蛋白质降解的调节的制作方法

1.基于塞勒布隆(crbn)与精氨酸琥珀酸合成酶1(ass1)的相互作用的存在、不存在或水平提供了筛选化合物和/或评估化合物在治疗疾病或病症方面的功效的方法。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2019年12月17日提交的美国临时申请号62/949,021的权益，该临时申请的全部内容并入本文。


背景技术：

4.通过将靶蛋白导引到蛋白酶体来消除细胞中的靶蛋白的靶蛋白质降解，或通过将靶蛋白捕获在高级蛋白质复合物中的靶蛋白抑制，是药物发现中引人注目的新领域。分子胶和蛋白质降解的二价诱导物(也称为蛋白水解靶向嵌合体(protac))代表引人注目的治疗新方式，因为它们有可能以使用常规抑制剂无法实现的方式抑制和/或降解(包括以亚化学计量浓度抑制和/或降解)此前被认为不可被用药(undruggable)的靶点。分子胶和protac结合至细胞内的某些蛋白质，从而诱导抑制或降解疾病靶蛋白的分子复合物的形成。
5.虽然这些剂的潜力很大，但是它受到某些倾向性(liabilities)的阻碍，诸如，这些剂接合非治疗相关靶点的靶点(偏离靶点)，并且它们的接合会带来药物副作用和毒性的风险并且/或者减少治疗相关靶点的有效接合(例如，由于任何偏离靶点的竞争性接合)。仍然需要发现没有此类倾向性的剂。


技术实现要素：

6.因此，在各个方面，本发明提供了对促进、诱导、增强和/或稳定小分子-蛋白质(或小分子-蛋白质复合物)相互作用并且/或者缺乏或具有显著减少的靶点倾向性的治疗剂的发现。本发明在各种实施方案中提供了，用于鉴定这样的化合物的方法，所述化合物由于对疾病相关靶点的更具选择性的调节而对疾病治疗更有效和/或具耐受性，不会与无关的或构成风险的或有害的(例如偏离靶点的)相互作用发生交叉反应以及向所述相互作用偏离。
7.在一些方面，本发明涉及鉴定这样的化合物的方法，所述化合物不受与精氨酸琥珀酸合成酶1(ass1)的直接或间接相互作用的影响以及/或者不诱导与精氨酸琥珀酸合成酶1的直接或间接相互作用。例如，在实施方案中，本发明提供了对这样的化合物的选择，所述化合物具有减少的、低的或基本上没有引起、诱导、增强或稳定ass1向蛋白质复合中物的募集以及/或者因此抑制ass1和/或促进ass1的泛素化和/或降解的活性或能力。在实施方案中，本发明提供了对这样的化合物的选择，所述化合物具有减少的、低的或基本上没有引起、诱导、增强或稳定ass1与crbn的直接结合的活性或能力。
8.在各个方面，本发明涉及一种鉴定候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至塞勒布隆(crbn)的能力的测试化合物，在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触，测定以下中的一者或多者：ass1向crbn的募集、ass1与所述crbn/
protein-protein interactions,”methods mol biol.2015；1278:447-55和lievens等人“array mappit:high-throughput interactome analysis in mammalian cells,”j proteome res.2009年2月；8(2):877-86，这些文献的全部内容以引用的方式并入本文)描述并且在实施例1中更详细地概述的双杂交技术系统mappit的变型在人orf(eome)cdna文库中筛选响应于cc220(一种已知的imid药物和crbn配体)而募集到crbn的靶点来鉴定。在以阵列形式显示的细胞簇内测定细胞中的蛋白质相互作用。细胞微阵列中的每个点均对应于此种表达单个orf/蛋白质候选物的细胞簇，其正在经受配体诱导的(在这种情况下是cc220诱导的)与crbn的相互作用测试。正相互作用被读出为细胞荧光的增加。示出了在大量单个orf/靶蛋白候选物中/针对单个orf/靶蛋白候选物进行细胞微阵列筛选获得的荧光强度数据的点图。x轴示出粒子计数，y轴示出微阵列中的每个细胞簇的积分强度。如图所示和指示，对于表示ass1 orf的细胞阵列坐标，观察到显著的信号诱导。还示出了ikzf1(一种已知的cc220诱导的crbn相互作用物)的信号诱导以供参考。
18.图2作为分子胶诱导的crbn新底物的内源性ass1的鉴定。内源性ass1被使用“蛋白质陷阱”技术鉴定为来那度胺诱导的crbn相互作用物，该“蛋白质陷阱”技术称为virotrap，并且在先前有描述(eyckerman等人“trapping mammalian protein complexes in viral particles,”nature communications 7:11416(2016)，该文献的全部内容以引用的方式并入本文)，并且在实施例2中更详细的概述。通过鉴定来自病毒样颗粒的ass1胰蛋白酶肽来检测响应于来那度胺的ass1与crbn的结合，所述病毒样颗粒含有在颗粒出芽过程中募集到此种颗粒中的细胞crbn(包括任何相关的一种或多种蛋白质)。因此，示出了从含有病毒样颗粒的crbn分离的肽的胰蛋白酶肽同一性的火山图，所述病毒样颗粒使用virotrap程序从暴露于来那度胺(len)与dmso对照媒介物的细胞分离(以鉴定len诱导的crbn相互作用物)。对应于ass1的胰蛋白酶肽信号(log10 p值)以及在存在来那度胺(len)或dmso对照媒介物(x轴)的情况下ass1胰蛋白酶肽信号的相对倍数变化将内源性ass1鉴定为len诱导的crbn相互作用物。
19.图3a-b活细胞中的配体诱导的crbn-ass1相互作用
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如通过免疫共沉淀分析所评估。在这项研究中，我们检查了在存在或不存在crbn imid配体cc220的情况下，flag标记的ass1(或flag标记的gp130-ass1融合蛋白，如在图1中描述的测定法中所鉴定)和ha标记的crbn在hek293t细胞中转染和表达每个构建体后在活细胞中相互作用的能力。还检查了ha标记的crbn响应于cc220与已知的crbn新底物ikzf3相互作用的能力(ikzf3表达为flag标记的ikzf3融合蛋白)。图3a示出了与抗flag抗体进行免疫共沉淀，随后对免疫沉淀样品进行蛋白质印迹分析，并且使用flag肽从珠粒洗脱所获得的结果。用抗ha抗体进行蛋白质分析以确定每个样品中的免疫沉淀crbn的程度(预计会随着cc220暴露而变化)，并且用抗flag抗体进行蛋白质分析以确定每个样品中的免疫沉淀flag-ass1、flag-gp130-ass1或flag-ikzf3的程度(预计相同)。如图3a(上图)所示，ha-crbn仅在存在cc220的情况下存在于ass1免疫沉淀物中，这与图1和图2中概述的结果一致，即ass1是配体诱导的crbn新底物，即响应于cc220结合至crbn而募集到crbn的靶点。图3a(下图)显示，flag标记的ass1或flag标记的ikzf3的数量在相关样品的抗flag免疫共沉淀物中相同。图3b显示在经受免疫沉淀分析的所有样品中，如图3a所示，在从用各种构建体转染的细胞获得的各种样品中每种蛋白质的相对表达是相似的
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如上图中的ha-crbn和下图中的flag-ass1、flag-gp130-ass1或
flag-ikzf3所示。结果与图3a(下图)中所示的结果一致。
20.图4配体诱导的ass1向crbn的募集与活细胞中的ass1的降解相关。在这项研究中，我们检查了配体诱导的ass1向crbn的募集是否会导致随后的ass1降解(如通过与crbn e3连接酶的相互作用触发)。将hek293细胞与编码flag标记的ass1和ha标记的crbn的cdna构建体共转染，并且暴露于递增的浓度的cc220中24小时。对所产生的样品进行蛋白质印迹分析，以确定在不同实验条件下ass1的稳态水平，如使用抗flag抗体所评估。如图所示，特别观察到ass1表达(但不是肌动蛋白对照蛋白表达)的响应于cc220暴露的丧失，并且是剂量依赖性方式的。这些结果表明ass1是crbn的新底物，并且配体诱导的与crbn的相互作用触发其蛋白酶体降解
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如针对一些其他已知的crbn新底物(诸如ikzf1/3)所观察。
21.图5a-5l.结合至crbn但与已知的crbn imid配体(诸如来那度胺/len和cc220或其他crbn配体(左侧的罗马数字名称))相比不会有效募集crbn新底物ass1的化合物的发现和表征。在这项研究中，我们证明了可以鉴定出以高效力结合至crbn(即使在如由竞争实验所示的imid配体结合口袋中)但不会募集ass1的crbn配体。以下实验设置用于首先评估活细胞中的化合物的crbn结合效率：mappit样测定法(如图1和实施例1和实施例5中的相关方法部分所述，并且其中hek293细胞用编码转基因(编码dhfr和crbn融合蛋白)的适当cdna转染)被用于产生正测定信号，该正测定信号是形成三元蛋白质/化合物复合物的结果，该三元蛋白质/化合物复合物包括dhfr融合蛋白、甲氧苄啶-来那度胺杂合配体(甲氧苄啶是dhfr的配体)和crbn-gp130融合蛋白(crbn结合配体来那度胺)——因此，形成dhfr-trim-len-crbn复合物。该复合物的形成导致stat响应性荧光素酶报告基因的活化。
22.在图5a-5c中，该信号被设置为100％荧光素酶活性。在单独的样品设置中，细胞以相同的方式制备，但是另外将细胞与测试化合物共温育，研究了该测试化合物与crbn的相互作用。与crbn融合蛋白的结合将与杂合配体与相同的crbn蛋白的结合竞争，因此由于阻止产生测定信号所需的三元复合物形成而抑制测定信号。评估递增浓度的测试化合物以确定如在活细胞中进行的这种类型的配体竞争实验所确定的crbn结合效率。如图所示，已知的imid化合物(来那度胺/len，cc220)与来那度胺杂合配体有效竞争与crbn的结合(crbn相关测定信号抑制的剂量反应曲线)。类似地，一组其他化合物也能有效竞争。通过平行实验设置评估信号抑制的特异性，其中评估测试化合物对由在不存在杂合配体的情况下直接结合至dhfr融合蛋白的对照gp130融合蛋白(ctrl)产生的信号的抑制作用(即蛋白质的直接相互作用)。总之，图5a-5c中显示的结果将各种化合物定性为强效的crbn结合剂。
