类聚集物穿透屏障所进行的体内侵袭性药物施加。wo 2010/140061描述“空”囊泡制剂用于治疗深部组织疼痛的用途。wo 2011/022707描述“空”囊泡的其他制剂用于治疗与脂肪酸不足有关的病症和特别是与炎症有关的病症的用途。可附着治疗性实体的囊泡制剂描述于wo2011/022707和wo2010/140061中。
6.这些文献没有公开或教导用于局部施用aoi的囊泡制剂，aoi也不可共价键合至囊泡的组分，使得大部分的aoi在囊泡外部。在本技术的此部分中引用任何参考文献并不是承认该参考文献为本发明的现有技术。以上所述公开以引用的方式整体并入本文中。
7.在过去已在尝试将活性化合物(aoi)递送至体内时使用脂质体囊泡。
8.脂质体的柔性形式是由脂肪(例如，大豆磷脂酰胆碱)和脂肪酸或可穿过皮肤表面的表面活性剂(例如，吐温)的组合制成的囊泡。这些囊泡的表面活性剂中的聚乙二醇(“peg”)是吸湿性的并且沿水梯度穿透皮肤孔隙。这些囊泡已经测试为用于通过将所要运输的aoi放置于囊泡管腔内或将aoi并入囊泡的膜中作为膜组分之一经由经皮途径将其他aoi运输至体内的囊泡。
9.这些方法中的任一种必须依赖于某种形式的囊泡破坏，以便释放aoi。
10.此外，存在可能希望通过皮肤运输的产物，该产物太大而不能以这种方式并入传递体中，或者具有与这些囊泡的一般化学性质不相容的化学性质。
11.此外，在将一些含有peg的表面活性剂组分替换为aoi的情况下，此影响囊泡的柔性，并且去除一些动力。
12.本发明通过使aoi物理地附着于囊泡而规避这些问题，使得囊泡纯粹充当机械装置，从而将所需aoi牵引至皮肤表面之下。
13.本发明的这些囊泡可用于通过使此类部分或aoi附着于囊泡的组分以使得aoi位
于囊泡外侧而将其他部分/aoi经由经皮途径运输至体内。
14.因此，在第一方面中，本发明提供一种囊泡制剂，其包含脂质、表面活性剂以及aoi，其中aoi键合至囊泡的组分，使得aoi的至少一部分在囊泡的外表面上，并且在囊泡膜的外部。优选地，键合至aoi的组分是脂质和/或表面活性剂组分。至少一部分意指整个aoi中在囊泡外部的至少一部分，每个分子的至少5％、10％或20％，合适地40％或超过50％(就分子的尺寸或体积而言)在传递体的膜的外部。优选大部分aoi，更优选整个aoi分子在囊泡的外部。aoi可共价键合至组分，使得其存在于囊泡的外表面上。
15.在囊泡外部的aoi是指
‘
朝外’的那些aoi。在使键合至aoi的表面活性剂或脂质组分与未改性组分混合的囊泡制造期间，改性分子的取向不能被控制。因此，附着于aoi的分子中约50％将呈
‘
不恰当’取向，这意味着aoi的一部分将存在于囊泡管腔内。在呈“恰当”取向使得aoi在囊泡外部的改性分子中，就物理尺寸/体积而言，aoi分子本身的至少50％在囊泡膜的外部。制造过程可使得更低比例的aoi在囊泡外部，即aoi的外部浓度可在制剂中的全部aoi的1％至10％(包括2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％)、10％至50％、15％至45％、20％至40％或25％至30％(重量/体积)之间。外部浓度是指一旦泡囊已穿透皮肤，即可用于释放和/或发挥治疗活性的aoi的浓度。
16.本发明的囊泡制剂的益处涉及当aoi键合至囊泡并且局部施加时，aoi穿透皮肤的速度、深度以及量，以及aoi的尺寸和性质。
17.制剂可以是乳膏、洗剂、软膏、凝胶、溶液、喷雾、漆、摩丝或成膜溶液。
18.除键合至囊泡的aoi以外，囊泡制剂可能或可能不含有任何已知治疗剂。包含aoi的囊泡制剂可能或可能不含有任何其他生物活性或药物活性产品。生物活性或药物活性剂在此被定义为具有药理学、代谢或免疫学活性的试剂。
19.本发明涵盖包含一种或多种磷脂或硫脂和一种或多种有效递送aoi的表面活性剂的囊泡制剂。表面活性剂可以是非离子型的。
20.本发明的囊泡制剂能够(在不希望受理论约束的情况下)通过囊泡的独特性质实现其功能，该囊泡为由表面活性剂和脂质(诸如大豆磷脂酰胆碱)组成的双层囊泡。囊泡的独特性源于在制剂中包括特定量的非离子型表面活性剂，这在一定程度上改性磷脂膜，使得所得囊泡呈永久液晶态，并且由于表面活性剂还赋予膜稳定性，所以囊泡是超变形性的和稳定的(具有降低的硬度而不会破裂)。
21.囊泡制剂包含/成形为悬浮于例如局部施加的水性缓冲液中的囊泡。囊泡制剂的囊泡包含包围空核心的双层或单层膜。它们的尺寸从直径60nm变化到直径200nm，并且可从从100nm变化到直径150nm。囊泡为高度亲水性的，并且此性质与其超变形性一起成为其运输穿过皮肤的能力的关键。当将本发明的制剂施加至皮肤并且使其干燥时，囊泡的再水化驱动力与其可变形性组合使得囊泡移动到在皮肤渗透性屏障上方和下方具有更高水含量的区域中。这驱使它们通过皮肤孔隙和细胞内间隙移动。特定比率的表面活性剂与非离子型表面活性剂有助于囊泡的经皮递送。囊泡通过孔隙和细胞内间隙移动携带aoi或将aoi与它们拉在一起。
22.一旦它们穿过皮肤，本发明的囊泡最终以完整囊泡形式存在。囊泡的有效清除由于其相对大的尺寸而不会经由皮肤微血管(毛细血管)进行，但是假设它们与间隙液体一起运输至其他组织和/或皮肤施加部位下方的更深组织中。用标记有标记物分子(酮洛芬)的
本发明囊泡进行的临床前研究表明，囊泡未进入脉管，因为在局部施加之后，在局部观测到高浓度的标记物分子，并且全身性吸收较低。
23.aoi可键合至囊泡的表面活性剂组分或脂质组分。或者，囊泡的脂质组分与表面活性剂组分两者均可具有与其键合的aoi。
24.制剂的囊泡可具有单一或多种键合至其外表面的aoi。在键合多种aoi的情况下，aoi可以是全部相同的，即同质的，或aoi可以是不同的，即异质的。
25.aoi可以是元素、离子、小分子、碳水化合物、脂质、氨基酸、肽、蛋白质、大分子或大环分子。aoi可以是微量营养素。
26.aoi可以是皮肤结构蛋白(诸如弹性蛋白或胶原蛋白)、治疗性蛋白质、卟啉或含发色团的大分子、维生素、二氧化钛、氧化锌、黑色素或黑色素类似物。aoi可以是肽或抗炎药，诸如nsaid。具体地说，aoi可以是四肽-7、三肽1、抗坏血酸、萘普生或双氯芬酸。
27.所要键合的aoi可共价或以其他方式直接键合至囊泡的磷脂或表面活性剂组分或囊泡的脂质组分。可能需要使用共价或以其他方式键合至脂肪酸、表面活性剂或脂质组分与aoi的键或桥。在一个实例中，如果要添加无机aoi(例如金属盐或金属氧化物)，那么可首先使另一接头(例如金属螯合剂，诸如edta)结合至囊泡组分。在另一实例中，可能希望使用更长的分子，例如聚合物(诸如聚乙二醇；peg)，以促成键合过程的功效和/或所键合的aoi的有效性。当希望保持aoi距离囊泡一定距离以防止其干扰膜本身时，此类接头/更长桥接分子将特别具有益处。如果aoi特别疏水，那么此干扰可产生。
28.大的分子或大分子可共价键合至囊泡组分。实例包括结构性皮肤蛋白质，诸如胶原蛋白和弹性蛋白；治疗性蛋白质；以及酶。
29.可使多种aoi键合至脂质或表面活性剂组分，以存在于囊泡的外表面上，使得一旦通过皮肤被吸收，它们即继续存在于囊泡的表面上。实例包括抗氧化剂；维生素；无机化合物，诸如tio2和zno；用于光动力疗法中的卟啉分子。
30.通过皮肤将维生素运输至体内可代替产生损失的维生素的能力(例如，维生素d)，增强皮肤的(或任何其他器官的)保护和自我修复的能力(例如，维生素c和e)，或者治疗皮肤病或其他病状，诸如脂溢性皮炎(例如维生素b7)。提及皮肤包括身体的整个皮肤和任何其他外皮，诸如耳、鼻、喉以及眼睛的上皮，包括眼睛的巩膜，以及其他粘膜，诸如阴道和肛门/直肠。
31.维生素d实际上是一组负责增强钙和磷酸盐的肠道吸收的脂溶性化合物。此组中最重要的是d3(胆钙化醇)和d2(麦角钙化醇)。维生素d缺乏引起骨软化症(儿童佝偻病)并且已将低水平与低骨密度相关联。
32.哺乳动物皮肤通过uv辐射作用于前体7-脱氢胆固醇而形成维生素d3，并且提供约90％的维生素d。防晒剂吸收紫外线并且阻止其到达皮肤。据报道，基于uvb光谱的防晒系数(spf)为8的防晒剂可使维生素d合成能力降低95％，而spf为15的防晒剂可使合成能力降低98％。
33.最近，出现了高spf防晒剂(25spf与50spf之间)和完全阳光阻断产品的使用增加的趋势，因为对晒黑的危险的公众意识已增长。此外，化妆护肤品与彩妆产品均已向其配方中添加具有15、20以及25spf的防晒剂，以提供一定程度的防晒作用。
34.当制剂包含维生素d3(这并不是说它另外不包含维生素c和/或e和/或b7)时，制剂
可并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品中，以补充低维生素d水平。低维生素d水平可因低光照条件或使用阳光阻断物(其可以阻止体内制造维生素d)而引起。
35.因此，本发明可通过将维生素拴系至柔性经皮囊泡(即包含脂质和表面活性剂的制剂)的外表面而使维生素d3/胆钙化醇与柔性经皮囊泡缔合。然后可将所得制剂包括于防晒剂、晒后制剂以及包括防晒剂的化妆产品中。此“囊泡/维生素d组合”将穿透皮肤，并且将其有效载荷递送至表皮中的基底层和棘层。
36.在体内，胆钙化醇(维生素d3)首先在肝脏中转化成钙二醇。循环钙二醇然后在肾脏中转化成三醇(维生素d的生物活性形式)。低血钙二醇(25-羟基-维生素d)可因避开阳光而产生。因此，本发明包括借助于键合或拴系至囊泡组分而将钙二醇或钙三醇与经皮囊泡缔合。
37.某些其他维生素(例如维生素c和维生素e)具有重要的抗氧化性质，并且这已经被看到，它们被并入护肤品，以减轻老化和皮肤损伤的迹象。
38.维生素e的最具生物活性形式是脂溶性α-生育酚，并且本发明的一个实施方案期望将α-生育酚与囊泡组分缔合以并入包括防晒剂和晒后产品的护肤制剂中以使阳光损伤得以改善。
39.维生素c(水溶性抗坏血酸)是包括若干胶原蛋白合成反应的许多酶促反应中的辅因子。这些反应在伤口愈合和预防毛细管出血中是重要的。因此，本发明包括将抗坏血酸与囊泡组分缔合，以将两者并入护肤和防晒制剂中以改善对胶原蛋白的损害，并且并入伤口护理产品中。
40.因此，当微量营养素包含维生素c和/或维生素e时，可将制剂并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品中，以补充表皮和真皮维生素c和/或维生素e，并且阻止或协助修复被阳光损伤或老化的皮肤。
41.维生素b7(水溶性生物素)是羧化酶的辅酶。生物素的缺乏可引起呈皮疹形式的皮炎。此外，苯丙酮尿症(不能分解苯丙氨酸)患者展现湿疹和脂溢性皮炎形式，其可通过增加膳食生物素得以改善。
42.因此，当微量营养素包含维生素b7时，可将制剂并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品中，以补充表皮和真皮维生素b7，并且改善与此维生素缺乏有关的皮肤病。
