一种巩膜钉用水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种巩膜钉用水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.视网膜血管疾病(rvd)是视力受损和失明的主要原因。它通常由异常血流引起的新生血管形成或视网膜损伤引起。在全球范围内，年龄相关性黄斑变性(amd)和糖尿病性视网膜病变(dr)是最常见的视网膜疾病，分别约有207万和769万患者。病理性血管生成是视网膜病变的主要原因，其能导致新生血管系统过度生长。这些未成熟的新生血管可能会渗出液，导致玻璃体出血、纤维化、牵引性视网膜脱离，最终导致视网膜损伤。因此，最大限度地减少异常血管生成对于rvd的治疗很重要。
3.临床上，一种广泛推荐的方法是向玻璃体内注射递送抗血管内皮生长因子(抗vegf药物)或类固醇(地塞米松等)。与滴眼液相比，这种递送方法可以将药物定位在眼组织的后段。最近研究证实抗vegf药物(如雷珠单抗、贝伐珠单抗和阿柏西普)能够改善视力并减轻副作用。然而，抗vegf药物在玻璃体内的半衰期短，需每月注射一次，可是重复性注射会给患者带来身体上的痛苦，并且更有可能诱发一种具有强破坏性的眼内炎症——无菌性眼内炎。
4.在过去的几十年里，已经证实各种工程策略(如纳米/微米药物载体、可注射水凝胶和载药植入物)可以延长药物在玻璃体内的释放时间，其中，载药植入物由于药物能在损伤眼组织处局部释放以及副作用少而受到广泛关注。retisert、iluvien、surodex、ozurdex、portdelivery system(pds)等植入式眼内给药装置正在接受fda审查或批准，由于上述植入式眼内给药装置的结构设计复杂且需要特定制造技术，在一定程度上限制了其应用。aungthan等报告了负载抗vegf药物和抗炎药(双氯芬酸)的一种可拆卸微针眼罩，动物模型试验证实该眼罩能使新生血管的新生面积减少约90％，但是该眼罩上的可拆卸微针容易造成角膜损伤，给患者带来身体和心理上的痛苦。
5.鉴于现有视网膜血管疾病(rvd)治疗方法存在的缺陷和局限性，有必要研究新的方法制备出新载药材料，使该载药材料具有较长的半衰期和较高的吸水膨胀，能在巩膜切口在损伤眼组织处局部释放和利用自身膨胀封堵手术切口，达到治疗眼内疾病，减少手术的繁琐性，降低感染几率的目的。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种巩膜钉用水凝胶的制备方法及其制备的巩膜钉用水凝胶。
7.为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明首先提供了一种巩膜钉用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将壳聚糖和多糖分别溶解在碱脲体系中，得到壳聚糖溶液和多糖溶液，将壳聚
糖溶液和多糖溶液按比例混匀，得到壳聚糖-多糖溶液；
10.(2)向步骤(1)制得的壳聚糖-多糖溶液中加入致孔剂，混匀，得到混合液，将混合液注入模具中，经冷冻、陈化处理，得到水凝胶；
11.(3)将步骤(2)制得的水凝胶置于水中再生，去除碱脲溶剂，然后冷冻定型，得到多孔海绵支架；
12.(4)将步骤(3)制得的多孔海绵支架浸泡于水高温蒸煮，去除多孔海绵支架中的多糖，然后冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架；
13.(5)将药物溶液加入到含聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂的水溶液中，混匀，得到混合溶液；采用喷涂或浸渍的方法将混合溶液负载到步骤(4)制备的多孔壳聚糖支架上，然后进行光照或辐射处理，冷冻干燥，得巩膜钉用水凝胶。
14.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(1)中所述壳聚糖的分子量为300000～1000000，所述壳聚糖溶液中壳聚糖浓度为3wt％。