23.在图5d-5g和图5h-5l中，我们确定了这些crbn结合化合物中的哪些将是有效的ikzf1和/或ass1新底物募集剂(分别)。在这个实验设置中，将细胞用编码crbn融合蛋白和ikzf1或ass1融合蛋白的构建体转染。用递增浓度的测试化合物来评估测试化合物活性(剂量反应研究)，以监测促进crbn配体诱导的蛋白质相互作用
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即，对ikzf1或ass1新底物的募集。如所示的，已知的imid化合物(len，cc220)促进ikzf1(图5d-5g)和ass1(图5h-5l)二者的募集，一些其他化合物也是如此。相比之下，此处显示的两种化合物(v、vi)在crbn结合方面与其他化合物一样有效(图5a-5c，竞争曲线)，不能募集ikzf1(图5d-5g)和ass1(图5h-5l)。这表明可以鉴定和表征缺乏ass1新底物募集活性的crbn配体的差异蛋白质募集活性。还观察到与len和cc220相比，相对于其他底物(例如，ikzf1)而言，募集ass1的能力降低的化合物。
24.图6显示，分子胶诱导的crbn-ass1相互作用可以使用采用ddb1受体融合的替代性mappit测定法配置来检测。进行替代性crbn底物结合测定法，其中ddb1与mappit嵌合受体构建体融合(psel-ddb1)，未融合的crbn诱饵蛋白与底物gp130融合蛋白ikzf1(gp130-ikzf1)或ass1(gp130-ass1)一起共表达。在不存在crbn共表达(“无crbn”)的情况下，未观察到来那度胺(len)诱导的信号。然而，当共转染未融合的crbn表达构建体时，ikzf1和ass1相互作用二者都获得了len依赖性信号。
具体实施方式
25.本发明部分地基于以下发现，即某些crbn结合化合物还募集、促进、增强和/或稳定crbn和ass1的结合以及/或者引起ass1向crbn的募集、ass1的泛素化和/或ass1的降解。不希望受理论的束缚，crbn结合化合物与ass1的这些相互作用可以代表偏离靶点倾向性，所述偏离靶点倾向性降低或耗尽crbn结合化合物介导与更多crbn的治疗相关底物或新底物的基于crbn的相互作用的能力。因此，在各个方面，本发明提供了一种鉴定基本上没有ass1介导的作用的crbn结合化合物的方法。
26.在各种实施方案中，本发明方法允许深入了解基于crbn的相互作用网络，所述基于crbn的相互作用网络强调了各种化合物的治疗功效以及ass1或其他靶点相关倾向性的潜力；因此允许发现和构建新的或改善的不表现出或表现出减少的交叉反应性和imid常见的倾向性的用于治疗疾病的化合物，诸如目前销售的药物沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。
27.鉴定和/或筛选化合物的方法
28.在实施方案中，基于与ass1的直接或间接相互作用的存在、不存在或水平，提供了筛选化合物以及/或者评估crbn结合化合物在治疗疾病或病症方面的功效的方法。在实施方案中，基于与ass1的直接相互作用的存在、不存在或水平，提供了筛选化合物以及/或者评估crbn结合化合物在治疗疾病或病症方面的功效的方法。在各种实施方案中，提供了一种发现这样的剂的方法，所述剂结合至crbn或与crbn相互作用但是不另外引起、诱导、增强和/或稳定ass1向crbn的直接或间接募集以及/或者引起ass1的泛素化和/或ass1的降解。
29.在各个方面，本发明涉及一种用于鉴定候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物，在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触，测定以下中的一者或多者：向crbn的募集、ass1与所述crbn/测试剂复合物的增强结合、ass1的泛素化和/或ass1的降解，以及如果检测到向crbn的募集、ass1与所述crbn/测试剂复合物的结合、ass1的泛素化和/或ass1的降解减少、低或基本上没有变化，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
30.在各个方面，本发明涉及一种用于鉴定候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物，在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触，测定ass1与所述crbn/测试剂复合物的直接结合，以及如果检测到ass1与所述crbn/测试剂复合物的直接结合减少、低或基本上没有变化，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
31.在其他方面，本发明涉及一种制备候选组合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：鉴定候选化合物和将候选组合物配制用于疗法，其中所述候选化合物的鉴定通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物；在存在ass1的情况下使所述测
试化合物与crbn接触；测定以下中的一者或多者：ass1向crbn的募集、ass1与所述crbn/测试剂复合物的增强结合、ass1的泛素化和/或ass1的降解；以及如果检测到减少的、低的或基本上没有向crbn的募集、ass1与所述crbn/测试剂复合物的增强结合、ass1的泛素化和/或ass1的降解，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
32.在其他方面，本发明涉及一种制备候选组合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：鉴定候选化合物和将候选组合物配制用于疗法，其中所述鉴定候选化合物通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物；在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触；测定ass1与所述crbn/测试剂复合物的直接结合；以及如果检测到减少的、低的或基本上没有ass1与crbn/测试剂复合物的直接结合，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
33.在实施方案中，本发明涉及用于开发影响蛋白质复合物形成、泛素化和/或降解的剂的方法。例如，在各种实施方案中，本发明涉及用于开发影响蛋白质复合物形成和/或降解的剂的方法，所述方法是通过如下方式来实现：使crbn的活性和/或作用转向治疗途径(例如有利于治疗相关crbn底物或新底物(例如，但不限于，包含降解决定子基序的crbn底物或新底物，例如但不限于ikaros(ikzf1)、helios(ikzf2)、aiolos(ikzf3)、eos(ikzf4)、pegasus(ikzf5)、csnk1a、ck1a和/或zfp91)的募集和/或降解)，而远离非治疗途径(例如偏离靶点)(例如不利于ass1和/或其他偏离靶点蛋白(例如，但不限于sall4)的募集和/或降解)。
34.在一些实施方案中，ass1和/或非ass1的crbn的底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解通过测量ass1和/或非ass1的crbn的底物或新底物的蛋白质或核酸的水平(例如rna水平)来评估。在一些实施方案中，ass1和/或非ass1的crbn的底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解是相对于参考(和/或彼此)来进行评估的。在实施方案中，ass1的相对募集，和/或泛素化和/或降解的减少为例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％。在实施方案中，ass1的相对募集和/或泛素化和/或降解的相对减少为至少2，或3，或4，或5，或7，或10，或15，或20倍。在实施方案中，非ass1的crbn底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解的相对增加为例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％。在实施方案中，非ass1的crbn底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解的相对增加为至少2，或3，或4，或5，或7，或10，或15倍，或20倍。
35.在一些实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物结合至crbn，允许crbn与除ass1之外的crbn的底物或新底物之间的结合或相互作用，并且不允许crbn与ass1之间的实质性结合或相互作用。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导crbn与除ass1之外的crbn的底物或新底物之间的结合或相互作用，并且基本上不介导crbn与ass1之间的结合或相互作用。
36.在各种实施方案中，除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解比ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解高约5倍、10倍，或约100倍，或约1,000倍，或约10,000倍，或约100,000倍。在各种实施方案中，如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合