43.诸如四肽-7或三肽-1的肽可键合至囊泡膜的脂肪酸或表面活性剂组分。四肽-7可适用于对抗炎症并且借助于产生胶原蛋白来刺激皮肤再生。这意味着，它在皮肤护理和抗衰老产品中特别有用。三肽-1具有同样的作用。通过皮肤的外层有效递送可在更低水平/浓度下提供增加的效果，从而使由白介素抑制产生的可能的副作用减至最少。
44.非甾体抗炎药(nsaid)是止痛剂，其通常用于缓解骨关节炎症状、运动相关的关节疼痛、背部疼痛、头痛以及牙痛。nsaid的实例是阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸以及萘普生。另外，直接将此类药物有效并且高效递送至疼痛和炎症部位可使得使用更低剂量和/或靶向型剂量，并且因此减少或消除诸如胃肠道问题、肾脏问题以及心脏问题等副作用。
45.本发明可包括将更大量的小的非活性aoi键合至囊泡的表面，使得一旦在皮肤下方，其即变得锚定并且囊泡本身的存在的益处(例如保水、结构支撑)的持久性可得以延长。
46.aoi可键合(或附着或拴系)至囊泡的表面活性剂组分。如果分子具有羟基，那么键合至表面活性剂可通过酯键直接键合至表面活性剂上。一种替代键合方法是用aoi取代表面活性剂(例如，在吐温(tween，一种聚乙二醇聚合物)的情况下)的原子或官能团。第三种键合方法是任选经由酯键直接键合至脂肪酸。如果aoi是无机分子，那么可首先将另一连接分子结合至囊泡组分，例如在金属盐情况下是诸如edta等金属螯合剂。如果希望aoi可固定在距离囊泡某一距离以使其效率最大化(例如，以暴露作为酶的aoi上的活性位点)，那么可将连接分子，例如聚合物链(例如聚乙二醇)键合至囊泡组分与aoi两者。
47.aoi可附着(键合或拴系)至囊泡的脂质组分。键合至脂质可经由任何甘油羟基通过酯键，例如通过消除脂肪酸和用aoi置换来实现。或者，附着方法可以是通过置换磷脂部分，使得最终分子具有两个脂肪酸链以及拴系的aoi。改性脂质正常插入脂肪族区域并且在甘油模板上可获得自由转动，拴系的aoi将定位于囊泡的外侧。如果需要aoi被拴系至囊泡更长的持续时间，那么酰胺键可用作更稳定的替代物。举例来说，如果aoi的靶标是深处组织，诸如关节，而不是上部真皮层，那么这可能是理想的。可使用更不稳定与更稳定的键的组合(例如分别为酯和酰胺)来实现aoi的交错释放。
48.键合至任何组分的方法可以是可水解或不可水解的。如果希望aoi一旦在皮肤内或皮肤下应分离，那么键应为可水解的。如果希望键合的aoi一旦在皮肤内或皮肤下应保持键合至囊泡，那么键应为不可水解的。
49.aoi可以共价键合或缀合至膜组分；该键可以是亲水或疏水的或静水的；该键可以是氢键、离子键。
50.术语“键合”、“附着”以及“拴系”在本文中通篇可互换地用于涵盖所有上文所提及的键。
51.本发明可用于将aoi施用至哺乳动物的皮肤。可包括任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、马、食品生产动物以及宠物。aoi可以是治疗性实体或化妆性实体或非治疗性或非化妆性实体，或者或此外，aoi可以是代谢性和/或结构性的。
52.因此，本发明的第二方面提供一种囊泡制剂，其包含脂质、表面活性剂以及aoi，其中aoi键合或附着至囊泡的组分，使得大部分aoi在囊泡的外部，以用于通过受试者的皮肤递送aoi，其中制剂是局部施加。
53.本发明的第三方面提供一种通过受试者的皮肤递送aoi的方法，该方法包括以足以穿透皮肤以递送aoi的量向患者的皮肤局部施加本发明的囊泡制剂。
54.本发明还提供一种通过患者的皮肤递送超过一种aoi的方法，该方法包括局部施加如下本发明囊泡制剂，其中泡囊具有与其键合的异质的多种aoi；和/或施加如下本发明囊泡制剂，其中制剂是囊泡的混合物，各制剂中的囊泡具有与其键合的不同的单一aoi或同质的多种aoi。
55.囊泡制剂中的脂质可以是磷脂。可以存在第二脂质，其可以是溶血磷脂。脂质可以是硫脂。表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。
56.本发明的制剂形成囊泡或其他展开面聚集体(esa)，其中囊泡制剂具有改善的穿过诸如皮肤等半渗透屏障的渗透能力。囊泡的尺寸防止渗透到脉管中，并且因此防止全身性递送。虽然不限于任何作用机制，但是本发明的制剂能够形成以可变形性和/或适应性为特征的囊泡。
57.囊泡制剂的具体组成将决定于aoi可递送至皮肤的哪一层。某些制剂将仅穿透皮肤的上层，而其他制剂将行进至更深层。囊泡制剂将根据所要递送的aoi来加以选择。举例来说，如果胶原蛋白是要递送至皮肤深处的aoi，那么它将附着至能够穿透皮肤深层的囊泡制剂。
58.作为第四方面，本发明提供一种制备根据本发明的第一至第三方面的囊泡制剂的方法。该方法包括使aoi附着至囊泡组分，将aoi/组分与未改性磷脂和表面活性剂混合，以形成本发明的囊泡制剂。
59.本发明的第五方面涉及用于治疗疾病的第一方面的囊泡制剂。所要治疗的疾病将取决于拴系至囊泡的aoi。
60.本发明提供一种根据第一方面的囊泡制剂，其中aoi是维生素，诸如维生素c、维生素e、维生素d或维生素a，其用于皮肤护理产品中，用于抗老化产品中或用于防晒(防uv)产品。
61.还提供一种根据本发明的囊泡制剂，其中aoi是肽，诸如四肽7或三肽1，其用于抗老化产品中，用于促进或加强胶原蛋白产生，或用于化妆品中。
62.还提供一种根据本发明的囊泡制剂，其中aoi是nsaid，例如萘普生或双氯芬酸，其用于治疗骨关节炎，用于治疗关节炎关节疼痛，用于治疗肌肉疼痛，用于治疗肌肉拉伤或用于治疗炎症。
63.如将要理解的，可将其他aoi拴系至本发明的囊泡以治疗多种疾病。
64.本发明的第一方面的所有特征加以必要修改适用于第二至第五方面。
65.在制造囊泡期间，调节改性组分(即附着有aoi)与未改性组分(即未附着aoi)的比率以控制经多重改性的组分(因此多种aoi)并入囊泡的程度以及含有至少一种aoi的囊泡的数目。在一定比例的未改性囊泡保留于最终制剂中的情况下，这些囊泡通过跟随改性形式进入皮肤孔隙并且从后面“推”来补充这些改性形式的“牵拉”作用。在最终制剂中改性囊泡的百分比(呈占总囊泡的比例形式)可介于0.1％至100％或1％至100％、10％至90％、25％至75％或50％范围内。
66.为确保高比例囊泡具有所附着的所需aoi，或具有所附着的多种aoi，可使用100％改性表面活性剂来与脂质混合(或反之亦然)。与之对比的是，为获得更大稀释效应，在仅少数囊泡具有所附着的aoi或仅单一aoi附着于囊泡的情况下，使用例如5％改性与95％未改性表面活性剂的掺混物。然而，一般来说，将80％与10％之间的脂质或表面活性剂用改性脂质或表面活性剂组分替换。可替换75％与15％之间的脂质或表面活性剂组分。适当地，可将约70％、65％、60％、50％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％之间或这些值之间的任何范围内的脂质组分或表面活性剂组分分别用键合至aoi的改性脂质或改性表面活性剂组分替换。可替换一定比例的脂质与表面活性剂组分两者。进一步精制可通过提取改性囊泡并且将其与纯的未改性囊泡一起混合至精确“剂量”中，或通过与用不同aoi改性的囊泡混合来进行。一般来说，本文所用的命名法和本文所描述的有机化学、药物化学以及药理学中的实验程序是那些熟知的实验程序并且在本领域中常用。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语通常具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
67.如本文所用，实现特定结果的“足量”，“有效量”或“足以实现特定结果的量”是指本发明的制剂有效产生所要作用的量，该所要作用任选是治疗作用(即，通过施用治疗有效
量)。换言之，“治疗有效”量是提供至少一种临床症状的一些缓和、缓解以及/或者减少的量。与可通过本发明的方法治疗的病症相关的临床症状为本领域技术人员所熟知的。此外，本领域技术人员将了解，治疗作用不需要是完全的或根治的，只要为受试者提供一些益处即可。
68.如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”意指受试者病状的严重程度减轻或至少部分改良或改善并且/或者实现至少一种临床症状的一些缓和、缓解以及/或者减少并且/或者存在病状进展的抑制或延迟和/或疾病或病发作进展的延迟。术语“治疗(treat/treating/treatment of)”也意指管理疾病状态。“预防”意指预防性治疗。
69.如本文所用，在参照本发明的制剂使用时，术语“药学上可接受的”表明制剂不在施用制剂的受试者中产生不可接受水平的刺激。优选地，此水平将为足够低的，以提供监管机构批准适合的制剂。
70.如本文关于数值所用，术语“约”意指围绕特定数值的范围，该特定数值包括预期将由进行测量时的正常实验误差产生的数值。举例来说，在某些实施方案中，术语“约”当与特定数值结合使用时意指 -20％，除非特别说明为数值的 -1％、 -2％、 -3％、 -4％、 -5％、 -10％、 -15％或 -20％。
71.本文所提供的本发明制剂包含任选悬浮于药学上可接受的介质中的至少一种脂质(优选磷脂或硫脂)、至少一种表面活性剂(优选非离子型表面活性剂)，该介质优选是水溶液，其优选具有介于3.5至9.0、优选4至7.5范围内的ph值。本发明的制剂可任选含有缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、杀微生物剂、抗微生物剂、润肤剂、助溶剂以及/或者增稠剂。本发明的制剂可包含超过一种脂质、优选超过一种磷脂的混合物。本发明的制剂可基本上由以下各项组成：至少一种脂质，优选磷脂；至少一种表面活性剂，优选非离子型表面活性剂；药学上可接受的载体；以及任选缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、杀微生物剂、抗微生物剂、润肤剂、助溶剂以及/或者增稠剂。本发明的制剂可由以下各项组成：至少一种脂质，优选磷脂；至少一种表面活性剂，优选非离子型表面活性剂；药学上可接受的载体；以及以下中的一种或多种：缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、杀微生物剂、抗微生物剂、润肤剂、助溶剂以及增稠剂。
72.表1列出了根据本发明的优选磷脂。
73.表1：
[0074][0075][0076]
在本公开的背景下的优选脂质是不带电的并且形成稳定的、充分水合的双层；磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺以及鞘磷脂是此类脂质的最突出的代表。那些脂质中的任一种均可具有如表1所列的链；脂质链呈无序状态的形成流体相双层的那些脂质是优选的。
[0077]
