一种可用于肿瘤早期诊断的磁纳米传感器的制备方法及应用

1.本发明属于材料化学领域，涉及一种可用于肿瘤早期诊断的磁性纳米传感器，具体涉及一种可用于循环肿瘤细胞分析和肿瘤核磁/荧光双模态成像的磁纳米传感器的制备方法及应用。


背景技术：

2.如何在早期进行癌症的诊断和治疗是预防癌症的主要手段。目前，临床上主要通过影像技术结合组织活检来进行癌症的诊断。然而，主流成像技术如磁共振成像mri通常灵敏度低，无法识别小的良性/恶性肿瘤病灶，对癌症早期的诊断意义不大。而且，造影剂的非靶向积聚，往往会出现假阳性的影像结果，影响临床医生对肿瘤的精准诊断。因此，如何提高现有影像技术对于肿瘤组织成像的靶向性和灵敏性，是改善临床肿瘤诊断面临的主要问题。
3.近年来，由于合成的简易性和特殊靶向性，基于荧光猝灭-恢复机制的生物传感器在癌症检测研究方面表现出极大的潜力。然而，由于猝灭剂和荧光基团之间不匹配的相互作用，它们的灵敏度经常受到影响。此外，由于不稳定性和非靶向性的递送，这些生物传感器很少实现准确的活体荧光成像。同时，组织活检作为一种被认可的准确的癌症检测方法，由于其侵袭性和患者的耐受性较差，在临床中的广泛应用受到阻碍。因此，增加造影剂的靶向递送以避免其非特异性蓄积，调节生物传感相互作用来提高其成像灵敏性，仍是癌症检测和成像研究面临的难题。
4.新兴的液体活检术因其无侵袭性和明显的临床意义而引起人们的关注。然而，复杂血液环境下循环肿瘤细胞稀缺，不易被检测仪器捕获、纯化和检测，极大地阻碍了液体活检研究的进行。而且，目前肿瘤成像和活检是通过不同的平台和探针来实现，明显增加了检测的复杂性和成本，影响了结果的一致性。因此，如何将循环肿瘤细胞的捕获、检测和释放以及肿瘤的精准成像整合到一个监测体系中，是科研工作者需要解决的问题。
5.因此，在本发明中，以磁性纳米粒为基础，通过对其表面进行硅碳掺杂和配体修饰，构建了一种新型的磁纳米传感器fsc-d-p0，可以与肿瘤表面的muc1蛋白结合，完成肿瘤细胞的捕获，在硅碳掺杂纳米层sio2/c与细胞的相互作用下，恢复荧光，实现循环肿瘤细胞的可视化。然后，在外加磁场的作用下，完成肿瘤细胞的富集，在内切酶ecor1的作用下，释放已捕获的循环肿瘤细胞。同时，基于磁纳米粒和适配体的主动靶向性，特异性荧光恢复以及mri成像，fsc-d-p0可以避免磁纳米粒在组织非靶向性蓄积导致的假阳性。fsc-d-p0将循环肿瘤细胞的捕获、检测和释放与肿瘤核磁/荧光双模态成像结合在一个平台上，实现了体内外多方位的肿瘤诊断，在临床肿瘤诊疗方面显现出巨大的应用潜力。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有临床上肿瘤检测的不足，提供一种可用于肿瘤早期诊断的磁纳米传感器。具体涉及一种可用于循环肿瘤细胞分析和肿瘤核磁/荧光双模态成像的
磁纳米传感器的制备方法及应用，包括如下反应步骤：
7.步骤(1)：以三价铁化合物如fecl3·
6h2o为原料，二甘醇和乙二醇为反应介质进行磁性纳米粒fe3o4的制备；
8.步骤(2)：以间苯二酚、甲醛和四丙氧基甲烷为原料进行磁性纳米粒fe3o4的表面硅化，制备硅基化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/p，fe3o4与间苯二酚的质量比100:1～30:1，fe3o4与甲醛的质量比100:1～40:1，fe3o4与四丙氧基甲烷的质量比100:1～20:1；
9.步骤(3)：通过氮气氛围下高温高压反应，对步骤(2)中fe3o4@sio2/p进行碳化，得到碳化磁性纳米粒fe3o4@sio2/c，反应温度在500℃以上，反应时间不低于4h；
10.步骤(4)：通过氧化剂完成碳化磁性纳米粒fe3o4@sio2/c的表面氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc，可用的氧化剂包括双氧水和高锰酸钾在内的强氧化剂；
11.步骤(5)：以步骤(4)中的fsc为基础，通过ssdna1和ssdna2-p0的表面修饰，制备磁纳米传感器fsc-d-p0，适配体d-p0与fsc的比例(nmol/mg)为0.1:1～0.8:1；
12.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，可以与肿瘤表面的muc1蛋白结合，完成肿瘤细胞的捕获，在硅碳掺杂纳米层sio2/c与细胞的相互作用下，肿瘤细胞表面荧光恢复，实现循环肿瘤细胞的可视化。然后，在外加磁场的介导下，完成荧光标记肿瘤细胞的富集。同时，在不影响细胞活力的情况下，通过内切酶ecor1的作用，释放已捕获的循环肿瘤细胞。同时，基于磁纳米粒和适配体的主动靶向性，特异性荧光恢复以及核磁荧光双模态成像，fsc-d-p0可以避免磁纳米粒在组织非靶向性蓄积导致的mri假阳性，从而实现精准的肿瘤成像。
13.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其fe3o4的前驱体为可以提供三价铁的化合物。
14.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其用于硅碳掺杂纳米层sio2/c氧化的试剂包括但不限于双氧水和高锰酸钾在内的强氧化剂。
15.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其用于硅碳掺杂纳米层sio2/c碳化的反应温度在500℃以上，反应时间不低于4h。
16.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其cy5的荧光猝灭和恢复主要由硅碳掺杂纳米层sio2/c控制。
17.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其可以实现循环肿瘤细胞的捕获、富集以及内切酶ecor1的响应释放，并且该过程不影响循环肿瘤细胞的活力。
18.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其可以通过核磁mri和荧光fl双模态的成像模式，实现对肿瘤组织的精准成像，避免诊断中假阳性的出现。