物所介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化，和/或募集和/或降解比如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物所介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化，和/或募集和/或降解高约5倍、10倍，或约100倍，或约1,000倍，或约10,000倍，或约100,000倍。
37.在各种实施方案中，除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解比ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解高约5倍至10倍，或约5倍至约25倍，或约5倍至约50倍，或约5倍至约100倍，或约5倍至约250倍，或约5倍至约500倍，或约5倍至约1,000倍，或约5倍至约3,000倍，或约5倍至约5,000倍，或约5倍至约10,000倍，或约5倍至约30,000倍，或约5倍至约50,000倍，或约5倍至约100,000倍，或10倍至约50倍，或约10倍至约100倍，或约10倍至约250倍，或约10倍至约500倍，或约10倍至约1,000倍，或约10倍至约3,000倍，或约10倍至约5,000倍，或约10倍至约10,000倍，或约10倍至约30,000倍，或约10倍至约50,000倍，或约10倍至约100,000倍，或约100倍至约1,000倍，或约100倍至约3,000倍，或约100倍至约5,000倍，或约100倍至约10,000倍，或约100倍至约30,000倍，或约100倍至约50,000倍，或约100倍至约100,000倍，或约1,000倍至约10,000倍，或约1,000倍至约30,000倍，或约1,000倍至约50,000倍，或约1,000倍至约100,000倍。
38.在各种实施方案中，如所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解比如所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物所介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解高约10倍至约50倍，或约10倍至约100倍，或约10倍至约250倍，或约10倍至约500倍，或约10倍至约1,000倍，或约10倍至约3,000倍，或约10倍至约5,000倍，或约10倍至约10,000倍，或约10倍至约30,000倍，或约10倍至约50,000倍，或约10倍至约100,000倍，或约100倍至约1,000倍，或约100倍至约3,000倍，或约100倍至约5,000倍，或约100倍至约10,000倍，或约100倍至约30,000倍，或约100倍至约50,000倍，或约100倍至约100,000倍，或约1,000倍至约10,000倍，或约1,000倍至约30,000倍，或约1,000倍至约50,000倍，或约1,000倍至约100,000倍。
39.在一些实施方案中，测定相对于如由参考化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解。
40.在各种实施方案中，参考化合物是沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-220或cc-122。
41.在一些实施方案中，测定相对于处于基础状态下的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解。
42.在一些实施方案中，测定相对于如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合
物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解。
43.在一些实施方案中，本发明方法提供了：(a)测定相对于如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解，以及(b)与相对于如由参考化合物介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由参考化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解进行比较。
44.在各种实施方案中，参考化合物是沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、cc-220或cc-122。
45.在一些实施方案中，本发明方法提供了以下步骤：(a)测定相对于如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解，以及(b)与相对于如由来那度胺介导的除ass1之外的crbn的底物或新底物的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解而言的如由来那度胺介导的ass1的亲和力(对于crbn)和/或募集(被crbn募集)和/或泛素化和/或降解进行比较。
46.在一些实施方案中，提供了一种鉴定候选化合物的方法，所述方法涉及利用表达crbn的细胞使细胞与具有结合至crbn的能力的测试化合物接触；测定ass1的募集和/或泛素化和/或降解；以及如果检测到减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或泛素化和/或降解，则将测试化合物分类为候选化合物。在实施方案中，针对除ass1之外的crbn的底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解对细胞进行进一步测定。
47.在实施方案中，本文所述的方法进一步包括测定ass1和/或除ass1之外的crbn的底物或新底物的募集和/或泛素化和/或降解。
48.在实施方案中，将降解测定法、泛素化测定法或蛋白质组学实验用于测定募集、泛素化或降解。参见，例如kim,sung ah等人"a novel cereblon modulator for targeted protein degradation."european journal of medicinal chemistry 166(2019):65-74；美国专利公开号2019/0017998，它们以引用的方式整体并入。
49.塞勒布隆(crbn)
50.在实施方案中，crbn是指包含任何crbn诸如人crbn蛋白(例如，人crbn同种型1(genbank登录号np_057386)；或人crbn同种型2(genbank登录号np_001166953)，其中的每一个均以引用的方式整体并入本文)的氨基酸序列的多肽，以及相关的多肽，包括它们的snp变体。相关的crbn多肽包括等位基因变体(例如，snp变体)；剪接变体；片段；衍生物；置换、缺失和插入变体；融合多肽；以及物种间同源物，它们在某些实施方案中保留了crbn活性并且/或者足以产生抗crbn免疫反应。
51.在实施方案中，本发明涉及结合crbn的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物。在实施方案中，本发明涉及这样的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物，该
化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物诱导crbn构象变化(例如，在crbn的结合口袋内)或者以其他方式改变crbn表面的性质(例如，在该蛋白质的邻近区域上)，其中所述crbn构象变化或改变引起新底物的泛素化。
52.ass1
53.在实施方案中，ass1是指包含任何ass1诸如人ass1蛋白(例如，genbank登录号aah21676.1，其据此以引用的方式整体并入)的氨基酸序列的多肽，以及相关的多肽，包括它们的snp变体。相关的ass1多肽包括等位基因变体(例如，snp变体)；剪接变体；片段；衍生物；置换、缺失和插入变体；融合多肽；以及物种间同源物，它们在某些实施方案中保留ass1活性。
54.ass1是一种尿素循环酶，其通过在精氨酸琥珀酸裂解酶(asl)的帮助下将瓜氨酸转化为精氨酸而在精氨酸生物合成途径中提供限速步骤。更具体而言，ass1催化瓜氨酸和天冬氨酸缩合形成精氨酸琥珀酸，即精氨酸的直接前体。ass1作为尿素循环的一部分在肝脏中普遍存在，并且它也被认为是其他组织中普遍存在的酶。haines等人,"argininosuccinate synthase:at the center of arginine metabolism."international journal of biochemistry and molecular biology 2.1(2011):8-23。
55.ass1在各种组织中普遍表达，在肝脏和肾脏中表达最为丰富。yu等人,preparation of recombinant argininosuccinate synthetase and argininosuccinate lyase:expression of the enzymes in rat tissues,j biochem.1995年5月；117(5):952-7。
56.ass1缺陷与异常t细胞分化和功能有关，导致原发性免疫功能障碍。ass1缺陷与异常t细胞分化和功能有关。
57.化合物和/或治疗化合物和/或候选化合物和/或测试化合物