不同的带负电荷(即阴离子)的脂质也可并入囊泡脂质双层中。此类带电荷脂质的有吸引力的实例是磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇以及(某种程度上不那么优选的)磷脂酸(和其烷基酯)或磷脂酰丝氨酸。任何本领域技术人员均将认识到，使得囊泡仅来自带电荷脂质比与电中性双层组分组合使用它们更不可取。在使用带电荷脂质的情况下，必须选择缓冲液组合物和/或ph护理剂，以确保所需程度的脂质头部基团离子化和/或所需程度的带相反电荷的药物与脂质分子之间的静电相互作用。此外，正如中性脂质那样，带电荷双层脂质组分原则上可具有如表1所列的任何磷脂链。然而，归因于使增加脂肪链流动性的作用增大的囊泡适应性并且归因于脂质在流体相中彼此混合的能力更好，形成流体相脂质双层的链明显是优选的。
[0078]
源于脂肪酸或脂肪醇的脂质链典型地在以下碱性脂肪酸链类型之中进行选择：
[0079][0080][0081]
其他双键组合或位置也是可能的。
[0082]
本发明的优选脂质是例如天然磷脂酰胆碱，其过去被称为卵磷脂。它可获自蛋(富含棕榈酸c16:0和油酸c18:1，但是也包含硬脂酸c18:0、棕榈油酸c16:1、亚麻酸c18:2以及花生四烯酸c20:4(m，基团)、大豆(富含不饱和c18链，但是也含有一些棕榈酸基团，以及一些其他基团)、椰子(富含饱和链)、橄榄(富含单不饱和链)、番红花(红花)和向日葵(富含正-6亚油酸)、亚麻籽(富含正-3亚麻酸)、鲸脂肪(富含单不饱和正-3链)、樱草或报春花(富含正-3链)。优选的天然磷脂酰基乙醇胺(过去被称为脑磷脂)常常源于蛋或大豆。优选的生物来源的鞘磷脂典型地从蛋或脑组织制备。优选磷脂酰丝氨酸也典型地源于脑部物质，而磷脂酰甘油优先提取自诸如大肠杆菌(e.coli)等细菌，或者另外借助于使用磷脂酶d以天然磷脂酰胆碱为起始物质进行的磷脂酰基转移来制备。优选使用的磷脂酰肌醇是分离自商业大豆磷脂或牛肝脏提取物。优选磷脂酸是提取自任何所提及的来源，或者使用磷脂酶d由适合的磷脂酰胆碱制备。
[0083]
此外，也可以使用合成的磷脂酰胆碱。
[0084]
制剂中的脂质的量是按重量计约1％至约12％、约1％至约10％、约1％至约4％、约
4％至约7％或约7％至约10％。脂质可以是磷脂。磷脂可以是磷脂酰胆碱。
[0085]
制剂中的脂质可不包括烷基-溶血磷脂。制剂中的脂质可不包括多烯磷脂酰胆碱(polyeneylphosphatidylcholine)。
[0086]
术语“表面活性剂”具有其通常的含义。相关表面活性剂和表面活性剂相关定义的列表提供于ep 0 475 160al(参见例如，第6页第5行至第14页第17行)和美国专利号6,165,500(参见例如，第7栏,第60行至第19栏,第64行)(其各自以全文引用的方式并入本文中)以及诸如工业表面活性剂手册(handbook of industrial surfactants)等适当的表面活性剂或药物手册或美国药典(us pharmacopoeia)、欧洲药典(pharm.eu.)中。在一些实施方案中，表面活性剂是在2002年1月31日公开的美国专利公开号2002/0012680al的表1-18中所描述的那些，这些公开的公开内容以全文引用的方式并入本文中。因此，以下列表仅提供特别常见或适用于与本专利申请结合使用的若干表面活性剂类别的选择，而绝不是完全的或排他的。要根据本公开使用的优选表面活性剂包括hlb大于12的那些。列表包括离子化长链脂肪酸或长链脂肪醇、长链脂肪铵盐(诸如烷基-或烯酰基-三甲基-、-二甲基-以及-甲基-铵盐、烷基-或烯酰基-硫酸盐)、长脂肪链二甲基-氨基氧化物(诸如烷基-或烯酰基-二甲基-氨基氧化物)、长脂肪链(例如)烷酰基二甲基-氨基氧化物以及尤其十二烷基二甲基-氨基氧化物、长脂肪链(例如)烷基-n-甲基葡糖酰胺和烷酰基-n-甲基葡糖酰胺(诸如mega-8、mega-9以及mega-io)、n-长脂肪链-n,n-二甲基甘氨酸(例如n-烷基-n,n-二甲基甘氨酸)、3-(长脂肪链-二甲基铵基)-烷烃-磺酸盐(例如3-(酰基二甲基铵基)-烷烃磺酸盐)、磺基琥珀酸盐的长脂肪链衍生物(诸如双(2-乙基烷基)磺基琥珀酸盐)、长脂肪链-磺基甜菜碱(例如酰基-磺基甜菜碱)、长脂肪链甜菜碱(诸如empigen bb或zwittergent-3-16、-3-14、-3-12、-3-10或-3-8)；或者聚乙二醇-酰基苯基醚(尤其九(乙二醇)-辛基-苯基醚)、聚乙烯-长脂肪链-醚(尤其聚乙烯-酰基醚，诸如九乙烯-癸基醚、九乙烯-十二烷基醚或八乙烯-十二烷基醚)、聚乙二醇-异酰基醚(诸如八乙二醇-异十三烷基醚)、聚乙二醇-脱水山梨醇-长脂肪链酯(例如聚乙二醇-脱水山梨醇-酰基酯)以及尤其聚氧乙烯-单月桂酸酯(例如聚山梨醇酯20或吐温20)、聚氧乙烯-脱水山梨醇-单油酸酯(例如聚山梨醇酯80或吐温80)、聚氧乙烯-脱水山梨醇-单月桂烯油酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇-单岩芹酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇-单反油酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇-肉豆蔻烯酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇-棕榈油酸酯(palmitoleinylate)、聚氧乙烯-脱水山梨醇-岩芹油酸酯；聚羟基乙烯-长脂肪链醚(例如聚羟基乙烯-酰基醚，诸如聚羟基乙烯-月桂基醚、聚羟基乙烯-肉豆蔻酰基醚、聚羟基乙烯-鲸蜡基硬脂酰基、聚羟基乙烯-棕榈基醚、聚羟基乙烯-油酰基醚、聚羟基乙烯-棕榈油酰基醚、聚羟基乙烯-亚油基、聚羟基乙烯-4或6或8或10或12-月桂基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、棕榈油酰基、油酰基或亚油酰基醚(brij系列)，或者(在相应的酯中)聚羟基乙烯-月桂酸酯、-肉豆蔻酸酯、-棕榈酸酯、-硬脂酸酯或-油酸酯(尤其聚羟基乙烯-8-硬脂酸酯(myrj 45)和聚羟基乙烯-8-油酸酯)、聚乙氧基化蓖麻油40(cremophor el)、脱水山梨醇-单长脂肪链(例如烷基化(arlacel或span系列)，尤其为脱水山梨醇-单月桂酸酯(arlacel 20、span 20))、长脂肪链(例如)酰基-n-甲基葡糖酰胺、烷酰基-n-甲基葡糖酰胺(尤其癸酰基-n-甲基葡糖酰胺、十二烷酰基-n-甲基葡糖酰胺)、长脂肪链硫酸盐(例如烷基-硫酸酯、烷基硫酸盐，诸如月桂基硫酸盐(sds)、油酰基硫酸酯)；长脂肪链硫代葡萄糖苷，诸如烷基硫代葡糖苷以及尤其庚基-、辛基-以及壬基-β-d-硫代吡喃葡糖苷；各种碳水化合物(诸如戊糖、己糖
以及二糖)的长脂肪链衍生物，尤其烷基-葡萄糖苷和麦芽糖苷，诸如己基-、庚基-、辛基-、壬基-以及癸基-β-d-吡喃葡糖苷或d-吡喃麦芽糖苷；胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺胆酸、脂肪酸的另外的盐(尤其钠盐)，尤其油酸盐、反油酸盐、亚油酸盐、月桂酸盐或豆蔻酸盐，其通常大部分呈钠形式；溶血磷脂、正-十八烯-甘油磷脂酸、十八烯-磷酰基甘油、十八烯-磷酰基丝氨酸、正-长脂肪链-甘油基-磷脂酸(诸如n-酰基-甘油基-磷脂酸，尤其月桂基甘油基-磷脂酸、油酰基-甘油基-磷脂酸)、正-长脂肪链-磷酰基甘油(诸如n-酰基-磷酰基甘油，尤其月桂基-、肉豆蔻酰基-、油酰基-或棕榈油酰基-磷酰基甘油)、正-长脂肪链-磷酰基丝氨酸(诸如n-酰基-磷酰基丝氨酸，尤其月桂基-、肉豆蔻酰基-、油酰基或棕榈油酰基-磷酰基丝氨酸)、正-十四烷基-甘油基-磷脂酸、正-十四烷基-磷酰基甘油、正-十四烷基-磷酰基丝氨酸、相应反油酰基-、十八烯基(vaccenyl)-溶血磷脂、相应短链磷脂，以及所有表面活性物并且因此膜去稳定多肽。通常选择呈流体状态或至少与载体聚集物中的流体链状态的维持相容的表面活性剂链。
[0087]
表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。表面活性剂可以按重量计约0.2％至10％、约1％至约10％、约1％至约7％或约2％至5％存在于制剂中。非离子型表面活性剂可选自由以下组成的组：聚氧乙烯脱水山梨糖醇(聚山梨醇酯表面活性剂)、聚羟基乙烯硬脂酸酯或聚羟基乙烯月桂基醚(brij表面活性剂)。表面活性剂可以是聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-单油酸酯(例如聚山梨醇酯80或吐温80)或者吐温20、40或60。聚山梨醇酯的任何链可具有12至20个碳原子。聚山梨醇酯在制剂中可以是流体，其可含有一个或多个双键、分支或环状基团。
[0088]
表面活性剂可用另外的peg分子或其他亲水部分进行改性。
[0089]
除改性脂质或表面活性剂外，本发明的制剂可包含仅一种脂质和仅一种表面活性剂。或者，本发明的制剂可包含超过一种脂质和仅一种表面活性剂，例如，两种、三种、四种或更多种脂质和一种表面活性剂。或者，本发明的制剂可包括仅一种脂质和超过一种表面活性剂，例如，两种、三种、四种或更多种表面活性剂和一种脂质。本发明的制剂可包括超过一种脂质和超过一种表面活性剂，例如，两种、三种、四种或更多种脂质和两种、三种、四种或更多种表面活性剂。
[0090]
本发明的制剂可具有一定范围的脂质与表面活性剂比率(包括键合至aoi的脂质和/或表面活性剂)。该比率可以摩尔术语表示(mol脂质/mol表面活性剂)。制剂中的脂质与表面活性剂的摩尔比可以是约1:3至约30:1、约1:2至约30:1、约1:1至约30:1、约2:1至约20:1、约5:1至约30:1、约10:1至约30:1、约15:1至约30:1或约20:1至约30:1。在本发明的制剂中脂质与表面活性剂的摩尔比可以是约1:2至约10:1。该比率可以是约1:1至约2:1、约2:1至约3:1、约3:1至约4:1、约4:1至约5:1或约5:1至约10:1。该摩尔比可以是约10.1至约30:1、约10:1至约20:1、约10:1至约25:1以及约20:1至约25:1。脂质与表面活性剂比率可以是约1.0:1.0、约1.25:1.0、约1.5/1.0、约1.75/1.0、约2.0/1.0、约2.5/1.0、约3.0/1.0或约4,0/1.0。本发明的制剂还可以具有改变量的总量的以下组分：组合的脂质和表面活性剂(ta)。ta量可以总组合物的重量百分比表述。ta可以是约1％至约40％、约5％至约30％、约7.5％至约15％、约6％至约14％、约8％至约12％、约5％至约10％、约10％至约20％或约20％至约30％。ta可以是6％、8％、9％、10％、12％、14％、15％或20％。
[0091]
对于本发明的制剂，所选择的总脂质量和脂质/表面活性剂比率(mol/mol)的范围
描述于下表中：
[0092]
