一种过表达融合蛋白PTGFRN-GLP-1工程化外泌体的制备方法及其应用与流程

一种过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.glp-1为胰高血糖素样蛋白1，是由肠道内分泌细胞分泌的一种降血糖类激素，是肠促胰素的一种。研究表明其可以降低2型糖尿病受试者的血糖浓度，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空等作用。2型糖尿病主要表现为β细胞产生的胰岛素减少，而α细胞产生的胰高血糖素升高，因此glp-1成为治疗2型糖尿病的重要靶点。虽然glp-1的用药安全性高，但是天然glp-1在体内不稳定，半衰期短，注射至血液中仅几分钟就被降解，因此人们对glp-1的结构进行修饰，产生了很多glp-1类似物药物，如利拉鲁肽等，可以延长半衰期并且达到降血糖的效果。尽管利拉鲁肽的半衰期较长，但是也需要每天注射，并价格昂贵，存在一定的副作用。因此找到长效的glp-1药物，并降低其副作用，仍然是目前需要解决的问题。
3.外泌体（exsomo）是细胞分泌的一种胞外小泡，是直径为30-150nm的膜结构，由天然的蛋白质和脂质组成，在体内可以由多种类型的细胞分泌，并可以通过体液等方式的运输，到达靶细胞区域，从而影响靶细胞的生存、信号传递、增殖和凋亡等多种生理活动。由于外泌体本身的很多特点，目前已经尝试被运用到疾病的诊断和治疗中。
4.中国专利申请cn114644717a公开了一种重组人胰高糖素样肽-1及其构建方法和应用，将glp-1与arp通过连接蛋白（linker）连接组成重组蛋白，置于大肠杆菌原核系统中表达，该种方法获得的重组glp-1虽然提高了glp-1的稳定性，延长了半衰期，但是这种方法破坏了glp-1的天然蛋白结构，容易降低天然glp-1本身的治疗效果。
5.中国专利cn101044162b公开了一种glp-1 类似物融合蛋白质制剂，所述稳定溶液制剂包含glp-1-fc融合体，ph在约ph6至约ph8.5之间，是特定igg4-fc衍生物融合的类似物，当与ph在上述范围之外的glp-1-fc融合体相比时，这些制剂具有相当高的化学稳定性，可用于疗糖尿病、肥胖、肠易激综合征等，但是这种制剂需在特定ph范围内才能达到稳定性高的效果，本身增加了制剂的制备难度，而且，这种制剂同样破坏了glp-1的天然结构，容易影响治疗效果。
6.综上可知，现有技术中仍无法解决天然glp-1体内稳定性差、易被降解等问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术普遍存在的问题，本发明提供了一种过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法及其应用。本发明提供的融合蛋白在发挥天然glp-1作用的同时，还解决了天然glp-1体内不稳定等问题。
8.为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法，包括如下过程：s1、将表达目的蛋白glp-1和ptgfrn的目的基因连接在pcdna3.1质粒上，构建pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体；s2、将步骤s1所得pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体转入dh5α大肠杆菌感受态中，提取质粒，然后将提取的质粒转染入干细胞中转染48h后，收集培养细胞的上清液，获得条件培养基；s3、去除步骤s2所得条件培养基中的细胞碎片和凋亡小体，进一步浓缩、纯化、鉴定即得。
9.优选地，步骤s1所述pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体的具体构建过程为：（1）将glp-1与ptgfrn片段通过基因合成，并导入t-vevtor载体中，获得t-vector-ptgfrn-glp-1载体；（2）用bamhi和ecori将步骤（1）所得t-vector-ptgfrn-glp-1载体和pcdna3.1质粒分别进行双酶切，酶切产物17℃进行酶连，获得酶连产物；（3）将步骤（2）所得酶连产物进行凝胶回收，即得。