19.本发明提供的磁纳米传感器fsc-d-p0，其所应用的对象包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、眼科肿瘤等表达muc1蛋白的肿瘤。
附图说明：
20.图1：fsc的tem图像(bar＝100nm)。
21.图2：fsc-d-p0的stem图像。
22.图3：fsc-d-p0和中间体(fe3o4、fe3o4@sio2/c和fsc)的红外光谱分析。
23.图4：fsc和fsc-d-p0的t2弛豫率(a)和t2-mri图像(b)及磁干扰前后fsc-d-p0分散性图像(c)
24.图5：fsc@d-p0,fsc(-si)@d-p0和fsc(-c)@d-p0的荧光图谱及时间依赖性的细胞摄取行为。插图：fsc,fsc(-si)和fsc(-c)的水溶液图像。
25.图6：fsc@d-p0在mcf-7和mcf-10a的时间依赖性荧光恢复图像。
26.图7：fsc@d-p0在panc-1和hpde6c7的时间依赖性荧光恢复图像。
27.图8：fsc-d-p0与不同浓度的mcf-7细胞分别共孵育于(a)pbs，(b)含4％血清的pbs以及(c)血液中的荧光图谱和(d)荧光稳定性评价。插图：细胞数与荧光强度之间的线性回归方程。
28.图9：不同孵育时间下fsc-d-p0的细胞捕获效率。
29.图10：fsc-d-p0与细胞作用过程图像及释放细胞的live/dead活力评价。
30.图11：fsc-d-p0与荷瘤小鼠和正常小鼠血液孵育后的荧光图谱。插图：通过血液中细胞数量与荧光强度之间的线性回归方程计算出的fsc-d-p0可检测循环肿瘤细胞数。
31.图12：在不同干预条件下，荷瘤小鼠的t2-mri图像(6h给药后)和在体和离体荧光图像(10h给药后)。
32.图13：mcf-7和mcf-10a细胞与不同浓度的fsc-d-p0孵育2h后的cck-8细胞活力评价。
具体实施方式
33.实施例1
34.0.6g fecl3·
6h2o，1.5gnaac，1.5g丙烯酸钠与5ml二甘醇和15ml的乙二醇混合，加热搅拌30min后，转移到高压釜反应(200℃/10h)，乙醇和水交替清洗后，得到磁性纳米粒fe3o4。
35.实施例2
36.0.8g fecl3·
6h2o，1.5gnaac，1.5g丙烯酸钠与5ml二甘醇和15ml的乙二醇混合，加热搅拌30min后，转移到高压釜反应(200℃/10h)，乙醇和水交替清洗后，得到磁性纳米粒fe3o4。
37.实施例3
38.1g fecl3·
6h2o，1.5gnaac，1.5g丙烯酸钠与5ml二甘醇和15ml的乙二醇混合，加热搅拌30min后，转移到高压釜反应(200℃/8h)，乙醇和水交替清洗后，得到磁性纳米粒fe3o4。
39.实施例4
40.1.2g fecl3·
6h2o，1.5gnaac，1.5g丙烯酸钠与5ml二甘醇和15ml的乙二醇混合，加热搅拌30min后，转移到高压釜反应(200℃/8h)，乙醇和水交替清洗后，得到磁性纳米粒fe3o4。
41.实施例5
42.1.4g fecl3·
6h2o，1.5g naac，1.5g丙烯酸钠与5ml二甘醇和15ml的乙二醇混合，加热搅拌30min后，转移到高压釜反应(200℃/8h)，乙醇和水交替清洗后，得到磁性纳米粒fe3o4。
43.实施例6
44.实施例1制备的fe3o480 mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与1mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米
粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
45.实施例7
46.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与1mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
47.实施例8
48.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与1mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
49.实施例9
50.实施例1制备的fe3o480 mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与1mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
51.实施例10
52.实施例1制备的fe3o480 mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与1.5mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
53.实施例11
54.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与1.5mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
55.实施例12
56.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与1.5mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
57.实施例13
58.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与1.5mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
59.实施例14
60.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与2mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
61.实施例15
62.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与2mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