58.在实施方案中，本发明涉及结合crbn的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物。在实施方案中，本发明涉及这样的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物，该化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物诱导crbn构象变化(例如，在crbn的结合口袋内)或者以其他方式改变crbn表面的性质(例如，在该蛋白质的邻近区域上)。在实施方案中，本发明涉及这样的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物，该化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物诱导crbn构象变化(例如，在crbn的结合口袋内)或者以其他方式改变crbn表面的性质(例如，在该蛋白质的邻近区域上)，其中所述crbn构象变化或改变引起crbn与非ass1的crbn的底物和/或新底物的结合以及/或者引起非ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化和/或非ass1的crbn的底物和/或新底物的降解。
59.在实施方案中，本发明涉及结合crbn但弱结合至或基本上不结合ass1的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物。在实施方案中，本发明涉及这样的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物，该化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物诱导crbn构象变化(例如，在crbn的cma结合口袋内)或者以其他方式改变crbn表面的性质(例如，在蛋白质的邻近区域上)，其中所述crbn构象变化或改变导致非ass1但弱结合至或基本上不结合ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化和/或降解。
60.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物结合crbn但弱结合至或基本上不结合非ass1的crbn的底物和/或新底物。在实施方案中，所述化合物、测
试化合物、候选化合物或治疗化合物以约1μm的亲和力或更高的亲和力结合crbn。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以约500nm，或约300nm、约100nm、约30nm、约10nm或约1nm的亲和力结合crbn。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以约500nm，或约300nm、约100nm、约30nm、约10nm或约1nm的亲和力结合crbn，同时以至少1μm，或至少3μm，或至少10μm，或至少30μm，或至少100μm，或至少300μm，或至少1000μm的亲和力结合非ass1的crbn的底物和/或新底物。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物弱结合至或基本上不结合至ass1。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以至少1μm，或至少3μm，或至少10μm，或至少30μm，或至少100μm，或至少300μm，或至少1000μm的亲和力结合ass1。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以至少1μm，或至少3μm，或至少10μm，或至少30μm，或至少100μm，或至少300μm，或至少1000μm的亲和力结合ass1，同时以约500nm，或约300nm、约100nm、约30nm、约10nm，或约1nm的亲和力结合crbn。
61.在各种实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对crbn的结合kd或ec50显著低于所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对ass1的结合kd或ec50(即对crbn的结合比对ass1的结合更紧密)。
62.在各种实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对crbn的亲和力比所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对ass1的亲和力高约10倍，或约100倍，或约1,000倍，或约10,000倍，或约100,000倍。
63.在各种实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对crbn的亲和力比所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物对ass1的亲和力低约10倍至约50倍，或约10倍至约100倍，或约10倍至约250倍，或约10倍至约500倍，或约10倍至约1,000倍，或约10倍至约3,000倍，或约10倍至约5,000倍，或约10倍至约10,000倍，或约10倍至约30,000倍，或约10倍至约50,000倍，或约10倍至约100,000倍，或约100倍至约1,000倍，或约100倍至约3,000倍，或约100倍至约5,000倍，或约100倍至约10,000倍，或约100倍至约30,000倍，或约100倍至约50,000倍，或约100倍至约100,000倍，或约1,000倍至约10,000倍，或约1,000倍至约30,000倍，或约1,000倍至约50,000倍，或约1,000倍至约100,000倍。
64.在各种实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物与crbn的结合比它与ass1的结合紧密约10倍，或约100倍，或约1,000倍，或约10,000倍，或约100,000倍。
65.在各种实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物与crbn的结合比所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物与ass1的结合紧密约10倍至约50倍，或约10倍至约100倍，或约10倍至约250倍，或约10倍至约500倍，或约10倍至约1,000倍，或约10倍至约3,000倍，或约10倍至约5,000倍，或约10倍至约10,000倍，或约10倍至约30,000倍，或约10倍至约50,000倍，或约10倍至约100,000倍，或约100倍至约1,000倍，或约100倍至约3,000倍，或约100倍至约5,000倍，或约100倍至约10,000倍，或约100倍至约30,000倍，或约100倍至约50,000倍，或约100倍至约100,000倍，或约1,000倍至约10,000倍，或约1,000倍至约30,000倍，或约1,000倍至约50,000倍，或约1,000倍至约100,000倍。
66.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是分子胶。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物包含戊二酰亚胺环和邻苯
二甲酰亚胺环，它们中的一者或二者任选地被化学改性。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物的戊二酰亚胺环能够与crbn中的三个色氨酸残基笼氢键结合。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物诱导crbn的疏水性表面暴露，从而允许与新底物相互作用。
67.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是免疫调节药物或免疫调节酰亚胺药物(imid)。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是含有imid样戊二酰亚胺环但是在其他方面在化学结构上不同并且与crbn中的戊二酰亚胺-imid结合至相同的小分子结合口袋(crbn中的imid结合口袋)的化合物。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是不含戊二酰亚胺环并且可以在imid口袋中结合crbn的化合物。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是结合crbn但不在imid口袋中结合的化合物。
68.称为免疫调节药物(imid)的沙利度胺及其密切衍生物来那度胺和泊马度胺被用来治疗多种临床病状，诸如多发性骨髓瘤、淋巴瘤和其他血液疾病。不受任何特定理论的限制，用于本发明的免疫调节药物可以是t细胞的强效共刺激剂并且以剂量依赖性方式增加细胞增殖。本发明的免疫调节药物对cd8 t细胞亚群的共刺激作用也可能大于对cd4 t细胞亚群的共刺激作用。此外，该免疫调节药物具有抗炎性质并且共刺激t细胞。
69.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物结合crbn而非ass1。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物结合crbn以及非ass1的crbn的底物和/或新底物。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物能够同时结合crbn以及ass1和非ass1的crbn的底物和/或新底物中的一者或多者。
70.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是异双官能的，或者是异双官能化合物的组分。
71.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是蛋白水解靶向嵌合体(protac)。在各种实施方案中，所述测试化合物或候选化合物是蛋白水解靶向嵌合体(protac)的组分。
72.在各种实施方案中，本发明涉及发现或鉴定这样的化合物，该化合物例如通过具有能够结合crbn但弱结合或基本上不结合ass1的特征而适合于包含在protac中(例如作为protac的组分)。
73.在各种实施方案中，本发明涉及发现或鉴定这样的化合物，该化合物例如通过具有能够结合crbn但弱结合或基本上不结合ass1以及/或者非ass1的crbn的底物和/或新底物的特征而适合于包含在protac中(例如作为protac的组分)。