10.优选地，步骤（1）中所述glp-1基因片段的基因库序号为kc404695.1；所述ptgfrn基因片段的基因库序号为nm_020440.4。
11.优选地，步骤s2中所述干细胞在转染前用干细胞完全培养基培养至细胞汇合度达到70-80%时转染。
12.优选地，步骤s2所述干细胞为人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、hek293t细胞中的一种。
13.优选地，步骤s2所述转染方法为电穿孔法、慢病毒感染、脂质体转染中的一种。
14.优选地，步骤s3所述浓缩、纯化过程采用切向流技术，具体操作过程如下：（1）连接中空纤维装置，设置流速为70ml/min，用0.22μm过滤的纯净水冲洗柱子至滤出端ph为中性，再用pbs冲洗5min；（2）上样品：将需要浓缩纯化的外泌体溶液通过中空纤维，设置流速为70ml/min，跨膜压为1.5 psi；（3）当样品浓缩至50ml时，改为循环模式，用pbs替换培养基，当培养基完全替换为pbs溶液时，停止循环；（4）中空纤维柱子用0.22μm过滤的纯净水冲洗20min，再用0.5m naoh溶液冲洗5min，用200nm孔径的过滤器进行过滤，去掉直径大于200nm的囊泡，过滤后的溶液为外泌体溶液。
15.（5）最后用0.22μm滤膜对步骤（4）获得的外泌体溶液进行过滤，得到无菌外泌体溶液。
16.本发明还提供了一种所述方法制得的过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体。
17.本发明还提供了一种所述过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体在制备治疗2型糖尿病、肥胖症药物中的应用。
18.优选地，所述药物还包括药学上常用的辅料。
19.ptgfrn为表达在外泌体膜上的一个支架蛋白，本研究将天然的glp-1与外泌体支
架蛋白ptgfrn连接构成融合蛋白，通过过表达的方式将其表达在外泌体膜结构上，通过外泌体的扩散作用将glp-1分子传递至胰岛β细胞等靶细胞，进而发挥治疗作用。经过此方法构建的exo-glp-1（即过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体），发挥治疗作用的是天然glp-1结构，且治疗效果较持久，极有可能降低glp-1类似物药物的副作用和治疗成本，同时发挥更好的治疗效果。而且，进一步研究发现，本发明中的ptgfrn可替换为lamp2b等外泌体膜支架蛋白。
20.与现有技术相比，本发明提供的过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的优势为：解决了天然glp-1体内不稳定的问题，且外泌体的治疗效果较持久；实现了使用天然glp-1给药治疗2型糖尿病，提高了治疗效果。
附图说明
21.图1为流式细胞术检测cd73、cd90、cd105阳性表达结果；图2为流式细胞术检测cd45、cd34、cd11b、hla阴性表达结果；图3为工程化改造前后外泌体粒径对比结果；图4为工程化改造前后外泌体对cd9、cd81、cd63、calnexin蛋白的表达情况；图5为不同饲养组小鼠体重变化情况；图6为不同饲养组小鼠饥饿血糖对比；图7为正常喂养组小鼠葡萄糖耐受实验结果；图8为高脂喂养组小鼠葡萄糖耐受实验结果；图9为第14周和第三次治疗结束后小鼠饥饿血糖检测结果。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
23.实施例一种过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法所述过表达融合蛋白ptgfrn-glp-1工程化外泌体的制备方法，包括如下过程：s1、将表达目的蛋白glp-1和ptgfrn的目的基因连接在pcdna3.1质粒上，构建pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体；具体构建过程为：（1）glp-1与ptgfrn片段通过基因合成公司合成，并导入t-vevtor载体中，获得t-vector-ptgfrn-glp-1载体；（2）用bamhi和ecori将步骤s1所得t-vector-ptgfrn-glp-1载体和pcdna3.1质粒分别进行双酶切，酶切产物17℃进行酶连，具体酶切体系如表1所示，酶连体系如表2所示；表1酶切体系（37℃，3h）