表2：总量和脂质与表面活性剂比率
[0093][0094][0095]
本发明的制剂可任选含有以下成分中的一种或多种：助溶剂、螯合剂、缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、杀微生物剂、润肤剂、润湿剂、润滑剂以及增稠剂。任选组分的优选量描述如下。
[0096] 摩尔(m)或相对w％*抗氧化剂：
ꢀꢀ
主要：
ꢀꢀ
丁基化羟基茴香醚，bha 0.1-8丁基化羟基甲苯bht 0.1-4百里酚 0.1-1焦亚硫酸盐1-5mm 亚硫酸氢盐1-5mm 硫脲(mw＝76.12)1-10mm 单硫代甘油(mw＝108.16)1-20mm 没食子酸丙酯(mw＝212.2) 0.02-0.2抗坏血酸盐(mw＝175.3

离子)1-10mm 棕榈基-抗坏血酸酯 0.01-1生育酚-peg 0.5-5
辅助(螯合剂)
ꢀꢀ
edta(mw＝292)1-10mm egta(mw＝380.35)1-10mm 除铁灵(desferal)(mw＝656.79)0.1-5mm 缓冲液
ꢀꢀ
乙酸盐30-150mm 磷酸盐10-50mm 三乙醇胺30-150mm [0097]
*为总脂质量的百分比
[0098]
本发明的制剂可包含缓冲液，以将水溶液的ph值调节为ph 3.5至ph 9、ph 4至ph 7.5或ph 6至ph 7的范围。缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液以及丙酸盐缓冲液。
[0099]
本发明的制剂典型地在水性介质中配制。制剂可在存在或不存在诸如低级醇等助溶剂的情况下加以配制。本发明的制剂可包含按重量计至少20％水。本发明的制剂可包含按重量计约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％水。制剂可包含按重量计约70％至约80％水。
[0100]
通常添加“杀微生物剂”或“抗微生物剂”，以减小药物制剂中的细菌计数。杀微生物剂的一些实例是短链醇，包括乙醇和异丙醇、氯丁醇、苯甲醇、氯苯甲醇、二氯苄醇、六氯酚；酚类化合物，如甲酚、4-氯-间-甲酚、对-氯-间-二甲苯酚、双氯酚、六氯酚、聚维酮-碘；对羟基苯甲酸酯，尤其烷基-对羟基苯甲酸酯，诸如甲基-、乙基-、丙基-或丁基-对羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸苄酯；酸，诸如山梨酸、苯甲酸及其盐；季铵化合物，诸如烷基铵盐，例如溴化物、苯甲羟铵盐，诸如氯化物或溴化物、十六烷基三甲铵盐，例如，溴化物、酚烃铵(phenoalkecinium)盐，诸如苯酚十二烷基溴化铵、鲸蜡基吡啶氯化物以及其他盐；此外，诸如苯基汞乙酸盐、硼酸盐或硝酸盐等汞化合物、硫柳汞、氯己定或其葡酸盐，或生物来源的任何抗菌活性化合物，或其任何合适的混合物。
[0101]“抗氧化剂”的实例是丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)以及二-叔丁基苯酚(ly178002、ly256548、hwa-131、bf-389、ci-986、pd-127443、e-51或19、bi-l-239xx等)、叔丁基氢醌(tbhq)、没食子酸丙酯(pg)、l-o-己基-2,3,5-三甲基氢醌(hthq)；芳香族胺(二苯胺、对-烷基硫代-邻-茴香胺、乙二胺衍生物、咔唑、四氢茚并吲哚)；酚和酚酸(愈创木酚、氢醌、香草醛、没食子酸以及其酯、原儿茶酸、奎尼酸、丁香酸、鞣花酸、水杨酸、去甲二氢愈创木酸(ndga)、丁子香酚)；生育酚(包括生育酚(α、β、γ、δ)以及其衍生物，诸如生育酚-酰化物(例如-乙酸酯、-月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、-棕榈酸酯、-油酸酯、-亚油酸酯等，或任何其他适合的生育酚-硫辛酸酯)、生育酚-poe-琥珀酸酯；trolox和相应酰胺和硫代甲酰胺类似物；抗坏血酸和其盐、异抗坏血酸盐、(2或3或6)-邻-烷基抗坏血酸、抗坏血酸酯(例如6-邻-月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基-、油酰基或亚油酰基-l-抗坏血酸等)。也适用的是优选氧化的化合物，诸如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫脲；螯合剂，诸如edta、gdta、除铁灵；各种内源性防御系统，诸如转铁蛋白、乳铁蛋白、铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白、血凝乳酶、白蛋白、葡萄糖、泛醇-10)；酶抗氧化剂，诸如超氧化物歧化酶和具有类似活性的金属络合物，包括过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及较不复杂的分子，诸如β-胡萝卜素、
胆红素、尿酸；类黄酮(黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、花青素苷)；n-乙酰半胱氨酸、巯乙磺酸钠、谷胱甘肽、硫醇组氨酸衍生物、三唑；单宁酸、肉桂酸、羟基肉桂酸以及其酯(香豆酸和酯、咖啡酸和其酯、阿魏酸、(异-)绿原酸、芥子酸)；香料提取物(例如从丁香、肉桂、鼠尾草、迷迭香、肉豆蔻衣、牛至、多香果、肉豆蔻)；鼠尾草酸、鼠尾草酚、卡斯酸(carsolic acid)；迷迭香酸、迷迭香二酚、龙胆酸、阿魏酸；燕麦粉提取物，诸如燕麦蒽酰胺(avenanthramide)1和2；硫醚、二硫醚、亚砜、四烷基秋兰姆二硫化物；植酸、甾体衍生物(例如u74006f)；色氨酸代谢产物(例如，3-羟基犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸)以及有机硫族化物。
[0102]“增稠剂”用于增加药物制剂的粘度并且可选自药学上可接受的亲水性聚合物，诸如部分醚化的纤维素衍生物，包括羧甲基乙基-、羟乙基-、羟丙基-、羟丙基甲基-或甲基纤维素；完全合成的亲水性聚合物，包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(羟乙基)-、聚(羟丙基)-、聚(羟丙基甲基)甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈、甲基烯丙基-磺酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇-丙交酯、聚乙二醇-二丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙基甲基丙烯酰胺)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)、泊洛沙姆、聚天冬酰胺、(肼交联的)透明质酸、硅酮；天然树胶，包括藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔胶、明胶、西黄蓍胶、(酰胺化)果胶、黄原胶、壳聚糖胶原、琼脂糖；其混合物和其他衍生物或共聚物和/或其他药学或至少生物学可接受的聚合物。
[0103]
本发明的制剂还可包含极性液体介质本发明的制剂可在水性介质中施用。本发明的制剂可呈溶液、悬浮液、乳液、乳膏、洗剂、软膏、凝胶、喷雾、成膜溶液或漆形式。
[0104]
虽然不限于任何作用机制或任何理论，但是本发明的制剂可形成以适应性、可变形形或穿透性为特征的囊泡或esa。类似囊泡(不具有键合的治疗性实体)描述于wo 2010/140061与wo 2011/022707中。
[0105]
如上文所提及，视aoi而定，本发明的制剂适用于预防或治疗各种疾病或病症。
[0106]
举例来说，本发明的囊泡制剂可包含维生素d3、c、e或b7中的一种、两种或三种。制剂可单独使用或作为诸如防晒剂、阳光阻断剂、保湿剂、精华液或化妆品等更复杂皮肤护理产品的组分或成分。制剂或最终皮肤护理产品可呈乳膏、凝胶、洗剂、摩丝或喷雾形式。
[0107]
本发明提供一种如上所定义进行使用的囊泡制剂，其中微量营养素是维生素d3，囊泡制剂可并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品，以补充低维生素d水平；其中微量营养素是维生素c或维生素e，囊泡制剂可并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品，以补充表皮和真皮维生素c或维生素e并且协助预防或修复晒伤或老化的皮肤；其中微量营养素是维生素b7，囊泡制剂可并入防晒产品、阳光阻断产品、晒后产品或其他护肤或化妆产品，以减轻或消除与缺乏这种微量营养素相关的皮肤病。
[0108]
本发明的囊泡制剂可提供于有待局部施加的伤口愈合产品中。因此，本发明提供用于治疗皮肤伤口的第一方面的制剂，其中aoi是抗坏血酸(维生素c)。
[0109]
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
[0110]
实施方案1.一种囊泡制剂，其包含脂质、表面活性剂以及目标药剂(aoi)，其中所述aoi键合至所述囊泡的组分，使得每个aoi分子的一部分在所述囊泡外侧并且在囊泡膜的外部。
[0111]
实施方案2.根据实施方案1所述的制剂，其中所述aoi键合至所述囊泡的表面活性
剂组分。
[0112]
实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的制剂，其中所述aoi键合至所述囊泡的脂质组分。
[0113]
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的制剂，其中囊泡的表面活性剂组分与脂质组分两者均具有与其键合的aoi。
[0114]
实施方案5.根据实施方案1至3中任一项所述的制剂，其中单一aoi键合至囊泡组分。
[0115]
实施方案6.根据实施方案1至4中任一项所述的制剂，其中多种aoi键合至囊泡组分。
[0116]
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的制剂，其中所述键是共价键。
[0117]
实施方案8.根据实施方案6所述的制剂，其中所述aoi是同质的。
[0118]
实施方案9.根据实施方案6所述的制剂，其中所述aoi是异质的。
[0119]
实施方案10.根据实施方案1至8中任一项所述的制剂，其中所述aoi选自由元素、离子、无机盐、小分子、氨基酸、肽、蛋白质、微量营养素、大分子或大环分子组成的组。
[0120]
实施方案11.根据实施方案1至8中任一项所述的制剂，其中所述aoi选自由皮肤结构蛋白(诸如弹性蛋白或胶原蛋白)、治疗性蛋白质、碳水化合物、含发色团的大分子(诸如卟啉)、维生素、金属或金属盐、非金属元素或非金属盐、黑色素或黑色素类似物或抗炎药(诸如nsaid)组成的组。