74.在实施方案中，protac掺有胞内靶蛋白的配体和e3泛素连接酶募集基团，它们由长度适合于将靶蛋白和泛素化机制结合在一起，从而引发所关注的蛋白质的泛素化及其后续在蛋白酶体中的降解的接头联接。
75.在各种实施方案中，所述protac包含(i)如本文所述的测试化合物或候选化合物(例如crbn结合剂，包括上文所述的分子胶化合物)，和(ii)能够结合与被所述测试化合物结合的蛋白质不同的靶蛋白(例如，crbn底物或借助于向所述测试化合物/crbn复合物的募集而成为新底物的蛋白质)的化合物，其中(i)和(ii)通过接头共价附接。
76.在实施方案中，protac进一步包含能够结合非ass1的crbn的底物和/或新底物的部分。
77.在实施方案中，protac进一步包含接头。在实施方案中，该接头的长度适合于将靶蛋白(例如ass1以及/或者非ass1的crbn的底物和/或新底物)和泛素化机制结合在一起，从而引发所关注的蛋白质的泛素化及其后续在蛋白酶体中的降解。
78.在实施方案中，protac包含(i)化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以及(ii)共价连接至接头的能够结合非ass1的crbn底物和/或新底物的部分。
79.在各种实施方案中，本发明涉及protac，所述protac包含(a)结合crbn但弱结合至或基本上不结合ass1的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以及(b)结合非ass1的crbn的底物和/或新底物的化合物。
80.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物包含(i)结合crbn的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物以及(ii)共价连接至接头的能够结合ass1以及/或者非ass1的crbn的底物和/或新底物的部分。
81.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是异双官能的并且能够通过点击化学缀合。点击化学描述了收率高、范围广、仅产生无需色谱即可除去的副产物、具有立体特异性、易于进行并且可以在易于除去的或无害溶剂中进行的反应(rostovtsev等人(2002)a stepwise huisgen cycloaddition process:copper(l)-catalyzed regioselective"ligation"of azides and terminal alkynes.angew.chem.int.ed.41:2596-2599)。点击化学已经以许多不同形式实施，在化学和生物学中都有广泛应用。点击反应的一个子类涉及对周围生物环境惰性的反应物。此类点击反应称为生物正交反应(sletten等人(2009)bioorthogonal chemistry:fishing for selectivity in a sea of functionality.angew.chem.int.ed.48:6974-6998)。适用于生物正交点击化学的生物正交反应物对是具有以下性质的分子基团：(1)它们相互反应，但是不与胞内环境中的细胞生物化学系统发生显著的交叉反应或相互作用；(2)它们和它们的产物和副产物在生理环境中是稳定且无毒的；以及(3)它们的反应具有高度特异性且快速。在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是异双官能的并且能够通过生物正交点击化学来缀合。
82.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是可点击蛋白水解靶向嵌合体(cliptac)。在实施方案中，此类cliptac包含(a)第一部分，其包含胞内靶蛋白(例如ass1和/或非ass1的crbn的底物和/或新底物)的配体；(b)第二部分，其包含e3泛素连接酶的配体；和(c)接头部分，其与第一部分和第二部分共价偶联；其中该接头包含由相容的反应部分对之间的生物正交点击反应产生的共价键。
83.在实施方案中，所述化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物是细胞内点击形成的蛋白水解靶向嵌合体(cliptac)。
84.其他底物/比率确定
85.在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物是例如涉及crbn的e3泛素连接酶复合物的蛋白质底物，或它们的下游底物。
86.在实施方案中，本文所述的方法进一步包括测定非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集和/或泛素化和/或降解。在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物包含降
解决定子基序。
87.在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物包含b-发夹a-转角，其中i-残基带有具有氢键受体的侧链诸如asx或st基序，其中在i的侧链和i 3的主链nh之间以及在i的主链羰基氧和i 4的主链nh之间具有氢键。在实施方案中，i 4残基是甘氨酸(非限制性实例包括gspt1、ck1a)。
88.在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物具有b-发夹a-转角，其中残基i和i 3是半胱氨酸并且i 4残基是甘氨酸。该两个cys残基与锌离子结合从而增强转角的形状(非限制性实例包括ikzf1、znf692，以及“defining the human c2h2 zinc finger degrome targeted by thalidomide analogs through crbn”,sievers等人,science，第362卷，第6414期，doi:10.1126/science.aat0572(2018)中报告的所有底物，该文献以引用的方式整体并入)。
89.在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物具有“假环”，即在i 3位带有甘氨酸的b-发夹b-转角。转角结构可以通过i-1侧链的氢键受体与i 3甘氨酸的羰基之间的氢键来增强(非限制性实例包括cdc7)。
90.在实施方案中，非ass1的crbn的底物和/或新底物选自ikaros(ikzf1)、helios(ikzf2)、aiolos(ikzf3)、eos(ikzf4)、pegasus(ikzf5)、csnk1a、ck1a和zfp91。
91.在实施方案中，本文所述的方法进一步包括测定ass1的募集和/或降解。
92.在各种实施方案中，本发明方法允许确定与非ass1的crbn的底物和/或新底物相比的ass1的水平。在各种实施方案中，本发明方法允许确定与ass1相比的非ass1的crbn的底物和/或新底物的水平。
93.在各种实施方案中，减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或降解是相对于非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集和/或降解的量而言的。
94.在实施方案中，本文所述的分类基于测试化合物更改ass1的募集、与crbn的结合，ass1的泛素化和/或ass1的降解的相对于不同的非ass1的crbn的底物和/或新底物的被crbn的募集、与crbn结合、泛素化和/或降解的比率的能力。
95.例如，在一个实施方案中，所述更改是以ass1的募集与非ass1的crbn的crbn底物和/或新底物的募集的比率表示，或者所述更改是以ass1的募集与非ass1的crbn的底物和/或新底物的与crbn的结合的比率表示，或者所述更改是以ass1的募集与非ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化的比率表示，或者所述更改是以ass1的募集与非ass1的crbn的底物和/或新底物的降解的比率表示。
96.例如，在一个实施方案中，所述更改是以ass1的与crbn的结合与非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集的比率表示，或者所述更改是以ass1的与crbn的结合与非ass1的crbn的底物和/或新底物的与crbn的结合的比率表示，或者所述更改是以ass1的与crbn的结合与非ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化的比率表示，或者所述更改是以ass1的与crbn的结合与非ass1的crbn的底物和/或新底物的降解的比率表示。
97.又如，在一个实施方案中，所述更改是以ass1的泛素化与非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集的比率表示，或者所述更改是以ass1的泛素化与非ass1的crbn的底物和/或新底物的与crbn的结合的比率表示，或者所述更改是以ass1的泛素化与非ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化的比率表示，或者所述更改是以ass1的泛素化与非ass1的crbn
的底物和/或新底物的降解的比率表示。
98.再如，在一个实施方案中，所述更改是以ass1的降解与非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集的比率表示，或者所述更改是以ass1的降解与非ass1的crbn的底物和/或新底物的与crbn的结合的比率表示，或者所述更改是以ass1的降解与非ass1的crbn的底物和/或新底物的泛素化的比率表示，或者所述更改是以ass1的降解与非ass1的crbn的底物和/或新底物的降解的比率表示。