表2酶连体系（17℃，1.5h）（3）酶连产物进行凝胶回收，得到重组质粒pcdna3.1-ptgfrn-glp-1（即pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体）。
24.s2、将步骤s1所得pcdna3.1-ptgfrn-glp-1融合表达载体转入dh5α大肠杆菌感受态中，提取质粒，然后将提取的质粒转染入干细胞中转染48h后，收集培养细胞的上清液，获得条件培养基；根据常规质粒转化步骤将构建的重组质粒转入dh5α大肠杆菌感受态中，第二天挑取单菌落，接种在5ml lb培养基中，37℃，220rpm进行扩增培养。12h后，将菌液接种在200ml lb培养基中，37℃，220rpm进行第二次扩增培养。12h后，用质粒提取试剂盒（invitrogen
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，purelink
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快速低内毒素中量质粒纯化试剂盒），按照说明书进行质粒提取；测量提取后质粒的浓度，并用0.22μm滤膜过滤除菌，备用；转染干细胞以脐带间充质干细胞为例，培养过程如下（为了节约时间，一般先培养细胞，再进行融合表达载体构建过程）：（1）准备实验物品：将生物安全柜用酒精擦拭，准备已灭菌的器械：培养皿、0.9%氯化钠注射液、50ml离心管、记号笔、止血钳、培养瓶、酒精棉球等；（2）从脐带中剥取华通氏胶，将剥取的华通氏胶剪碎后，加入生理盐水混匀，于1200rpm转速下离心15min，去除上清，得到组织块；（3）称取组织块重量，向组织块中加入配制好的干细胞完全培养基，得到组织块悬液，并调整浓度为1.0g/ml；每1ml配制好的干细胞完全培养基（下同）中的组分及其含量如下表3所示：表3 干细胞完全培养基组成（4）将得到的组织块悬液接种在t75培养瓶中，每个培养瓶中加入1ml组织块悬液，并加入10ml干细胞完全培养基，放入37℃，5%co2培养箱进行培养；（5）当细胞汇合度达到85%时，用浓度为1.5g/l的胰酶进行消化，收集终止消化后的细胞，得到p0代细胞；（6）将消化得到的p0代细胞接种至t75培养瓶（t75培养瓶培养面积是75cm2,10cm皿培养面积是55cm2，分别是培养瓶和培养皿两种不同的培养器皿）中，接种密度为3000-7000个/cm2，加入10ml干细胞完全培养基继续培养（培养至10cm培养皿中脐带间充质干细
胞汇合度达到70-80%时停止），得到人脐带间充质干细胞。
25.将提取的质粒采用电穿孔法转染入干细胞中，具体过程为：（1）当细胞汇合度达到75%时，去掉细胞上清液，用pbs清洗一次细胞，加入胰酶，37℃消化1min，用干细胞完全培养基终止消化，400g，5min离心，离心结束后，取105个细胞，加入0.5ml电转液（nuwacell
®
，hipsc/hesc高效电转液）重悬，吹打均匀，加入电转杯中，获得细胞悬液；（2）向细胞悬液中加入10μg提取的质粒，混合均匀，设置电转参数为230v，15ms；（3）电转完成后，将电转杯置于37℃培养箱中20min，20min后将电转杯中的细胞悬液接种于预热的干细胞完全培养基中，进行培养；（4）培养6h后，给细胞更换10ml新鲜的干细胞完全培养基，继续培养；（5）培养48h后，收集培养细胞的上清液，即条件培养基。
26.s3、去除步骤s2所得条件培养基中的细胞碎片和凋亡小体，进一步浓缩、纯化、鉴定即得。
27.1、细胞碎片和凋亡小体去除将收集的条件培养基2000
×
g，20min进行离心，去除培养基中的细胞碎片和凋亡小体，离心结束后小心收集上清液。