[0121]
实施方案12.根据实施方案1至10中任一项所述的制剂，其用于通过患者的皮肤递送所述aoi。
[0122]
实施方案13.根据实施方案12所述的供使用的制剂，其中所述制剂是局部施加。
[0123]
实施方案14.一种通过患者的皮肤递送aoi的方法，所述方法包括以足以穿透所述皮肤以递送所述aoi的量向所述患者的所述皮肤局部施加根据实施方案1至11中任一项所述的囊泡制剂。
[0124]
实施方案15.如实施方案14中所要求的递送aoi的方法，其中所述囊泡制剂是根据实施方案8至11或根据实施方案1至6或10或11所述的含有各自具有不同aoi的囊泡的掺混物的制剂。
[0125]
实施方案16.一种制备根据实施方案1至11中任一项所述的制剂的方法，所述方法包括使aoi附着于囊泡组分，使得所述aoi的一部分在所述囊泡的外侧并且在所述囊泡膜的外部。
[0126]
实施方案17.根据实施方案1至13中任一项所述的囊泡制剂，其用于治疗疾病。
[0127]
实施方案18.根据实施方案1至13中任一项所述的囊泡制剂，其用于皮肤护理或化妆品中。
[0128]
下文参考以下非限制性实施例和图式来描述本发明，其中：
[0129]
图1示出了针对拴系至萘普生或双氯芬酸的囊泡的反应速度绘制的花生四烯酸底物浓度曲线图；
[0130]
图2示出了图1的倒数(莱恩威佛-伯克，lineweaver burk)曲线图；
[0131]
图3示出了在cma分析后针对拴系至萘普生或双氯芬酸的囊泡的反应速度绘制的花生四烯酸底物浓度曲线图；并且
[0132]
图4示出了图3的倒数(莱恩威佛-伯克)曲线图。
[0133]
示例性制剂
[0134]
示例性囊泡制剂
[0135]
示例性制剂1
[0136]
制剂1包含作为脂质的鞘磷脂(脑)(47.944mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(42.05mg/g)、乳酸盐缓冲液(ph 4)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(.0500mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(30.000mg/g)。
[0137]
示例性制剂2
[0138]
制剂2包含作为脂质的鞘磷脂(脑)(53.750mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(31.250mg/g)、乳酸盐(ph 4)缓冲液、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(15.000mg/g)。
[0139]
示例性制剂3
[0140]
制剂3包含作为脂质的鞘磷脂(脑)(90.561mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(79.439mg/g)、乳酸盐(ph 4)缓冲液、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(30.000mg/g)。
[0141]
示例性制剂4
[0142]
制剂4包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(8.500mg/g)、磷酸盐(ph 7.5)缓冲液、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(1.000mg/g)以及乙醇(36.51mg/g)。
[0143]
示例性制剂5
[0144]
制剂5包含作为脂质的磷脂酰胆碱(71.460mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(4.720mg/g)、磷酸盐(ph 7.8)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、甘油(15.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(35.000mg/g)。
[0145]
示例性制剂6
[0146]
制剂6包含作为脂质的磷脂酰胆碱(71.460mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(4.720mg/g)、磷酸盐(ph 7.8)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、甘油(50.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(15.000mg/g)。
[0147]
示例性制剂7
[0148]
制剂8包含作为脂质的磷脂酰胆碱(71.4600mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(4.720mg/g)、磷酸盐(ph 7.5)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、甘油(50.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(35.000mg/g)。
[0149]
示例性制剂8
[0150]
制剂8包含作为脂质的磷脂酰胆碱(64.516mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(35.484mg/g)、磷酸盐(ph 6.7)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)、作为抗微生物剂
的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(4.200mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(30.000mg/g)。
[0151]
示例性制剂9
[0152]
作为脂质的磷脂酰胆碱(64.516mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(35.484mg/g)、磷酸盐(ph 6.7)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)、作为溶剂的苯甲醇(5.250mg/g)或对羟基苯甲酸酯(4.200mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(30.000mg/g)。
[0153]
示例性制剂10
[0154]
作为脂质的磷脂酰胆碱(71.460mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(4.720mg/g)、磷酸盐(ph 6.7)缓冲液、作为抗氧化剂的bha(0.200mg/g)、作为溶剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(10.000mg/g)、甘油(50.000mg/g)、作为螯合剂的edta(3.000mg/g)以及乙醇(30.000mg/g)。
[0155]
具有附着的aoi的示例性囊泡制剂
[0156]
示例性制剂11
[0157]
制剂9包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(8.500mg/g)、作为aoi的胶原蛋白基(collagenyl)磷脂酰胆碱(1mg/g)、磷酸盐(ph 7.5)缓冲液、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(1.000mg/g)以及乙醇(36.51mg/g)。
[0158]
示例性制剂12
[0159]
制剂10包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(8.500mg/g)、作为aoi的胶原蛋白基磷脂酰胆碱(0.5mg/g)、磷酸盐(ph 7.5)缓冲液、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(1.000mg/g)以及乙醇(36.51mg/g)。
[0160]
示例性制剂13
[0161]
制剂11包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(8.500mg/g)、胶原蛋白基吐温(0.5mg/g)、磷酸盐(ph 7.5)缓冲液、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为抗微生物剂的苯甲醇或对羟基苯甲酸酯(5.000mg/g)、甘油(30.000mg/g)、作为螯合剂的edta(1.000mg/g)以及乙醇(36.51mg/g)。
[0162]
实施例14以及其制造和测试
[0163]
制剂14包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(6.800mg/g)、作为aoi的棕榈酸抗坏血酸酯(0.530mg/g)、柠檬酸磷酸盐(ph 5.4)缓冲液、作为抗氧化剂的bht(0.200mg/g)和焦亚硫酸钠(0.500mg/g)、作为螯合剂的edta(1.000mg/g)以及乙醇(48.87mg/g)。
[0164]
概述
[0165]
已在20％聚山梨醇酯80摩尔取代下成功制造含有共价键合的抗坏血酸的传递体制剂。测试结果表明，传递体的尺寸分布、可变形性特征以及电荷未因包括抗坏血酸而受影响，棕榈酸l-抗坏血酸酯在传递体的外表面上是羧酸酯酶可接近的，在fe
3
还原分析中棕榈
酸抗坏血酸酯传递体具活性，并且它们在发生变形以穿过小于其平均尺寸的孔隙之后保留其还原活性。
[0166]
制造
[0167]
使用大豆磷脂酰胆碱(类脂spc s-100)和聚山梨醇酯80制备传递体，其含有棕榈酸l-抗坏血酸酯(sigma 7618)。还制备了对照批次的传递体。添加丁基羟基甲苯、edta以及焦亚硫酸钠至传递体中，以使棕榈酸l-抗坏血酸酯的氧化降至最低程度。
[0168]
棕榈酸l-抗坏血酸酯传递体的制备
[0169]
以13.3:0.8:0.2的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80:棕榈酸l-抗坏血酸酯摩尔比制备一批50g的棕榈酸l-抗坏血酸酯传递体
[0170]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(3.44g)、聚山梨醇酯80(0.34g)、丁基羟基甲苯(0.01g)以及棕榈酸l-抗坏血酸酯(0.0265g)溶解于乙醇中，得到6.26g的总重量。