99.在各种实施方案中，所述化合物或测试化合物是基于与ass1的募集、泛素化和/或降解相比，有利于非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集、泛素化和/或降解的能力被分类为候选化合物或治疗化合物。
100.在各种实施方案中，减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或降解是相对于缺乏所述化合物或测试化合物的参考样品中的ass1的募集、泛素化和/或降解的量而言的。
101.在各种实施方案中，减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或降解是相对于在基础状态下的ass1的募集、泛素化和/或降解的量而言的。
102.在实施方案中，降解是泛素依赖性的。
103.例示性疾病
104.根据本公开的化合物、测试化合物、候选化合物或治疗化合物可以被配制用于各种类型的癌症的治疗。
105.在实施方案中，提供了一种用于通过鉴定候选化合物来制备用于癌症疗法的候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物，在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触，测定ass1的募集和/或降解，以及如果检测到减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或降解，则将所述测试化合物分类为候选化合物，以及将所述候选化合物配制用于癌症。
106.在实施方案中，提供了一种用于制备用于癌症疗法的治疗化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：鉴定治疗化合物和将治疗组合物配制用于疗法，其中所述鉴定治疗化合物通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物；在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触；测定ass1的募集和/或降解；以及如果检测到减少的、低的或基本上没有ass1的募集和/或降解，则将所述测试化合物分类为治疗化合物，以及将所述治疗化合物配制用于癌症。
107.在实施方案中，癌症选自基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌症；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈部癌症；胃癌(包括胃肠道癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾癌或肾脏癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(嘴唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级成免疫细胞nhl；高级淋巴母细胞性nhl；高级小无裂细胞nhl；巨大肿块疾病nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性淋巴母细胞性白
血病(all)；毛细胞白血病；慢性成骨髓细胞性白血病；以及其他癌症和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(ptld)，以及与瘢痣病、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征(meigs’syndrome)相关的异常血管增生。
108.在一些实施方案中，癌症是白血病或淋巴瘤。例示性白血病或淋巴瘤包括但不限于白血病或淋巴瘤(选自b细胞淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)(包括低度和中度非霍奇金淋巴瘤(nhl))、复发性霍奇金病、难治性高度霍奇金病、霍奇金淋巴瘤的淋巴细胞主要亚型、前体b细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟b细胞赘生物、b细胞慢性淋巴细胞性白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、b细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)(包含低度、中度和高度fl)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、malt型边缘区b细胞淋巴瘤、结节边缘区b细胞淋巴瘤、脾型边缘区b细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、移植后淋巴增殖性病症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤和间变性大细胞淋巴瘤(alcl)。
109.在实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤，其任选地选自多发性骨髓瘤和与5q-缺失相关的骨髓增生异常综合征(del(5q)mds)。
110.在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。
111.副作用特征分析(profiling)和/或减少
112.在各种实施方案中，本发明方法允许鉴定可以帮助减少或预防各种副作用(例如与imid，例如来那度胺相关的副作用)的改善的化合物。药物诱导的肝损伤是可在多种药物的使用后发生的已知严重问题。据估计，每年每10,000至100,000名接触处方药的人中有10至15人发生药物诱导的肝损伤。参见sgro等人,hepatology 2002；36(2):451。有人提出，ass1存在于免疫器官和t细胞中，并且在t细胞功能中发挥作用。参见tarasenko等人,impaired t cell function in argininosuccinate synthetase deficiency.journal of leukocyte biology.2015；97(2):273-278。研究表明，t细胞中的ass1酶的缺陷与t细胞分化和功能异常有关，导致原发性免疫功能障碍。
113.虽然沙利度胺、来那度胺和泊马度胺有治疗益处，但是已知它们与并发症，诸如例如肾脏和肝脏毒性相关。沙利度胺和来那度胺二者都已牵涉到急性肝损伤的病例，急性肝损伤可能很严重，并已导致急性肝衰竭死亡。例如，肾衰竭是多发性骨髓瘤的来那度胺疗法的严重潜在并发症。参见kreiniz等人2016.acute renal failure associated with lenalidomide treatment in multiple myeloma:arare occurrence？anticancer res.36(6):2889-2892。在一项研究中，66％的al淀粉样变性患者在来那度胺治疗期间出现肾功能恶化，该患者中的32％患者出现严重肾功能障碍。specter等人(2011).kidney dysfunction during lenalidomide treatment for al amyloidosis.nephrology dialysistransplantation,26(3):881
–
886。已报道的多发性骨髓瘤患者和其他癌症患者的肾毒性目前已被公认为来那度胺和泊马度胺治疗的潜在并发症。wanchoo等人(2017).renal toxicities of novel agents used for treatment of multiple myeloma.clinical journal of the american society of nephrology:cjasn,12(1):176
–
189。
114.在实施方案中，本发明涉及一种以减少或消除剂的潜在副作用的方式制备候选
和/或治疗化合物的方法。在实施方案中，候选和/或治疗化合物通过如下方式来鉴定：确定该化合物是否与crbn结合或相互作用以致改变crbn的治疗相关的下游活性与crbn的诱导副作用的下游活性的比率，其中crbn的治疗相关的下游活性包括非ass1的crbn的底物和/或新底物(例如，包含降解决定子基序的crbn的底物和/或新底物，例如ikaros(ikzf1)、helios(ikzf2)、aiolos(ikzf3)、eos(ikzf4)、pegasus(ikzf5)、csnk1a、ck1a和/或zfp91)的募集和/或降解，并且crbn的诱导副作用的下游活性包括ass1的消融募集(ablated recruitment)和/或降解的减少。换句话说，该剂有利于crbn的治疗性下游效应，而不利于crbn的非治疗性下游效应。
115.在一些实施方案中，本发明方法涉及对ass1作为化合物是否具有安全性问题，例如肾脏或肝脏安全性问题，或者对t细胞产生影响(例如但不限于t细胞功能受损)的指标的探究(interrogation)。例如，检测到ass1的降解可以指示化合物将受到安全性问题的困扰。
116.在一些实施方案中，本发明方法涉及以具有较少或没有副作用的方式治疗疾病。例如，该治疗方法涉及，在实施方案中，基于有利于较少副作用的ass1特征(例如ass1的消融募集和/或降解的减少)来选择crbn结合化合物用于疗法。
117.在实施方案中，相对于另一种crbn结合化合物而言，化合物、测试化合物、候选化合物和/或治疗化合物在接受所述化合物、测试化合物、候选化合物和/或治疗化合物的受试者中表现出减少的副作用。在实施方案中，相对于沙利度胺、来那度胺和泊马度胺中的一者而言，所述化合物、测试化合物、候选化合物和/或治疗化合物在接受所述化合物、测试化合物、候选化合物和/或治疗化合物的受试者中表现出减少的副作用。
118.在实施方案中，副作用包括肝功能降低或受损以及/或者包括肾功能降低或受损。在实施方案中，副作用包括t细胞效应(例如，但不限于t细胞功能受损)。
119.促进ass1/ass1依赖性癌症的降解