15.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(1)中的多糖为水溶性多糖，多糖溶液中多糖浓度为3wt％。
16.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，所述水溶性多糖为琼脂糖，海藻糖，葡聚糖，透明质酸钠，魔芋糖中的至少一种。
17.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(1)中所述比例为重量比，所述重量比为壳聚糖溶液：多糖溶液＝100～50：0～50。
18.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(2)中的致孔剂为十水硫酸钠、无水硫酸钠、无水硫酸镁中的一种或多种。
19.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(2)中致孔剂的重量为壳聚糖-多糖溶液重量的0～50％。
20.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(2)中冷冻温度为-20℃～-80℃，陈化时间为24h～48h。
21.根据上述的巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(3)中再生时间为48h～72h。
22.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(3)中冷冻定型的温度为-40℃～-60℃，冷冻时间为48h～72h。
23.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(4)中去除多孔海绵支架中多糖的方法为高温蒸煮法。
24.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，所述高温蒸煮法的温度为90℃～100℃，蒸煮时间为6h～12h。
25.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(5)中的药物溶液是将药物溶于乙醇制成的，所述药物溶液中药物的浓度为5～30mg/ml。
26.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，所述药物为地塞米松、雷珠单抗、贝伐单抗、妥布霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、加替沙星、氟米龙、氯替泼诺、普拉洛芬、双氯芬酸钠、溴芬酸钠、布洛芬中的至少一种。
27.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，更加优选地，所述药物为地塞米松。
28.根据上述的巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(5)中聚乙二醇二丙烯酸酯
的分子量为200～1000。
29.根据上述的巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(5)混合溶液中聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度为20wt％～50wt％，混合溶液中光引发剂的浓度为0.01wt％～0.5wt％。
30.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(5)中的光引发剂为i2959、omnirad tpo、omnirad tpo-l、omnirad 184、omnirad 184d、darocur mbf、omniraddetx、omnirad 369、omnirad itx、igm 907中的至少一种。
31.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，更加优选地，所述光引发剂为i2959。