[0171]
在存在0.1％edta和0.05％焦亚硫酸钠的情况下，将25mm柠檬酸磷酸盐缓冲液(ph5.4)(43.74g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0172]
在35℃下在4巴压力的氮气存在下，使用sartorius 47mm过滤系统经0.2μm过滤器，随后0.1μm过滤器，并且再一个0.1μm过滤器挤出来制备传递体。各过滤器在顶部具有玻璃纤维预过滤器。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0173]
对照传递体的制备
[0174]
以13.3:1的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80摩尔比制备一批50g的对照传递体。
[0175]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(3.44g)、聚山梨醇酯80(0.425g)、丁基羟基甲苯(0.01g)溶解于乙醇中，得到6.26g的总重量。
[0176]
在存在0.1％edta和0.05％焦亚硫酸钠的情况下，将25mm柠檬酸磷酸盐缓冲液(ph5.4)(43.74g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0177]
如针对棕榈酸l-抗坏血酸酯传递体批次pd-14-0035所描述挤出对照传递体。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0178]
分析方法
[0179]
粒度测量
[0180]
使用光子相关光谱仪通过动态光散射测定传递体制剂的平均粒度和粒度分布。当相干光穿过粒子的悬浮液时，光沿所有方向散射。通过测量结果和粒子悬浮液的散射光强度的相关性，有可能确定悬浮液中的粒子的尺寸和尺寸分布。
[0181]
使用alv-5000/e光子相关谱仪测定各样品的平均粒度和粒度分布。将样品在去离子水中稀释，得到50-500khz范围内的可检测信号，并且然后经六次测量进行分析，每次30秒持续时间。将温度控制在25℃下。对数据进行正规化拟合累积二阶分析，得到样品的平均粒度(报道为r或平均半径)以及粒度分析(报道为w或宽度)。平均半径乘以2，得到平均直径(nm)。
[0182]
各样品的多分散性指数(pdi)根据以下等式计算：
[0183]
[0184]
其中：w＝宽度并且r＝平均半径。
[0185]
连续膜适应性分析
[0186]
连续膜适应性(cma)分析使用施加的压力，以为传递体提供活化能，从而使其能够变形并且穿过小于传递体平均尺寸的过滤器孔隙。
[0187]
将anodisc 13膜过滤器(孔径20nm)安装在过滤装置底部的过滤支持件上，并且附接上部不锈钢桶。将在25℃下预平衡的3ml传递体样品放置于桶中，并且将连接至热循环装置(25℃)的传热管缠绕在其周围。将桶与连接至氮气瓶的压力管连接。使用一系列阀门，以9.5巴压力设定点准备好系统，得到7.5巴起始压力。将过滤装置放置于位于精密称重天秤上的收集容器上方，该精密称重天平连接至excel计算机程序。使用bronkhurst压力控制器来控制并监测压力，并且当系统阀门打开并且计时开始时，针对逐渐降低的压力和逐渐增加的时间记录天平上收集到的逐渐增加的传递体滤液质量。
[0188]
在mathcad程序中评估时间、压力、质量数据，以确定p*值。p*是穿透孔隙所需的激活压力的量度并且因此是传递体膜刚度和可变形性的量度。传递体的平均粒度是在cma过滤之前和之后通过光子相关光谱法进行测定。
[0189]
抗坏血酸分析
[0190]
棕榈酸抗坏血酸酯和抗坏血酸浓度是使用抗坏血酸分析试剂盒(abcam ab65656)进行测量。在此分析中，在诸如抗坏血酸等抗氧化剂存在下，fe
3
被还原为fe
2
。fe
2
与比色探针螯合，产生在593nm下具有吸光度的产物。
[0191]
为确定总棕榈酸抗坏血酸酯浓度，将传递体通过用乙醇和5％triton x-100进行1:7:2v/v稀释加以溶解。棕榈酸抗坏血酸酯标准曲线是如下制备：起始在乙醇中稀释至浓度范围0.0125至0.25mm，然后在水和5％triton x-100中进一步7:1:2v/v稀释至0.01至0.175mm的最终浓度范围。包括0mm棕榈酸抗坏血酸酯空白。将标准品和样品加载至微量滴定板上，并且与含有试剂盒缓冲液、fe
3
以及比色探针的反应混合物1:1v/v混合。在室温下孵育1分钟后，在593nm下读取板。从所有标准品和样品中扣除0mm棕榈酸抗坏血酸酯空白，并且从棕榈酸抗坏血酸酯传递体的吸光度中扣除对照
‘
空’传递体的吸光度。将最终吸光度与棕榈酸抗坏血酸酯标准曲线相比较，以获得总棕榈酸抗坏血酸酯(抗坏血酸)浓度(mm)。
[0192]
为确定外部抗坏血酸浓度，通过将抗坏血酸在水中稀释至0.025至0.2mm的浓度范围来制备抗坏血酸标准曲线。将标准品和传递体样品加载至微量滴定板上，并且与含有试剂盒缓冲液、fe
3
以及比色探针的反应混合物1:1v/v混合。在室温下孵育1分钟后，在593nm下读取板。从所有标准品和样品中扣除板空白，并且从棕榈酸抗坏血酸酯传递体的吸光度中扣除对照
‘
空’传递体的吸光度。将最终吸光度与抗坏血酸标准曲线相比较，以获得抗坏血酸浓度。将该浓度与总棕榈酸抗坏血酸酯(抗坏血酸)浓度相比较来计算拴系于棕榈酸抗坏血酸酯传递体外表面的抗坏血酸百分比。
[0193]
羧酸酯酶消化和rp-hplc
[0194]
抗坏血酸从含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体的释放是使用羧酸酯酶1同种型b(sigma e0287)通过对酯进行酶促消化来进行。每毫升传递体添加960单位的酶，然后在 37℃下孵育。在2小时和4小时时取出样品，并且通过添加1体积的乙腈/甲醇/甲酸(80v/20v/0.2v)，随后超声处理5分钟，并且离心以沉淀不溶组分来萃取所释放的抗坏血酸。然后将上清液样品经0.2μm膜过滤，随后用超高纯度水进行1:10稀释。
[0195]
通过使用luna c18(2)100a5μm 4.6x250mm柱和waters 2695分离模块在 25℃下进行的反相高压液相色谱(rp-hplc)法和按照下表进行的梯度法(其中洗脱液a是20mm磷酸钾(ph3.0)而洗脱液b是乙腈)来分析样品。使用waters 2487检测器在260nm波长下进行检测。
[0196][0197]
另外，使用相同的rp-hplc法分析在0.4至100μg/ml范围内的抗坏血酸标准曲线。将样品和标准品的抗坏血酸峰整合于所得色谱图中。用线性回归分析标准品的峰面积，以产生标准曲线方程。然后，将由萃取法产生的稀释作用考虑在内，使用样品的峰面积由标准曲线方程确定抗坏血酸浓度。将该浓度与总抗坏血酸浓度相比较来计算从棕榈酸抗坏血酸酯传递体的外表面释放的抗坏血酸百分比。
[0198]
纸电泳
[0199]
使用纸电泳来研究传递体制剂的电荷特征，其中纸带悬在两个填充缓冲液的储集器之间，将测试样品施加于条带并且在条带两端施加电流。带电荷的粒子在条带上迁移，并且方向和行进距离由粒子在缓冲液ph值下的净电荷决定。
[0200]
将一定体积(100μl)的各测试样品施加于单个2x 20cm whatman过滤条带(在运行缓冲液中预润湿；2.3mg/ml氯化钠、1.5mg/ml氯化钙、1.3mg/ml甘氨酰甘氨酸、25mg/ml甘露糖醇、10mg/ml蔗糖以及0.5mg/ml甲硫氨酸，ph5.75)的中心并且在130v下运行2小时。用5％w/v氯化钡和0.05m碘将每个条带针对peg(聚山梨醇酯80的组分)进行染色，并且然后干燥。测量在条带的阳极与阴极侧传递体行进离开各样品的中心点的程度，以确定囊泡净电荷。
[0201]
结果与讨论
[0202]
结果汇总于表4中。对棕榈酸抗坏血酸酯传递体的样品进行0.2μm无菌过滤，并且在过滤后再次测试，以再次检查样品完整性以供参考。
[0203]
表4对照和棕榈酸抗坏血酸酯传递体分析
[0204][0205]
粒度测量
[0206]
对照传递体和那些含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体的平均粒径和多分散性指数相似。这表明，在传递体中聚山梨醇酯80 20％用酯取代未影响尺寸特征。在0.2μm无菌过滤后，尺寸无显著变化。
[0207]
连续膜适应性分析
[0208]
含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体与对照传递体的可变形性p*值几乎是相同的，这表明聚山梨醇酯80 20％用酯取代未显著影响传递体的可变形性。对照传递体的过滤回收率％略微更高，这可能表明包括棕榈酸抗坏血酸酯对囊泡膜具有非常轻微的加强作用。
[0209]
与过滤前相比较，在cma过滤后对照传递体与含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体的平均粒径降低近50％。多分散性指数略微更高，指示尺寸分布更宽。这些特征均如关于传递体囊泡所预期。
[0210]
抗坏血酸分析
[0211]
棕榈酸抗坏血酸酯传递体中的总棕榈酸抗坏血酸酯浓度经测定为0.61mm。这等同于253μg/ml棕榈酸抗坏血酸酯或107μg/ml抗坏血酸。该浓度是制造过程开始时的约50％，这表明已可能通过过滤与抗坏血酸氧化的组合而产生损失。然而，结果表明，在最终传递体制剂中存在能够还原fe
3
的活性抗坏血酸。
[0212]
棕榈酸抗坏血酸酯传递体的外表面上已反应的抗坏血酸的浓度经测定为0.13mm。这等同于总抗坏血酸浓度的23μg/ml或21％是外部拴系的。
[0213]
在0.2μm无菌过滤后，总抗坏血酸浓度或外部抗坏血酸浓度无显著变化。
[0214]
已进行连续膜适应性(cma)分析的传递体的总棕榈酸抗坏血酸酯浓度比cma前略高。外部抗坏血酸浓度在cma前/后几乎是相同的。这表明，已变形以穿过小于传递体平均直径的孔径的传递体未损失任何其还原活性。
[0215]
羧酸酯酶消化和rp-hplc
[0216]
将含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体与羧酸酯酶1酶一起孵育使得在37℃下孵育2小时后释放总抗坏血酸中的15％(16μg/ml)，而在37℃下4小时后则为36％(38μg/ml)。因此，拴系至传递体外表面的抗坏血酸是酶可接近的。所获得的外部抗坏血酸的浓度类似于在抗坏血酸分析中所获得。
[0217]
将已进行cma可变形性过滤分析的传递体也与羧酸酯酶1酶一起孵育，使得在37℃下孵育2小时后释放总抗坏血酸的9％(13μg/ml)，而在37℃下4小时后则为19％(26μg/ml)。不清楚为什么在cma后释放百分比更低，但有可能囊泡尺寸的变化降低了酶对棕榈酸抗坏血酸酯的可接近性。