120.ass1在多种人类癌症(包括肺癌、结肠癌、胃癌和卵巢癌)中过度表达。delage等人(2010).arginine deprivation and argininosuccinate synthetase expression in the treatment of cancer.int.j.cancer126(12):2762-2772。例如，最近研究显示，ass1是在原发性人类结肠直肠肿瘤中上调的靶点，并且ass1的药理学抑制或基因消融会损害结肠直肠癌致病性。bateman等人(2017).精氨酸琥珀酸合成酶1是结肠直肠癌致病性的调控因子。acs chem biol.12(4):905-911。因此，结肠直肠癌的治疗可以包括ass1的抑制。
121.不希望受理论的束缚，ass1通过调节自噬来促进胃癌侵袭和进展。进一步地，ass1是结肠直肠癌致病性的调控因子。因此，在各种实施方案中，本发明涉及促进ass1的募集和/或降解的化合物的鉴定。
122.在各种实施方案中，本发明涉及用于鉴定候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物；在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触；测定ass1的募集和/或降解；以及如果检测到ass1的募集和/或降解高或增加，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
123.在各种实施方案中，本发明涉及用于制备候选组合物的方法，所述方法包括：鉴定候选化合物和将候选组合物配制用于疗法，其中所述鉴定通过以下步骤来进行：获得具有结合至crbn的能力的测试化合物，在存在ass1的情况下使所述测试化合物与crbn接触，测
定ass1的募集和/或降解，以及如果检测到ass1的募集和/或降解高或增加，则将所述测试化合物分类为候选化合物。
124.在实施方案中，ass1的募集和/或降解高或增加是相对于在存在与测试化合物接触的crbn时非ass1的crbn的底物和/或新底物的募集和/或降解而言的，非ass1的crbn的底物和/或新底物选自ikaros(ikzf1)、helios(ikzf2)、aiolos(ikzf3)、eos(ikzf4)、pegasus(ikzf5)、csnk1a、ck1a和zfp91。
125.在实施方案中，ass1的募集和/或降解高或增加是相对于缺乏测试化合物的参考样品中的ass1的募集和/或降解的量而言。
126.在实施方案中，如果检测到ass1的募集和/或降解高或增加，则所鉴定的候选化合物适用于治疗癌症，诸如例如，依赖于ass1的癌症，诸如例如胃癌或结肠直肠癌。
127.实施例
128.实施例1：重组精氨酸琥珀酸合成酶1(ass1)作为被分子胶直接募集到塞勒布隆的底物/新底物的发现
129.为了鉴定配体诱导的crbn底物或新底物，使用lievens等人"proteome-scale binary interactomics in human cells."molecular&cellular proteomics 15.12(2016):3624-3639描述的程序进行mappit细胞微阵列筛选。传统的mappit测定法已经用于监测蛋白质-蛋白质相互作用。诱饵蛋白(蛋白a)表达为融合蛋白，在该融合蛋白中，该诱饵蛋白(蛋白a)与瘦蛋白受体的经工程化的胞内受体结构域基因融合，而瘦蛋白受体本身与促红细胞生成素(epo)受体的胞外结构域融合。epo配体与epor组分的结合引起受体相关的胞内jak2的活化。然而，活化的jak2不能活化瘦蛋白受体来触发stat3结合及其磷酸化，因为它的正常情况下被活化的jak2磷酸化的酪氨酸残基已经发生突变。相反，通过蛋白质b与蛋白质a的相互作用产生jak2可磷酸化stat3对接位点的重构，据此蛋白质b融合到gp130受体的胞质结构域(其现在含有被活化的jak2激酶识别的适当的酪氨酸)。因此，蛋白质a与蛋白质b的物理相互作用重构并且epo触发jak2-stat3信号传导通路活化。stat3的活化可以通过引入stat3响应性报告基因来监测，所述stat3响应性报告基因包括荧光素酶编码基因或者编码荧光标记物诸如gfp或一些其他类型的荧光蛋白(egfp等)的基因。以这种方式，mappit测定法提供了一种评估完整细胞中的此类重组蛋白质-蛋白质相互作用的通用测定法。可以用该方法筛选编码蛋白质b融合蛋白(即蛋白质b-gp130融合蛋白)的cdna文库，以鉴定能够与蛋白质a诱饵(与epor-lepr融合蛋白融合)相互作用的任何蛋白质。
130.在本实施例1中，我们使用我们专门开发用于确定crbn-配体诱导的蛋白质相互作用的mappit测定法的衍生形式，即使用特定的crbn诱饵蛋白(与该系统中的突变瘦蛋白受体融合)并且测定蛋白复合物形成的配体依赖性诱导，所述复合物包括蛋白质b融合蛋白(蛋白质b-gp130融合蛋白)。以这种方式，我们能够筛选cdna文库中的配体依赖性候选crbn新底物。在本文档的其他实施例(实施例5)中，该测定法也用于表征此类相互作用(或此类相互作用的缺乏)。
131.简而言之，用crbn诱饵表达质粒(psel-crbn)转染hek293t细胞，并且将其添加到含有覆盖超过15k orf的猎物表达质粒集合的微阵列筛选板中。在转染后二十四小时，用含有和不含有crbn配体cc-220(10μm)的促红细胞生成素对细胞进行差异刺激，在48小时后读出报告基因信号(gfp样荧光报告基因)。如此前报道的那样分析荧光强度数据，产生图1中
所示的点图。排名靠前的命中包括ikaros(ikzf1)，它是一种已知的cc-220诱导的crbn底物。在这项研究中，如图所示，我们还将精氨酸琥珀酸合成酶1(ass1)鉴定为一种新型cc220诱导的crbn新底物。还以这种方式用诸如来那度胺的化合物来鉴定ass1，来那度胺是另一类与crbn结合的imid(在商业上称为revlimid
tm
，一种熟知的抗癌药物)。
132.实施例2：内源性精氨酸琥珀酸合成酶1(ass1)作为被分子胶募集到塞勒布隆的底物/新底物的发现
133.在这项研究中，我们着手确认imid诸如来那度胺可以诱导内源性ass1向crbn的募集。为此，我们使用此前描述的称为virotrap的方法(titeca等人"analyzing trapped protein complexes by virotrap and sfinx."nature protocols 12.5(2017):881)。用这种方法，使crbn表达为含有病毒蛋白hiv-gag的融合蛋白。hiv-gag在细胞诸如hek293中被表达时，能够触发从细胞中出芽的病毒样颗粒的形成。在该颗粒中，hiv-gag蛋白朝向该颗粒的中心。当与crbn融合时，crbn也显示在该颗粒的内部核中。如果gag-crbn融合物与细胞内的蛋白质发生相互作用，则此类蛋白质与gag-crbn一起被拖入/捕获到该病毒样颗粒中。以这种方式，可以鉴定在存在或不存在crbn-配体的情况下与crbn相互作用的内源性蛋白质。这通过该颗粒的裂解和该样品的胰蛋白酶消化的标准质谱分析来实现。然后通过减法分析鉴定响应于诸如来那度胺的crbn-配体与该颗粒特异性缔合的蛋白质。使用这种方法，我们发现来那度胺诱导的内源性ass1与crbn的缔合，即ass1胰蛋白酶消化物将ass1鉴定为依赖于来那度胺而募集到病毒颗粒中的蛋白质。简而言之，将hek293t细胞与gag-crbn诱饵表达质粒和flag-vsv-g编码质粒(用于从细胞培养基中纯化颗粒)共转染，并温育24小时。然后，用10μm来那度胺或作为阴性对照的dmso处理细胞。在添加化合物后二十四小时，使用涂布有抗flag的磁珠从细胞上清液中分离病毒样颗粒(vlp)。使用flag肽从珠粒洗脱后，裂解纯化的vlp，并用胰蛋白酶消化蛋白质内容物过夜。通过lc-ms/ms分析肽样品，并使用maxquant软件包处理一式三份样品的数据，并使用perseus工具生成火山图(图2)。在表现出高的来那度胺与dmso对照样品的信号比和低p值的排名靠前的命中中鉴定出ass1。
134.实施例3：配体诱导的活细胞中的crbn-ass1相互作用
–
如通过免疫共沉淀分析所评估
135.在这项研究中，我们通过蛋白质复合物的免疫共沉淀评估了crbn配体cc220在hek293细胞中表达时诱导与ass1的相互作用的能力。与实施例1和2中的结果一致，这种替代性方法表明cc220特异性地诱导ass1向crbn-cc220复合物中的募集。对已知的crbn新底物ikzf3进行了类似观察，并将其作为阳性对照。简而言之，将编码(i)flag标记的gp130-ass1(用于实施例1中的mappit测定法的形式)、(ii)flag标记的-ass1或(iii)flag标记的ikzf3的质粒与ha标记的crbn在hek293t细胞中瞬时共转染。在转染后二十四小时，将细胞用不同剂量(0μm、1μm和3μm)的cc-220再处理24小时。第二天，裂解细胞并保留1/10的裂解物用于flag标记的融合蛋白和ha标记的crbn的表达分析(如图3b所示)。用另外的9/10的裂解物执行与抗flag抗体(sigma)和dynabeads链霉亲和素t1(invitrogen)的免疫共沉淀(图3a)。在免疫沉淀后，通过用flag肽(sigma)洗脱将被结合的flag蛋白和任何相关蛋白质从珠粒上洗脱下来。通过sds-page和使用抗ha抗体(roche)对洗脱样品的蛋白质印迹分析来研究ha-crbn的存在(图3a，上图)，即它向flag-ass1免疫沉淀物中的募集。分别使用抗flag抗体(sigma)来检测flag标记的ass1(图3a，下图)。通过sds-page和使用抗flag和抗ha抗体
(分别为sigma或roche)对裂解物的表达的蛋白质印迹分析来研究细胞裂解物中的所有蛋白质的表达，如图3b所示。
136.实施例4：配体诱导的ass1向crbn的募集与活细胞中的ass1的降解相关。
137.在这项研究中，我们检查了cc220 crbn-配体诱导的ass1向crbn的募集是否会导致随后的ass1降解(如由与crbn e3连接酶的相互作用触发)。对于该分析，用flag标记的ass1和ha标记的crbn编码构建体转染细胞，并且通过蛋白质印迹分析来评估ass1的稳态水平响应于细胞与cc220一起温育指定时间的任何变化。研究表明，ass1的ass1稳态水平确实响应于cc220以剂量反应方式降低，这证实配体诱导的ass1向crbn的募集触发了ass1蛋白降解。简而言之，将编码flag-ass1和ha-crbn的质粒共转染到hek293t细胞中。在转染后二十四小时，对细胞不加以处理，或用不同剂量(0.3μm、1μm、3μm、10μm或30μm)的cc-220将细胞再处理24小时。然后，裂解细胞并通过sds-page和使用抗flag抗体(sigma)的蛋白质印迹分析来分析一部分裂解物。作为上样对照，使用抗肌动蛋白抗体(sigma)来进行蛋白质印迹分析。