63.实施例16
64.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与2mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
65.实施例17
66.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与2mg甲醛和1mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
67.实施例18
68.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与1mg甲醛和1.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
69.实施例19
70.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与1mg甲醛和1.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性
纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
71.实施例20
72.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与1mg甲醛和1.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
73.实施例21
74.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与1mg甲醛和1.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
75.实施例22
76.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与1.5mg甲醛和2mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
77.实施例23
78.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与1.5mg甲醛和2mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
79.实施例24
80.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与1.5mg甲醛和2mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
81.实施例25
82.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与1.5mg甲醛和2mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
83.实施例26
84.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1mg间苯二酚与2mg甲醛和2.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
85.实施例27
86.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将1.5mg间苯二酚与2mg甲醛和2.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
87.实施例28
88.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2mg间苯二酚与2mg甲醛和2.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
89.实施例29
90.实施例1制备的fe3o480mg加入到70ml的乙醇、10ml水和3ml的氨水中，超声分散完全后，将2.5mg间苯二酚与2mg甲醛和2.5mg的四丙氧基甲烷混合反应24h，得到硅基化磁性纳米粒fe3o4@sio2/p。然后，将fe3o4@sio2/p在氮气氛围下，700℃煅烧5h得到碳化的磁性纳米粒fe3o4@sio2/c。进一步，通过10％过氧化氢对fe3o4@sio2/c进行氧化，得到表面可修饰的磁性纳米粒fsc。
91.实施例30
92.将同摩尔ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.14)，25℃条件下连续反应过夜，通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
93.实施例31
94.将同摩尔ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.28)，25℃条件下连续反应过夜，通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
95.实施例32
96.将同摩尔ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重
悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.56)，25℃条件下连续反应过夜，通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
97.实施例33
98.将同摩尔ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.84)，25℃条件下连续反应过夜，通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
99.实施例34