32.根据上述巩膜钉用水凝胶的制备方法，优选地，步骤(5)中光照为紫外光照射，紫外光的波长为365nm，强度为205mw/cm2，辐照时间为10min。
33.本发明还提供了一种利用上述的制备方法制备的巩膜钉用水凝胶。
34.本发明还提供了上述水凝胶在巩膜钉中的应用。
35.与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果：
36.(1)本发明是通过将多孔壳聚糖支架浸泡在含药物的聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂的水溶液中，经紫外光交联反应得到巩膜钉用水凝胶，该体系中引入致孔剂，使其形成孔道结构，继续引入水溶性多糖后，致孔剂与水溶性多糖共同作用，使水凝胶形成更多的孔道结构，并使部分孔结构由闭孔结构转为连通孔结构，孔洞结构比较致密，且孔与孔之间连通，孔隙率高，能有效降低药物的释药速率，延长药物在玻璃体内的半衰期，可以有效抑制炎症浓度以及创面细菌生长，并促进巩膜切口的愈合，为巩膜切口的愈合提供良好的环境，具有广阔的市场需求和推广应用价值。
37.(2)本发明制备的巩膜钉用水凝胶具有良好的吸水膨胀效果，制成巩膜钉插入巩膜切口时会吸收体液膨胀，堵塞巩膜切口，使巩膜钉能够承受房水压力，不易从巩膜切口处脱落，能为内眼手术术后提供良好的恢复环境。
38.(3)本发明是采用先冷冻、陈化处理，再生，之后直接冻干，最后高温蒸煮除去可溶性多糖，使水凝胶内形成连通孔结构后再次冻干的操作步骤制备壳聚糖支架，该操作步骤可以避免柱状结构在制备过程中发生变化，得到柱状多孔壳聚糖支架。
附图说明
39.图1不同琼脂糖和致孔剂含量的巩膜钉用水凝胶的扫描电镜图；
40.图2不同琼脂糖和致孔剂含量的巩膜钉用水凝胶的孔隙率；
41.图3不同琼脂糖和致孔剂含量的巩膜钉用水凝胶的细胞存活率；
42.图4巩膜钉用水凝胶(a30-30)的活-死细胞荧光染色；
43.图5不同琼脂糖和致孔剂含量的巩膜钉用水凝胶的压缩强度；
44.图6不同琼脂糖和致孔剂含量的巩膜钉用水凝胶的抑菌性能；
45.图7巩膜钉用水凝胶(a30-30)的吸水形变膨胀；
46.图8巩膜钉用水凝胶(a30-30)对炎症因子的抑制作用；
47.图9巩膜钉用水凝胶(a30-30)对新生血管的抑制作用；
48.图10巩膜钉用水凝胶(a30-30)的药物缓释曲线。
具体实施方式
49.以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
50.实施例1～7
51.根据本发明提供的巩膜钉用水凝胶的制备方法，本发明进行了实施例1～7实验，使用不同琼脂糖含量和不同致孔剂含量制备了七种巩膜钉用水凝胶，具体步骤如下：
52.(1)取氢氧化锂、氢氧化钾、尿素和水，配制氢氧化锂浓度为4.5wt％，氢氧化钾浓度为7wt％，尿素浓度为8wt％的碱脲溶液，将壳聚糖和琼脂糖分别溶解于碱脲溶液中，得到壳聚糖溶液和多糖溶液，壳聚糖溶液中壳聚糖浓度为3wt％，多糖溶液中多糖浓度为3wt％，将壳聚糖溶液和多糖溶液按重量比混匀(具体参见表1)，得到壳聚糖-多糖溶液；
53.(2)向步骤(1)制得的壳聚糖-多糖溶液中加入致孔剂无水硫酸钠，致孔剂重量为壳聚糖-多糖溶液重量的0～50wt％(具体参见表1)，混匀，得到混合液，将混合液注入模具中，经-20℃冷冻、陈化处理48h，得到水凝胶；
54.(3)将步骤(2)制得的水凝胶置于水中再生48h，每三个小时换一次水，然后-20℃冷冻定型，得到多孔海绵支架；
55.(4)将步骤(3)制得的多孔海绵支架于100℃水中浸泡8h，去除多孔海绵支架中的多糖，于-20℃冷冻干燥，得到多孔壳聚糖支架；
56.(5)将地塞米松溶于乙醇中，配制浓度为20mg/ml的地塞米松溶液，将1ml地塞米松溶液加入到含聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量为200)和光引发剂i2959的水溶液中，混匀，得到混合溶液，混合溶液中聚乙二醇二丙烯酸酯和光引发剂的浓度分别为20wt％和0.1wt％；采用喷涂或浸渍的方法将混合溶液负载到步骤(4)制备的多孔壳聚糖支架上，经波长为365nm，强度为205mw/cm2的紫外光照射10min，再于-20℃冷冻干燥，得巩膜钉用水凝胶。