138.实施例5：结合至crbn但与已知的crbn imid配体(诸如来那度胺/len和cc220或其他crbn配体)相比不能有效募集crbn新底物ass1的化合物的发现和表征
139.在这项研究中，我们对一系列结合至crbn的化合物以及它们差异募集ass1新底物的能力进行了比较研究。我们在我们的研究中发现，已知的imid诸如来那度胺和cc220(参见实施例1-4)均诱导ass1向crbn的募集，并且这与细胞中ass1的降解相关(实施例4)。鉴于ass1是一种重要的细胞蛋白质，它的表达缺失已经被证明与细胞代谢和存活诸如免疫系统的t细胞的缺陷相关，我们提出了这样一个问题：即是否有可能鉴定和表征结合crbn但不能募集ass1的化合物。总之，这项研究表明，我们确实可以发现这样的crbn结合剂，该crbn结合剂竞争来那度胺与crbn的结合，是细胞中的crbn的强效结合剂(与来那度胺等效或者比来那度胺更强效)，但是与来那度胺相比，不诱导ass1的募集。这强调了在避免ass1募集倾向性的crbn配体开发中进行差异筛选和表征的可能性。该研究的细节示出在图5a-5l中，在该图中，我们定性了化合物在a)与细胞中的crbn的结合，b)诱导ass1或ikzf1向crbn的募集方面的效力。
140.用实施例1中描述的mappit样测定法(即，通过确定测试化合物与来那度胺杂合配体竞争结合细胞中的crbn的能力)评估crbn结合。将hek293t细胞在补充有10％胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基中培养，在37℃、8％co2下温育。使用标准转染方法，用编码与突变瘦蛋白受体的胞质结构域的尾部融合的大肠杆菌(e.coli)二氢叶酸还原酶(dhfr)的质粒(pclg-edhfr)、编码与gp130胞质结构域融合的crbn猎物的质粒(pmg1-crbn)或编码可以与dhfr融合蛋白的瘦蛋白受体直接相互作用的rem2对照猎物的质粒(pmg1-rem2)、和stat3反应性pxp2d2-rpapi-荧光素酶报告基因质粒来转染细胞，所述标准转染方法如文献(lievens等人"array mappit:high-throughput interactome analysis in mammalian cells."journal of proteome research 8.2(2009):877-886)所述。在转染后24小时，在不存在或存在指示剂量的测试化合物的情况下，用瘦蛋白处理细胞以活化瘦蛋白受体融合蛋白，并给细胞补充300nm甲氧苄啶-来那度胺融合化合物(杂合配体，其中甲氧苄啶与dhfr相互作用，并且来那度胺与crbn相互作用)。在化合物处理后的24小时，使用具有ensight读板器(perkin elmer life sciences,waltham,ma)的荧光素酶测定系统试剂盒(promega,
madison,wi)测量由包含dhfr-甲氧苄啶-来那度胺-crbn的三元复合物的形成诱导的荧光素酶活性和随后的stat3信号传导活化。图5a-5c中的数据点表示相对于仅用瘦蛋白(ctrl)或瘦蛋白 杂合配体(crbn)处理的样品而言，来源于针对rem2对照用瘦蛋白 测试化合物(ctrl)处理的细胞或者用瘦蛋白 杂合配体 测试化合物(crbn)处理的细胞的一式三份样品的平均荧光素酶活性(这两种情况在不添加测试化合物的情况下获得的信号在y轴上被设置为100％的荧光素酶活性)。误差棒表示标准偏差。使用graphpad prism软件中的4参数非线性回归来拟合曲线。如图5a-5c所示，已知的imid化合物，例如来那度胺和cc220以剂量依赖性方式特异性地抑制杂合配体诱导的荧光素酶报告基因活化。这反映了与crbn结合的有效竞争以及对杂合配体与crbn结合的阻止(因此对测定信号的抑制)。
141.图5d-5g和图5h-5l解决了以下问题：在图5a-5c中被表征为有效结合至细胞中的crbn的任何测试化合物是否可以充当分子胶以及是否起到诱导ass1或ikzf1向crbn的募集的作用。为进行该分析，将hek293t细胞在补充有10％胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基中培养，在37℃、8％co2下温育。用编码crbn诱饵的质粒转染细胞，该crbn诱饵与瘦蛋白受体的胞质结构域融合，该瘦蛋白受体本身与促红细胞生成素(epo)受体的胞外结构域融合(psel-crbn)。该胞外epo受体结构域可以与胞外瘦蛋白受体结构域互换使用(如图5a-5c中所用)，以促进受体/受体相关的jak2活化(分别与epo或瘦蛋白一起)。此外，用编码融合至gp130胞质结构域的ikzf1(同种型7)的质粒(pmg1-ikzf1(iso7))或编码融合至gp130的胞质结构域的ass1的质粒(pmg1-ass1)和编码stat3反应性荧光素酶的报告基因质粒(pxp2d2-rpapi-荧光素酶报告基因质粒)来转染细胞，如文献所述(lievens等人"array mappit:high-throughput interactome analysis in mammalian cells."journal of proteome research 8.2(2009):877-886)所述。在转染后24小时，在不存在或存在指定剂量的测试化合物的情况下，用促红细胞生成素(epo)处理细胞。在测试化合物处理后24小时，使用具有ensight读板器(perkin elmer life sciences,waltham,ma)的荧光素酶测定系统试剂盒(promega,madison,wi)测量荧光素酶活性。数据点描绘了来自epo 测试化合物处理的细胞与仅epo处理的细胞的一式三份样品的平均荧光素酶活性的倍数诱导。误差棒表示标准偏差。使用graphpad prism软件中的4参数非线性回归来拟合曲线。如图5d-5g和图5h-5l所示，我们可以鉴定出虽然与crbn有效结合，但与已知imid(包括来那度胺和cc220)相比不诱导ass1的募集的化合物。
142.表1汇总了图5a-5l的结果。指示出了化合物与crbn结合的效力/效率，其被计算为来自图5a-5c中的竞争分析的ic50(剂量反应曲线)。还示出了对于ikzf1或ass1募集测试情况在任何剂量下实现的最大荧光素酶报告基因诱导。化合物“v”和“vi”是与len同样有效的crbn结合剂，在高达30微摩尔的浓度下不会募集ass1(或ikzf1)靶点。如所示的，可以观察到不同的募集模式，并且在针对具有被拨出的靶点募集倾向性的化合物的演变(即，ass1募集)的比较分析中选择性地监测ass1募集的缺陷。
143.表1
[0144][0145][0146]
实施例6：使用ddb1 mappit受体融合构建体进行的化合物诱导的crbn-ass1相互作用的检测
[0147]
由于使用crbn诱饵的未融合形式来测试化合物诱导的crbn-底物相互作用可能是有利的，我们开发了一种mappit衍生测定法，其中ddb1与mappit嵌合受体构建体而不是crbn融合。ddb1是一种衔接蛋白，可以将crbn连接至核心e3泛素连接酶复合物支架亚基cul4a或cul4b(库林蛋白(cullin)4a或库林蛋白4b)。用编码栓连至含有epo受体胞外结构域的mappit受体融合体的ddb1的质粒(psel-ddb1)、编码融合至部分gp130结构域的crbn底物蛋白的质粒(ikzf1异构体7或ass1)和编码stat3反应性荧光素酶的报告基因质粒(pxp2d2-rpapi-荧光素酶报告基因质粒)来转染hek293t细胞，如文献(lievens等人"array mappit:high-throughput interactome analysis in mammalian cells."journal of proteome research 8.2(2009):877-886)所述。此外，还用不同量的未融合的crbn表达构建体来共转染细胞。在转染后24小时，在不存在或存在指示剂量的来那度胺(len)的情况下，用epo处理细胞。在测试化合物处理后24小时，使用具有ensight读板器(perkin elmer life sciences,waltham,ma)的荧光素酶测定系统试剂盒(promega,madison,wi)测量荧光素酶活性。数据点描绘了来自epo 测试化合物处理的细胞与仅epo处理的细胞的一式三份样品的平均荧光素酶活性的倍数诱导。误差棒表示标准偏差。如图6所示，ikzf1和ass1相互作用均获得稳健的来那度胺依赖性mappit信号，但是仅在存在共表达的未融合的crbn的情况下才如此，这表明信号由底物gp130融合蛋白与crbn的结合介导。
[0148]
等效方案
[0149]
尽管已经结合其具体的实施方案描述本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本技术旨在涵盖大体上符合本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征中的任何变型、用途或者变更。
[0150]
本领域技术人员将会认识到或将能够确定仅使用至多常规实验，就能实现本文具体描述的具体实施方案的许多等效物。此类等效方案意图涵盖在所附权利要求书的范围内。
[0151]
以引用的方式并入
[0152]
本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。
[0153]
本文所讨论的出版物仅为其在本技术的申请日之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。
[0154]
如本文所用的所有标题仅用于组织且无意以任何方式限制本公开。任何单个部分的内容可以同样适用于所有部分。