100.将同质量ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.14)，25℃条件下连续反应过夜，通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
101.实施例35
102.将同质量ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.28)，25℃条件下连续反应过夜。通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
103.实施例36
104.将同质量ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.56)，25℃条件下连续反应过夜。通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
105.实施例37
106.将同质量ssdna1和ssdna2-p0与ste缓冲液混合，95℃油浴加热5min，自由冷却至室内温度形成双链dna(double-stranded dna，dsdna，d-p0)。同时，将实施例6制备的fsc重悬于2.5mg/ml超纯水中，调整ph至6.0。在加入edc和nhs后，介质在25℃下被旋涡混合30min后被激活。然后，加入d-p0(d-p0:fscnmol/mg＝0.84)，25℃条件下连续反应过夜。通过多次磁富集纯化产物fsc-d-p0。
107.实施例38
108.通过tem观察实施例30所制备的fsc-d-p0，结果显示该纳米粒由性质不同的材料组成，具有核壳结构，尺寸均一，粒径在200nm左右，请见附图1。
109.实施例39
110.通过stem观察实施例30所制备的fsc-d-p0，结果显示该纳米粒的组成元素包括铁、硅、氧、碳和磷。其中，铁元素位于核层，其他元素分布于壳层，表明该纳米粒由fe3o4核和
硅碳掺杂的壳结构组成，并且表明成功修饰d-p0，请见附图2。
111.实施例40
112.通过ftir对实施例1制备的fe3o4，实施例6制备的fsc和fe3o4@sio2/c以及实施例30所制备的fsc-d-p0的成键形式进行对比研究，结果显示双氧水的氧化作用，为fsc表面提供了可修饰基团(-cooh和-oh)。然后，通过-cooh和-nh2的反应(v
n-h 3135cm-1
,δ
n-h 1650-1250cm-1
和v
c-n 1310-1200cm-1
等新键形成)，cy5标记的双链dna修饰的p0适配体(d-p0)成功修饰于fsc表面，得到fsc-d-p0，请见附图3。
113.实施例41
114.通过核磁共振扫描仪考察实施例30所制备fsc-d-p0的t2成像特性。结果显示，由于d-p0的修饰，fsc-d-p0的水分散性和稳定性得到明显改善，具有较高的纵向弛豫率(r1＝104.18mm-1
s-1
)进而介导分辨率较高的t2核磁成像。同时，fsc-d-p0具有较强的磁靶向特性，在外加磁场的诱导下，可以在短时间完成富集，请见附图4。
115.实施例42
116.通过荧光光谱仪和细胞水平的荧光恢复对比硅碳掺杂的fsc和非共价连接的纳米载体fsc(-si)和fsc(-c)的荧光恢复特性。结果显示，纯碳结构的fsc(-si)@d-p0对d-p0完全吸附，cy5荧光全淬灭，而纯硅结构的fsc(-c)@d-p0对d-p0相互作用弱，cy5几乎没有淬灭现象。而fsc@d-p0中，复合sio2掺杂c的结构使得fsc与荧光适配体具有较好的相互作用，可以适当的控制cy5的荧光淬灭和恢复，进而随着孵育时间的延长，点亮肿瘤细胞，请见附图5。
117.实施例43
118.通过荧光成像，以胰腺癌细胞和乳腺癌细胞为模型，考察fsc-d-p0的荧光成像特性。结果显示，由于适体介导的肿瘤细胞靶向特性和荧光猝灭恢复的生物传感特性，随着共孵育时间的增加，fsc-d-p0的cy5荧光可以逐渐恢复mcf-7肿瘤细胞的成像，而正常细胞的荧光继续猝灭。而且，这种荧光恢复特性适用于所有高表达muc1的肿瘤细胞，请见附图6和附图7。
119.实施例44
120.通过荧光光谱分析，以乳腺癌细胞为模型，考察fsc-d-p0对循环肿瘤细胞的捕获和荧光恢复特性。结果显示，fsc-d-p0在不同介质中均可以捕获肿瘤细胞并完成荧光的恢复。而且，即使在细胞数极少的介质中，捕获的肿瘤细胞数与荧光值之间均具有良好的线性相关。同时，细胞表面的荧光恢复稳定性较好，可以实现肿瘤细胞精准稳定的捕获，请见附图8。
121.实施例44
122.通过荧光光谱分析，以乳腺癌细胞为模型，考察fsc-d-p0对肿瘤细胞的捕获效率。结果显示，在共孵育30min后，fsc-d-p0能完成90％以上肿瘤细胞的捕获，请见附图9。
123.实施例45
124.通过tem和live/dead介导的细胞活力探针对fsc-d-p0荧光铺获的细胞过程进行研究。结果显示，在p0适配体的介导下，fsc-d-p0可以特异性吸附于肿瘤细胞表面，进而在磁场的作用下，完成对肿瘤细胞的富集。然后，在ecor1引物酶的作用下，在不影响细胞活力的情况下，释放捕获的肿瘤细胞，请见附图10。
125.实施例46
126.通过荧光光谱分析，以荷不同生长周期乳腺癌的小鼠为模型，考察fsc-d-p0对循环肿瘤细胞的捕获特征率。结果显示，fsc-d-p0检测ctc的特异性高，抗干扰能力强。对mcf-7荷瘤小鼠的血液中的ctc同样具有较为敏感的响应，而且荧光与ctc浓度和肿瘤生长天数成正相关，请见附图11。
127.实施例47
128.通过小动物活体成像和核磁共振成像，以荷瘤小鼠为模型，考察fsc-d-p0的双模态成像特性。结果显示，由于p0适配体介导的肿瘤靶向性和fe3o4介导的磁靶向特性，fsc-d-p0在注射后6h对肿瘤进行明显的t2成像。然后，在注射后10h，fsc-d-p0还可以介导肿瘤组织具有cy5荧光成像特性。在mri和荧光成像的结合下，避免了由于磁纳米粒蓄积的假阳性现象产生，提高肿瘤成像的特异性，请见附图12。
129.实施例48
130.通过cck-8，考察fsc-d-p0的生物安全性。结果显示，在与肿瘤细胞或正常细胞共孵育2h后，具有90％以上的细胞存活，表明fsc-d-p0毒性低，可以作为一种纳米载体用于肿瘤细胞的检测和成像，请见附图13。