[0218]
纸电泳
[0219]
对照传递体与含有棕榈酸抗坏血酸酯的传递体均朝向电泳设备的阴极迁移，这证实净正电荷。因此，棕榈酸抗坏血酸酯的存在未改变传递体的电荷特征。
[0220]
示例性制剂15以及其制造和测试
[0221]
制剂15包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(7.66mg/g)、作为aoi的棕榈酰基三肽1(0.370mg/g)、磷酸盐(ph 7.7)缓冲液以及乙醇(48.10mg/g)，或者作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(7.66mg/g)、作为aoi的棕榈酰基四肽7(0.450mg/g)、磷酸盐(ph 7.7)缓冲液以及乙醇(48.40mg/g)。
[0222]
概述
[0223]
已在10％聚山梨醇酯80摩尔取代下成功制造含有共价键合的肽(四肽-7和三肽-1)的传递体制剂。测试结果表明，传递体的尺寸分布、可变形特征以及电荷不因包括肽而受影响。
[0224]
制造
[0225]
使用大豆磷脂酰胆碱(类脂spc s-100)和聚山梨醇酯80制备传递体，其含有棕榈酰基四肽-7(pal-gqpr)或棕榈酰基三肽-1(pal-ghk)(sinoway industrial co.ltd)。还制备了对照批次的传递体。
[0226]
棕榈酰基肽传递体的制备
[0227]
以13.3:0.9:0.1的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80:棕榈酰基肽摩尔比制备一批50g的棕榈酰基四肽-7传递体和一批50g的棕榈酰基三肽-1
[0228]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(3.44g)、聚山梨醇酯80(0.383g)以及棕榈酰基四肽-7(0.0224g)或棕榈酰基三肽-1(0.0186g)溶解于乙醇中，得到6.26g的总重量。
[0229]
将磷酸盐缓冲液(ph7.7)(43.74g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注
射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0230]
在35℃下在4巴压力的氮气存在下，使用sartorius 47mm过滤系统经0.2μm过滤器，随后0.1μm过滤器，并且再一个0.1μm过滤器挤出来制备传递体。各过滤器在顶部具有玻璃纤维预过滤器。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0231]
对照传递体的制备
[0232]
以13.3:1的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80摩尔比制备一批50g的对照传递体。
[0233]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(3.44g)、聚山梨醇酯80(0.425g)溶解于乙醇中，得到6.26g的总重量。
[0234]
将磷酸盐缓冲液(ph7.7)(43.74g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0235]
如针对棕榈酰基肽传递体批次所描述挤出对照传递体。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0236]
分析方法
[0237]
粒度测量
[0238]
使用光子相关光谱仪通过动态光散射测定传递体制剂的平均粒度和粒度分布。当相干光穿过粒子的悬浮液时，光沿所有方向散射。通过测量结果和粒子悬浮液的散射光强度的相关性，有可能确定悬浮液中的粒子的尺寸和尺寸分布。
[0239]
使用alv-5000/e光子相关谱仪测定各样品的平均粒度和粒度分布。将样品在去离子水中稀释，得到50-500khz范围内的可检测信号，并且然后经六次测量进行分析，每次30秒持续时间。将温度控制在25℃下。对数据进行正规化拟合累积二阶分析，得到样品的平均粒度(报道为r或平均半径)以及粒度分析(报道为w或宽度)。平均半径乘以2，得到平均直径(nm)。
[0240]
各样品的多分散性指数(pdi)根据以下等式计算：
[0241][0242]
其中：w＝宽度并且r＝平均半径。
[0243]
连续膜适应性分析
[0244]
连续膜适应性(cma)分析使用施加的压力，以为传递体提供活化能，从而使其能够变形并且穿过小于传递体平均尺寸的过滤器孔隙。
[0245]
将anodisc 13膜过滤器(孔径20nm)安装在过滤装置底部的过滤支持件上，并且附接上部不锈钢桶。将在25℃下预平衡的3ml传递体样品放置于桶中，并且将连接至热循环装置(25℃)的传热管缠绕在其周围。将桶与连接至氮气瓶的压力管连接。使用一系列阀门，以9.5巴压力设定点准备好系统，得到7.5巴起始压力。将过滤装置放置于位于精密称重天秤上的收集容器上方，该精密称重天平连接至excel计算机程序。使用bronkhurst压力控制器来控制并监测压力，并且当系统阀门打开并且计时开始时，针对逐渐降低的压力和逐渐增加的时间记录天平上收集到的逐渐增加的传递体滤液质量。
[0246]
在mathcad程序中评估时间、压力、质量数据，以确定p*值。p*是穿透孔隙所需的激活压力的量度并且因此是传递体膜刚度的量度。传递体的平均粒度是在cma过滤之前和之后通过光子相关光谱法进行测定。
[0247]
肽浓度(cbqca)分析
[0248]
具有氨基酸序列甘氨酸-组氨酸-赖氨酸的肽部分的棕榈酰基三肽-1的浓度是通过用试剂3-(4-羧基苯甲酰基)喹诺酮-2-甲醛(cbqca)衍生赖氨酸氨基酸的伯胺基团以产生荧光产物来进行测量。
[0249]
将棕榈酰基三肽-1传递体和对照传递体的样品在0.1mm硼酸钠缓冲液(ph 9.3)中进行1:400至1:3200的一系列稀释。因为不可能在适合于此分析的水性条件下溶解棕榈酰基三肽1；所以传递体中的三肽1的浓度的确定是比照牛血清白蛋白(bsa)标准曲线来进行。制备已知浓度的bsa，得到6.7μg/ml至0.33mg/ml的一系列。在氰化钾存在下，用cbqca试剂在室温下以微板形式进行标准品和样品的伯胺的衍生，持续1小时。通过在激发波长485nm和荧光发射波长520nm下用bmg fluostar optima荧光计读取来进行测量。
[0250]
从所有数据中扣除0.1mm硼酸钠缓冲液(ph 9.3)的空白样品的荧光读数。将由bsa标准品所得的荧光测量结果用线性回归进行分析，以产生标准曲线方程。然后，在扣除等效稀释下对照传递体的荧光后，确定相对于bsa曲线在棕榈酰基三肽-1传递体中的肽的量。
[0251]
纸电泳
[0252]
使用纸电泳来研究传递体制剂的电荷特征，其中纸带悬在两个填充缓冲液的储集器之间，将测试样品施加于条带并且在条带两端施加电流。带电荷的粒子在条带上迁移，并且方向和行进距离由粒子在缓冲液ph值下的净电荷决定。
[0253]
将一定体积(100μl)的各测试样品施加于单个2x 20cm whatman过滤条带(在运行缓冲液中预润湿；2.3mg/ml氯化钠、1.5mg/ml氯化钙、1.3mg/ml甘氨酰甘氨酸、25mg/ml甘露糖醇、10mg/ml蔗糖以及0.5mg/ml甲硫氨酸，ph5.75)的中心并且在130v下运行2小时。用5％w/v氯化钡和0.05m碘将每个条带针对peg(聚山梨醇酯80的组分)进行染色，并且然后干燥。测量在条带的阳极与阴极侧传递体行进离开各样品的中心点的程度，以确定囊泡净电荷。
[0254]
结果与讨论
[0255]
结果汇总于表5中。
[0256]
表5棕榈酰基肽传递体分析
[0257][0258]
粒度测量
[0259]
对照传递体和那些含有棕榈酰基肽的传递体的平均粒径和多分散性指数相似。这表明，在传递体中聚山梨醇酯80 10％用棕榈酰基肽取代未影响尺寸特征。
[0260]
连续膜适应性分析
[0261]
对照传递体和那些含有棕榈酰基肽的传递体的可变形性p*值相似。棕榈酰基四肽7传递体的值略微更低，这表明聚山梨醇酯80 10％用酯取代可能对膜具有轻微的软化作用，从而使囊泡更易变形。然而，在过滤回收率％中这并未得到证明，与对照相比，棕榈酰基肽传递体的过滤回收率％类似，因此，更低的p*是可能不显著的。
[0262]
与过滤前相比较，在cma过滤后对照传递体与含有棕榈酰基肽的传递体的平均粒径降低近50％。多分散性指数略微更高，指示尺寸分布更宽。这些特征均如关于传递体囊泡所预期。
[0263]
肽浓度(cbqca)分析
[0264]
在cbqca分析中，棕榈酰基四肽7传递体归因于序列中缺乏与试剂反应的赖氨酸残基而未产生结果。然而，棕榈酰基三肽1是可检测的，因为它含有赖氨酸。因为不可能在适合于分析的水性条件下溶解棕榈酰基三肽1；所以已比照牛血清白蛋白(bsa)标准曲线进行了对传递体中三肽1的浓度的确定。bsa是一种具有58个赖氨酸残基的66kda蛋白质；每1138da肽约1个。肽在340da中含有1个赖氨酸。检测肽并且试图通过校正在bsa与肽之间赖氨酸浓度的差异对量进行量化，然而总肽似乎仍然被过高估计；与理论的221μg/ml相比是424μg/ml。
[0265]
纸电泳
[0266]
对照传递体和含有棕榈酰基肽的传递体全部朝向电泳设备的阴极迁移，这证实净正电荷。因此，棕榈酰基肽7或棕榈酰基三肽-1的存在未改变传递体的电荷特征。
[0267]
示例性制剂16以及其制造和测试
[0268]
制剂16包含作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80
(6.55mg/g)、作为aoi的萘普生-聚山梨醇酯(2.195mg/g)、磷酸盐(ph 7.7)缓冲液以及乙醇(47.56mg/g)，或者作为脂质的磷脂酰胆碱(68.700mg/g)、作为表面活性剂的吐温80(5.80mg/g)、作为aoi的双氯芬酸-聚山梨醇酯(2.96mg/g)、磷酸盐(ph 7.7)缓冲液以及乙醇(47.54mg/g)。
[0269]
概述
[0270]
已在20％聚山梨醇酯80摩尔取代下成功制造含有共价键合的非甾体抗炎药(nsaid)(萘普生和双氯芬酸)的传递体制剂。测试结果表明，传递体的尺寸分布、可变形特征以及电荷未因包括nsaid而受影响，nsaid酯在传递体的外表面是羧酸酯酶可接近的，并且在cox-1酶抑制分析中，nsaid传递体具有比单独对照传递体更大的抑制作用。nsaid传递体在发生变形以穿过小于其平均尺寸的孔隙后保留其抑制活性。
[0271]
制造
[0272]
