一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞复合物的制备方法与流程

1.本发明属于妇产科学技术领域，涉及一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞(plga-hucmscs)复合物的制备方法。


背景技术：

2.子宫内膜严重损伤时内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫前后壁发生纤维化，瘢痕形成，临床上主要表现为宫腔粘连、闭经及子宫性不孕等。如何重建这些患者的内膜并使其恢复正常的形态及功能是当今再生医学的难题之一。在研究的过程中，学者们提出过多种不同的治疗方式，如宫内节育器使用，球囊导管，粘连分离术后雌激素或者透明质酸应用等，各种治疗方式各有其优缺点，纵观文献报道的结果，这些治疗效果存在争议并且令人失望。因此，针对子宫内膜损伤亟需新型治疗方法。
3.随着多种不同来源的人体干细胞的发现和鉴定，干细胞的治疗应用可能性也在不断被发掘，并建立了再生医学这个新的医学分支，旨在利用干细胞治疗目前尚不能用药物治愈的疾病。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，plga)由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国plga通过fda认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。间充质干细胞(mscs)为间质组织来源的与骨髓间充质干细胞(bm-mscs)生物学性状相似，具有自我更新及多向分化的潜能。mscs能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。人脐带间充质干细胞(hucmscs)即是mscs的一种。hucmscs的cd34、cd45和hla-dr均不表达，cd90、cd105，cd73表达阳性，这说明脐带hucmscs是一种非常原始的mscs群。大量的体外实验证明，在不同诱导条件下，hucmscs不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化。这提示我们可以利用hucmscs进行子宫内膜的修复。
4.由于人类子宫空腔结构的特殊性，利用干细胞的治疗很难将细胞定位到受损内膜处，细胞易随着血液、体液等流动发生组织扩散及损失，其临床应用的有效性和安全性受到制约，这要求在修复的同时能够为细胞在局部组织附着提供条件。所以需要预先制备适用于子宫内膜修复的plga-hucmscs复合物，此外在临床使用时，为了降低繁琐操作带来的污染风险，此复合物的制备具有操作过程简单，安全性高，复合时间短的特点。