57.将上述实施例1～7使用不同琼脂糖含量和致孔剂含量制备的巩膜钉用水凝胶命名为ax-y(x为琼脂糖含量，y为致孔剂含量)，具体参见表1。
58.表1
[0059][0060]
性能测试
[0061]
将本发明实施例1～7制备的ax-y进行以下表征和性能测试：
[0062]
1.扫描电镜分析
[0063]
将实施例1～7制备的巩膜钉用水凝胶ax-y进行扫描电镜分析，结果如图1所示。
[0064]
由图1可知，巩膜钉用水凝胶均表现出丰富的孔洞结构，当体系中只引入致孔剂无水硫酸钠时(a0-30)，巩膜钉用水凝胶的孔结构多为闭孔结构。当体系中引入琼脂糖时，巩膜钉用水凝胶的部分孔结构开始由闭孔结构转为连通孔结构，由实施例1～4的对比可知，随着琼脂糖含量的增大而增多，但当琼脂糖含量为50wt％时，巩膜钉用水凝胶变的比较松软，部分孔结构开始坍塌。当琼脂糖含量为30wt％时，巩膜钉用水凝胶孔洞结构比较致密，且孔与孔之间连通，这有利于提高其力学性能和延缓其药物释放效率。当固定体系中琼脂
糖含量(30wt％)时，从实施例3和实施例5～7的对比可知，随着体系中无水硫酸钠含量的增大，巩膜钉用水凝胶孔结构变大，且连通孔结构减少，这是由于无水硫酸钠有利于促进溶液的凝胶化，无水硫酸钠含量越高，凝胶化程度越高，促进了琼脂糖与壳聚糖之间的交联，降低了琼脂糖的溶出。
[0065]
2.孔隙率测定
[0066]
测定实施例1～7制备的巩膜钉用水凝胶ax-y的孔隙率，结果如图2所示。
[0067]
由图2可知，当固定体系中致孔剂无水硫酸钠的含量为壳聚糖-多糖溶液重量的30wt％时，巩膜钉用水凝胶的孔隙率随着琼脂糖含量的增大而增大。当固定体系中琼脂糖含量为30wt％时，巩膜钉用水凝胶的孔隙率随着无水硫酸钠含量的增大先升高后降低，这是由于当无水硫酸钠含量过高时，促进了琼脂糖与壳聚糖的交联，降低了琼脂糖的溶出，进而降低其孔隙率。
[0068]
3.细胞毒性测定
[0069]
测定实施例1～7制备的巩膜钉用水凝胶ax-y的细胞毒性，结果如图3所示。
[0070]
由图3可知，当固定体系中无水硫酸钠的含量为30wt％时(实施例1～4)，巩膜钉用水凝胶的细胞存活率在1天时分别为94
±
4.5％，87.5
±
3.6％，81.5
±
3％和82
±
3％，当固定体系中琼脂糖含量为30wt％时(实施例3、实施例5～7)，巩膜钉用水凝胶的细胞存活率在1天时分别为98.5
±
3.6％，92
±
3.8％，81.5
±
3％和65.5
±
1.6％，由此可得出无论增加无水硫酸钠的量还是增加琼脂糖的量，都可能会导致细胞轻微损伤，不利于细胞增值。当固定体系中无水硫酸钠的含量为30wt％时，巩膜钉用水凝胶的细胞存活率在3天时分别为101.5
±
3.2％，96.5
±
3.25％，87.5
±
4.5％和91
±
3.6％，7天时分别为131
±
0.85％，121
±
1％，108
±
1.8％和115
±
0.9％。当固定体系中琼脂糖含量为30wt％时，巩膜钉用水凝胶的细胞存活率在3天时分别为106.5
±
7％，94
±
3.8％，87.5
±
4.5％和57
±
3.2％，7天时分别为136
±
1.8％，109
±
2.4％，108
±
1.8％和52
±
0.9％。由此表明除了a30-50外，其他组分水凝胶均表现出较好的细胞相容性，随着时间的延长，均能促进细胞的增值，而对于a30-50组，其可能是由于当无水硫酸钠含量过高时，促进了琼脂糖与壳聚糖的交联，降低了琼脂糖的溶出，进而增加了其细胞毒性。
[0071]
4.活-死细胞荧光染色
[0072]
将实施例3制备的巩膜钉用水凝胶a30-30分别在0h，24h和48h进行活-死细胞荧光染色，结果如图4所示。
[0073]
从图4中可直观的看出随着培养时间的延长，细胞逐渐增值，表现出较好的细胞存活率，巩膜钉用水凝胶(a30-30)具有较好的细胞相容性，能够促进细胞的增值，有利于手术创面的愈合。