使用大豆磷脂酰胆碱(类脂spc s-100)和聚山梨醇酯80制备传递体，其含有萘普生-聚山梨醇酯80(key organics dk-0035-3)或双氯芬酸-聚山梨醇酯80(key organics dk-0036-3)。还制备了对照批次的传递体。
[0273]
nsaid传递体的制备
[0274]
以13.3:0.8:0.2的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80:nsaid-聚山梨醇酯80摩尔比(解释nsaid-聚山梨醇酯80的纯度)制备一批20g的萘普生-聚山梨醇酯传递体和一批20g的双氯芬酸-聚山梨醇酯传递体。
[0275]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(1.374g)与聚山梨醇酯80(0.131g)和萘普生-聚山梨醇酯(0.0439g)或聚山梨醇酯80(0.116g)和双氯芬酸-聚山梨醇酯(0.0592g)溶解于乙醇中，得到2.50g的总重量。
[0276]
将磷酸盐缓冲液(ph7.7)(17.50g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0277]
在35℃下在4巴压力的氮气存在下，使用sartorius 47mm过滤系统经0.2μm过滤器，随后0.1μm过滤器，并且再一个0.1μm过滤器挤出来制备传递体。每个过滤器在顶部具有玻璃纤维预过滤器。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0278]
对照传递体的制备
[0279]
以13.3:1的大豆磷脂酰胆碱:聚山梨醇酯80摩尔比制备一批50g的对照传递体。
[0280]
使用温和加热并且搅拌，将大豆磷脂酰胆碱(3.44g)、聚山梨醇酯80(0.425g)溶解于乙醇中，得到6.26g的总重量。
[0281]
将磷酸盐缓冲液(ph7.7)(43.74g)在35℃下剧烈搅拌，同时由装有大号针头的注射器添加大豆磷脂酰胆碱制剂。将混合物搅拌约15分钟。
[0282]
如对于nsaid传递体批次所描述挤出对照传递体。将传递体在 5℃下储存于黑暗中。
[0283]
分析方法
[0284]
粒度测量
[0285]
使用光子相关光谱仪通过动态光散射测定传递体制剂的平均粒度和粒度分布。当相干光穿过粒子的悬浮液时，光沿所有方向散射。通过测量结果和粒子悬浮液的散射光强度的相关性，有可能确定悬浮液中的粒子的尺寸和尺寸分布。
[0286]
使用alv-5000/e光子相关谱仪测定各样品的平均粒度和粒度分布。将样品在去离子水中稀释，得到50-500khz范围内的可检测信号，并且然后经六次测量进行分析，每次30秒持续时间。将温度控制在25℃下。对数据进行正规化拟合累积二阶分析，得到样品的平均粒度(报道为r或平均半径)以及粒度分析(报道为w或宽度)。平均半径乘以2，得到平均直径(nm)。
[0287]
每个样品的多分散性指数(pdi)根据以下等式计算：
[0288][0289]
其中：w＝宽度并且r＝平均半径。
[0290]
连续膜适应性分析
[0291]
连续膜适应性(cma)分析使用施加的压力，以为传递体提供活化能，从而使其能够变形并且穿过小于传递体平均尺寸的过滤器孔隙。
[0292]
将anodisc 13膜过滤器(孔径20nm)安装在过滤装置底部的过滤支持件上，并且附接上部不锈钢桶。将在25℃下预平衡的3ml传递体样品放置于桶中，并且将连接至热循环装置(25℃)的传热管缠绕在其周围。将桶与连接至氮气瓶的压力管连接。使用一系列阀门，以9.5巴压力设定点准备好系统，得到7.5巴起始压力。将过滤装置放置于位于精密称重天秤上的收集容器上方，该精密称重天平连接至excel计算机程序。使用bronkhurst压力控制器来控制并监测压力，并且当系统阀门打开并且计时开始时，针对逐渐降低的压力和逐渐增加的时间记录天平上收集到的逐渐增加的传递体滤液质量。
[0293]
在mathcad程序中评估时间、压力、质量数据，以确定p*值。p*是穿透孔隙所需的激活压力的量度并且因此是传递体膜刚度和可变形性的量度。传递体的平均粒度是在cma过滤之前和之后通过光子相关光谱法进行测定。
[0294]
羧酸酯酶消化和rp-hplc
[0295]
拴系的非甾体抗炎药(nsaid)(双氯芬酸或萘普生)从含有两种化合物中任一种的聚山梨醇酯80的传递体的外表面释放是通过使用羧酸酯酶1同种型b(sigma e0287)对酯进行酶促消化来进行。每毫升传递体添加960单位的酶，然后在 37℃下孵育。在4小时时取出样品，并且通过添加1体积的乙腈/甲醇/甲酸(80v/20v/0.2v)，随后超声处理5分钟，并且离心以沉淀不溶组分来萃取所释放的nsaid。然后将上清液样品经0.2μm膜过滤，随后用超高纯度水进行1:10稀释。
[0296]
通过使用kinetex c18 5μm 100a 4.6x150mm柱和waters 2695分离模块在 25℃下进行的反相高压液相色谱(rp-hplc)法和按照下表进行的梯度法(其中洗脱液a是含0.1％三氟乙酸的超高纯度水而洗脱液b是含0.1％三氟乙酸的乙腈)来分析样品。两种nsaid的检测均使用waters 2487检测器在254nm波长下进行。
[0297]
[0298]
另外，使用相同的rp-hplc法分析在0.4至91μg/ml范围内的每个nsaid的标准曲线。将样品和标准品的nsaid峰整合于所得色谱图中。用线性回归分析标准品的峰面积，以产生标准曲线方程。然后，将由萃取法产生的稀释作用考虑在内，使用样品的峰面积由各自的标准曲线方程确定所释放的nsaid浓度。将该浓度与理论的总nsaid浓度相比较来计算从nsaid传递体的外表面释放的nsaid百分比。
[0299]
环氧合酶1抑制分析
[0300]
环氧合酶-1(cox-1)抑制分析测量诸如nsaid等药物抑制cox-1酶的活性的能力。cox-1催化花生四烯酸到前列腺素h2的转换。在反应期间，酶消耗氧气。耗氧速度(nmol/ml/min)是反应速率的量度，并且在抑制剂存在下有所降低。
[0301]
已使用hansatech oxygraph系统设定cox抑制分析，该系统包括与oxygraph plus软件连接的经校准的clark氧电极。将含有0.1mm磷酸钾(ph7.2)、2.0mm苯酚、1μm血色素的反应混合物在37℃下在反应室中搅拌，直至达到稳定氧基线。添加340单位的cox-1酶(cayman chemicals cay60100)并且使其平衡1分钟，然后添加花生四烯酸底物。使用花生四烯酸在最终浓度8、16、32以及64μm下进行一系列对照反应。对于各反应，根据oxygraph氧曲线测量最大反应速率。
[0302]
为确定传递体样品的抑制作用，将对照、萘普生或双氯芬酸传递体与花生四烯酸在室温下预混合10分钟，然后添加花生四烯酸混合物至反应物中。选择浓度，使得反应物中的最终花生四烯酸浓度是8、16、32以及64μm。
[0303]
针对对照、对照传递体以及nsaid传递体反应的反应速度(nmol氧/ml/min)绘制花生四烯酸浓度曲线图，并且通过比较在四种底物浓度下的反应速度并且对速率降低值取平均值来计算由传递体产生的抑制百分比的值。还绘制了莱恩威佛-伯克倒数曲线图(1/花生四烯酸浓度针对1/反应速度)。
[0304]
还对已在连续膜适应性(cma)分析中被加工的传递体的样品进行cox-1抑制分析，该连续膜适应性分析使用施加的压力来提供活化能，以使泡囊能够变形并且穿过了小于其平均直径的孔隙。
[0305]
纸电泳
[0306]
使用纸电泳来研究传递体制剂的电荷特征，其中纸带悬在两个填充缓冲液的储集器之间，将测试样品施加于条带并且在条带两端施加电流。带电荷的粒子在条带上迁移，并且方向和行进距离由粒子在缓冲液ph值下的净电荷决定。
[0307]
将一定体积(100μl)的各测试样品施加于单个2x20cm whatman过滤条带(在运行缓冲液中预润湿；2.3mg/ml氯化钠、1.5mg/ml氯化钙、1.3mg/ml甘氨酰甘氨酸、25mg/ml甘露糖醇、10mg/ml蔗糖以及0.5mg/ml甲硫氨酸，ph5.75)的中心并且在130v下运行2小时。用5％w/v氯化钡和0.05m碘将每个条带针对peg(聚山梨醇酯80的组分)进行染色，并且然后干燥。测量在条带的阳极与阴极侧传递体行进离开各样品的中心点的程度，以确定囊泡净电荷。
[0308]
结果与讨论
[0309]
结果汇总于表6中。
[0310]
表6对照和nsaid传递体分析
[0311][0312]
粒度测量
[0313]
对照传递体和那些含有nsaid-聚山梨醇酯80的传递体的平均粒径和多分散性指数相似。这表明，在传递体中聚山梨醇酯80 20％用萘普生-聚山梨醇酯80或双氯芬酸-聚山梨醇酯取代未影响尺寸特征。
[0314]
连续膜适应性分析
[0315]
含有nsaid-聚山梨醇酯的传递体的可变形性p*值比对照传递体略微更低，这表明聚山梨醇酯80 20％用萘普生-聚山梨醇酯80或双氯芬酸-聚山梨醇酯取代对膜具有轻微软化作用，从而使囊泡更易变形。这也在过滤回收率％中得到证明，与对照相比，萘普生或双氯芬酸传递体的过滤回收率％有所增加。
[0316]
与过滤前相比较，在cma过滤后对照传递体与含有nsaid-聚山梨醇酯的传递体的平均粒径降低近50％。多分散性指数略微更高，指示尺寸分布更宽。这些特征均如关于传递体囊泡所预期。
[0317]
羧酸酯酶消化和rp-hplc
[0318]
将含有nsaid-聚山梨醇酯的传递体与羧酸酯酶1酶一起孵育使得总nsaid浓度的3至6％被释放，这表明，拴系至传递体外表面的萘普生或双氯芬酸中的一小部分是酶可接近的。
[0319]
环氧合酶1抑制分析
[0320]
比对照传递体相比，含有nsaid-聚山梨醇酯的传递体对环氧合酶-1(cox-1)的反应速度的抑制百分比更大。对照传递体预期抑制cox-1酶，而将已知cox-1抑制剂(萘普生或双氯芬酸)拴系至传递体的外表面进一步增加该抑制作用。
[0321]
图1和2分别示出了针对反应速度绘制的花生四烯酸底物浓度曲线图和倒数(莱恩威佛-伯克)曲线图。
[0322]
在连续膜适应性(cma)分析中，已变形以穿过小于传递体平均尺寸的孔隙的传递体保留抑制cox-1酶的能力。
[0323]
图3和4分别示出了cma后样品的针对反应速度绘制的花生四烯酸底物浓度曲线图和倒数(莱恩威佛-伯克)曲线图。
[0324]
在cma分析后，所有3种传递体制剂对cox-1酶的抑制百分比均略微更低。这假设是归因于因过滤而使得传递体和缔合的nsaid的浓度降低，而不是归因于nsaid活性的损失。由光子相关光谱法获得相当的传递体浓度的指示。与cma前样品相比，cma后样品的频率信号强度降低，但是对于对照和nsaid传递体来说，发现是相似的，尽管cma后的过滤回收率不同。
[0325]
纸电泳
[0326]
对照传递体和含有nsaid-聚山梨醇酯的传递体全部朝向电泳设备的阴极迁移，这证实净正电荷。因此，萘普生或双氯芬酸的存在未改变传递体的电荷特征。