技术实现要素：

5.发明的目的在于提供一种子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物的制备方法，该发明具有过程相对简单且安全性好的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞复合物的制备方法，包括以下步骤：
8.s1：hucmscs的获取，将处于冷冻状态的hucmscs(p3代次)从冷藏罐中取出，并对hucmscs进行复苏，加入完全培养液，并接种于培养瓶中；
9.s2：制备单细胞悬液，将培养瓶中培育的hucmscs进行传代，培养至p5代次后，将达到80％融合的hucmscs经胰酶消化后制备单细胞悬液；
10.s3：复合培养，取单细胞悬液均匀滴加到plga支架上，从而制得子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物；
11.s4：后续培养，向plga-hucmscs复合物中加入完全培养基，并置于培养箱中继续培养。
12.优选的，所述s1中从冷藏罐中取出处于冻存状态的hucmscs(p3代次)须立即置于37℃水浴中，并一直缓慢摇动使其解冻，然后将解冻后的干细胞转移到离心管中，在加入完全培养液后进行离心操作，离心后弃掉上清，用完全培养基再次重悬后，接种于培养瓶中。
13.优选的，所述s2中传代操作时，将达到80％融合的hucmscs经胰酶消化，制备成细胞悬液，按12.5
×
104/ml浓度传代接种于培养瓶，在温度为37℃，二氧化碳浓度5％的条件下继续培养至80％融合，再进行下一次传代操作，得到p5代次hucmscs。待p5代次hucmscs达到80％融合时，经酶消化制备单细胞悬液并调整细胞浓度约为1.6
×
106/10μl，接种体积为10μl/cm2。
14.优选的，所述s3中，取细胞悬液均匀滴加到plga支架上，细胞浓度约为1.6
×
106/10μl，接种体积为10μl/cm2，获得plga-hucmscs复合物。将plga-hucmscs复合物放入37℃，5％co2的培养箱环境中静置30分钟，中间取出一次观察复合物表面的湿润情况，如肉眼观察表面干燥，则需滴加5-10μl的完全培养基。
15.优选的，所述s4中向复合物中加入完全培养基时，必须缓慢轻柔，避免将支架表面的细胞冲散，培养箱的培养时间控制在2小时。
16.优选的，所述s1中的hucmscs是间充质干细胞的一种，具有自我更新及多向分化潜能。间充质干细胞能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.1、本发明提出的子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物的制备方法，其中先进行hucmscs的获取，从冷藏罐中取出hucmscs(p3代次)进行复苏，并接种于培养瓶中，然后将培养瓶中达到80％融合的hucmscs进行传代，再将达到80％融合的p5代次huc mscs经胰酶消化后制备成单细胞悬液，进行复合培养，即取单细胞悬液均匀滴加到plg a支架上，从而制得子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物，最后进行后续培养。本发明用hucmscs与plga支架进行混合培养，通过较为简单的技术将已通过美国fda批准的plga支架用于子宫内膜修复技术，安全性好；
19.2、本发明提出的子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物的后续培养时间控制在2h。在本发明步骤s4中，通过对不同培养时间(1h，1.5h、2h，2.5h)的plga-hucmscs复合物进行细胞计数及免疫荧光染色，优选出2h作为plga-hucmscs复合物后续培养时间，为临床应用提供依据和参考。
附图说明
20.图1为hucmscs成骨及成脂诱导分化图，左上及左下均为对照组，右上为成骨分化阳性组，钙结节茜素红染色呈阳性；右下为成脂分化阳性组，油红o染色呈阳性；
21.图2为hucmscs流式细胞术检测表面标志物，cd73、cd90，cd105阳性表达，均高于99％；cd34、cd45，hla-dr阴性表达，均低于2％；
22.图3为1cm
2 plga支架与hucmscs复合培养图；
23.图4为plga支架与hucmscs复合培养不同时间后状态图；
24.图5为在3cm
×
4cm大小的plga支架表面均匀接种12次，复合培养2h后，dapi染色(100
×
)显示各接种位点细胞粘附良好。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1：
27.根据图1、图2所示，一种子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物的制备方法，包括以下步骤：
28.s1：hucmscs的获取，hucmscs是间充质干细胞的一种具有自我更新及多向分化潜能的细胞，能分化为多种间质起源的组织细胞，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。其中将处于冻存状态的hucmscs(p3代次)从冷藏罐中取出，立即将其置于水浴中，一直缓慢摇动使其解冻，对hucmscs进行复苏。然后将解冻后的干细胞转移到离心管中，在加入完全培养液后进行离心操作，离心后弃掉上清液，再次加入完全培养基将干细胞重悬，并接种于培养瓶中。
29.s2：制备单细胞悬液，其中将培养瓶中已达到80％融合的hucmscs进行传代，采用胰酶对其进行消化处理得到单细胞悬液，调整细胞悬液浓度至12.5
×
104/ml，接种于培养瓶，置于37℃，5％co2的培养箱中继续培养，完成传代；将达到80％融合的hucmscs(p5代次)用胰酶消化后，调整单细胞悬液浓度至1.6
×
106/10μl，备用。
30.s3：复合培养，将plga支架用75％的乙醇浸泡30min，再用无菌生理盐水反复清洗3次，吸干残留水分后，用无血清培养基将其完全浸润，备用；将已经制备好的细胞悬液按接种体积为10μl/cm2均匀滴加到plga支架上，从而制得plga-hucmscs复合物；将复合物放入37℃，5％co2的培养箱中静置30min。
31.s4：后续培养，向plga-hucmscs复合物中加入适量完全培养基，然后放入培养箱中继续培养，培养箱内的温度控制在37℃，co2浓度控制在5％，培养时间控制在2小时。
32.本发明提出的子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物的制备方法，其中先进行hucmscs的获取，其中对从冷藏罐中取出hucmscs(p3代次)进行复苏，并接种于培养瓶中；然后制备单细胞悬液，其中将培养瓶中达到80％融合的hucmscs进行传代培养一定时间，再将达到80％融合的hucmscs(p5代次)经胰酶消化后，制备单细胞悬液；接着进行复合培养，即
取单细胞悬液均匀滴加到plga支架上，从而制得子宫内膜修复用plga-hucmscs复合物，最后进行后续培养。本发明用hucmscs与plga支架进行混合培养，通过较为简单的技术将已通过fda批准的plga支架用于子宫内膜修复技术。
33.对比例：
34.根据图3、图4所示同实施例1，不同的是步骤s4培养箱内，时间分别控制在1h、1.5h和2.5h，对比实施例1中的2h，细胞粘附率及活率以及hucmscs质控检测结果如下表所示，图3中，1cm
2 plga支架与hucmscs复合培养；左上为1cm2的无菌plga支架；右上为接种了hucmscs后的plga支架；下面为加入完全培养基后的lga-hucmscs复合物；复合培养时间从左至右依次为1h、1.5h、2h，2.5h。
35.表1不同时间组洗脱后细胞粘附率及活率
[0036][0037][0038]
表2 hucmscs质控检测结果
[0039][0040]
根据图4所示，为plga支架与hucmscs复合培养不同时间后，经无菌生理盐水漂洗，多聚甲醛固定，dapi染色(100
×
)发现，1-2h粘附于plga表面的hucmscs数量明显增多，2h与2.5h无显著差异。
[0041]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。