28.2、去掉直径大于100 nm的刚性颗粒：利用低蛋白结合特性，孔径为0.1-μm millipore express (pes) 膜对收集的上清液进行过滤，过滤结束后，用50ml pbs冲洗滤膜，有利于提高外泌体产量。
29.3、使用切向流技术对外泌体进行浓缩和纯化：（1）连接中空纤维（500kd）装置，设置流速为70ml/min，用0.22μm过滤的纯净水冲洗柱子至滤出端ph为中性，再用pbs冲洗5min。
30.（2）上样品：将需要浓缩纯化的外泌体溶液通过中空纤维，设置流速为70ml/min，跨膜压为1.5 psi；（3）当样品浓缩至50ml时，改为循环模式，用pbs替换培养基，当培养基完全替换为pbs溶液时，停止循环；（4）中空纤维柱子用0.22μm过滤的纯净水冲洗20min，再用0.5m naoh溶液冲洗5min，对浓缩后的外泌体，用200nm孔径的过滤器进行过滤，去掉直径大于200nm的囊泡，过滤后的溶液为外泌体溶液；（5）最后用0.22μm滤膜对外泌体溶液进行过滤，得到无菌外泌体溶液。
31.4、鉴定：生产外泌体所用msc鉴定：用流式细胞术检测cd73、cd90、cd105、cd45、cd34、 cd11b、hla等因子的表达情况，结果如图1、图2所示，图1表明，cd73、cd90、cd105表达量高（分别为1000%、99.99%），说明这3种因子在mec中呈阳性表达，而图2表明cd45、cd34、 cd11b、hla表达量较低（分别为0、0.01%、0.04%、0），说明这4种因子在msc中呈阴性表达。
32.外泌体粒径鉴定：用nanosight等粒径测量工具测量外泌体的粒径为30-150nm，且工程化的外泌体与未进行工程化的外泌体相比较，对比结果如图3所示，说明工程化前后外泌体粒径变化不大。
33.然后设置对照细胞组（ucmsc）、已转染细胞组（转染后ucmsc）、对照外泌体组
（exo）、已转染外泌体组（exo-glp-1）（前两组是细胞，后两组是外泌体）等，利用wb检测蛋白cd9、cd63、cd81、calnexin的表达情况，具体检测结果如图4所示，图4显示，这四组中cd9、cd63、cd81均为阳性表达，两个细胞组中calnexin阳性表达，两个外泌体组中calnexin阴性表达。
34.试验例工程化外泌体活性验证1.构建糖尿病小鼠模型：对小鼠进行高脂饮食喂养14周，检测到小鼠体重明显增加，且饥饿时小鼠血糖水平高于正常饲养小鼠血糖（图5、图6）。如图可知，高脂喂养组的小鼠体重增加较快，且饥饿状态下血糖浓度较高，因此初步判断糖尿病小鼠模型造模成功。
35.2.将正常饲养组小鼠和高脂饲养组小鼠分别设置pbs对照组、未工程化外泌体组（ucmsc-exo）、工程化外泌体组（ucmsc-exo-glp-1）、二甲双胍阳性对照组，腹腔注射至糖尿病模型小鼠体内，分别在小鼠饲养的第14、16、18周进行3次注射，外泌体注射剂量为：4μg/g。
36.3.在第14周和第三次治疗结束后4周分别对小鼠进行葡萄糖耐受实验(intraperitoneal glucose tolerance test，ipgtt)：在实验开始之前，对小鼠进行6h的饥饿处理。饥饿处理后，取小鼠静脉血，测得t0时血糖浓度。随后分别在注射葡萄糖30、60、90、120min时检测血糖浓度。注射的葡萄糖剂量为3mg/kg。糖耐检测结果如图7、图8，其中ncd（normocaloric）为正常喂养组小鼠，hfd(high fat diet)为高脂喂养组小鼠。如图7可知，在正常喂养组小鼠中，与对照组相比，各组对小鼠的葡萄糖耐受无明显影响，表明工程化的外泌体对正常小鼠血糖的平衡无明显影响；如图8可知，治疗4周后，工程化外泌体组的糖耐水平恢复最好，即治疗效果最显著。
37.4.在第14周和第三次治疗结束后，每隔3天对小鼠进行饥饿血糖的检测，并与对照组小鼠相比，观察工程化外泌体治疗作用的持续时间。结果如图9所示，由图可知，三次工程化外泌体治疗结束后，小鼠饥饿血糖均保持较低水平，表明工程化外泌体治疗效果至少可持续27天。
38.最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。