[0074]
5.压缩强度测试
[0075]
测定实施例1～7制备的巩膜钉用水凝胶ax-y的压缩强度，结果如图5所示。
[0076]
由图5可以看出，随着无水硫酸钠或琼脂糖含量的增大，巩膜钉用水凝胶的压缩强度都是呈现逐渐降低趋势，这是由于无论无水硫酸钠或琼脂糖的引入，均能增加壳聚糖支架的孔隙率和柔软度，进而降低其力学强度。
[0077]
6.抑菌性能测试
[0078]
测定实施例1～7制备的巩膜钉用水凝胶ax-y的抑菌性能，结果如图6所示。
[0079]
由图6可以看出，各组样品均能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，从琼脂板的数码照片可以明显看出，对照组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均在琼脂表面形成致密的菌落，而对于巩膜钉用水凝胶各组，基本上没有菌落形成，同时可以从其对应的活-死细菌荧光染色明显看出，对照组(原始菌液)表现出明亮的绿色(代表活细菌)，而巩膜钉用水凝胶各组基本呈现为明亮的红色(代表死细菌)，基本没有绿色，该结果表明巩膜钉用水凝胶具有优异的抑菌性能，能够防止手术切口部位的细菌滋生，进而降低术后眼部细菌感染的几率。
[0080]
7.吸水形变膨胀情况测试
[0081]
测试实施例3制备的巩膜钉用水凝胶a30-30的吸水形变膨胀情况，结果如图7所示。
[0082]
由图7可以看出，压缩后的巩膜钉用水凝胶(a30-30)能够在10s内吸水迅速发生体积膨胀，这有利于其快速封堵眼部手术切口，防止细菌感染，同时避免手术缝合，降低手术工作量。
[0083]
8.对炎症因子的抑制作用
[0084]
测试实施例3制备的巩膜钉用水凝胶a30-30对炎症因子的抑制作用，结果如图8所示。
[0085]
由图8可以看出，缺氧会造成血视网膜屏障破坏，进而导致其相关蛋白zo1的表达量降低(第二列)，当加入巩膜钉用水凝胶(第三列)和地塞米松药物(第四列)，促进zo1蛋白的表达，均能改善缺氧导致的血视网膜屏障破坏，进而稳定血视网膜屏障。同时缺氧会造成炎症水平的升高，促进相关蛋白il18的表达，进一步加重血视网膜屏障的损伤，当加入巩膜钉用水凝胶(第三列)和地塞米松药物(第四列)，均能抑制il18蛋白的表达，具有较好的抗炎作用，进而保护血视网膜屏障。巩膜钉用水凝胶与地塞米松药物组均表现出较好抗炎作用和保护血视网膜屏障的效果，该结果表明该巩膜钉用水凝胶能与单纯注射地塞米松达到相同的抗炎及保护血视网膜屏障的作用。
[0086]
9.对新生血管的抑制作用
[0087]
测试实施例3制备的巩膜钉用水凝胶a30-30对新生血管的抑制作用，结果如图9所示。
[0088]
图9是恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞成管实验的荧光染色，缺氧条件下会促进细胞形成管腔样结构，从图中可明显看出在缺氧条件下，细胞形成较多的管腔样结构，而当加入用本技术的水凝胶制成的巩膜钉和地塞米松药物时，管腔样结构的完整性和数量明显受到抑制。细胞管腔增多代表着新生血管增多，加入巩膜钉用水凝胶和地塞米松药物时都能够明显抑制新生血管形成，该结果表明所制备的巩膜钉用水凝胶能与单纯注射地塞米松达到相同的抑制血管形成的效果。
[0089]
10.药物缓释曲线
[0090]
测试实施例3制备的巩膜钉用水凝胶a30-30中的药物缓释情况，制备药物缓释曲线，结果如图10所示。
[0091]
由图10可以看出，巩膜钉用水凝胶(a30-30)中地塞米松的释放呈现出较为平稳的释放速率，在33天时释放总量仅为39.1
±
2.4％，说明该载药巩膜钉用水凝胶能够保持较长的药物释放周期，满足其持续治疗眼部疾病的作用，避免了短期内反复注射药物带来的眼
内感染、经济压力及患者痛苦。
[0092]
上述实施例为本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何不超出本发明设计思路组合、改变、修饰、替代、简化，均落入本发明的保护范围之内。