一种基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体及其制备方法和应用

1.本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及一种基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.量子点(quantum dots)是一类新型的半导体荧光纳米材料，主要由ii-vi族元素(如：cdse，cdte)或iii-v族元素(如：inp)组成，直径在1-100nm之间。量子点与传统的荧光染料相比具有更长的荧光寿命,更高的荧光量子产率，更宽的激发光谱，更窄的发射光谱，而且量子点的比表面积更大，表面更容易于修饰，这些优点使得量子点能够广泛应用于靶向载药，疾病诊断，生物成像等生物医学领域。
3.二氢硫辛酸(dhla)是一种由硫辛酸加氢还原而成的有机化合物，是带有两个巯基的羧酸，它存在两种对映异构体，但只有其中的r-型对映体具有生物学活性。实验使用的dl-硫辛酸即为α-硫辛酸。dl-硫辛酸是一种独特的抗自由基物质，通常被称为广泛抗氧化剂。由于巯基与量子点表面金属元素如cd、zn之间有很强的配位能力，一般作为配位剂进行置换，但单巯基配体包覆的量子点一般稳定性较差。通过使用含有双巯基的二氢硫辛酸，能使量子点在水溶液中稳定性提高。
4.聚乙二醇(peg)不仅能加强纳米载药体系的水溶性和稳定性，还能使纳米载药体系尽可能避免被网状内皮组织系统识别和非特异性摄取，从而延长该载药体系在循环中的半衰期。它与许多有机物形成良好的生物相容性，与水溶性不好的化合物合成可增加其一定的溶解性，当化合物经peg修饰进入血液中时，可抑制转氨酶系统的吸附，减少系统对其清除，从而延长血液循环时间，影响给药系统的转运。因此peg在控制释药、伤口愈合、药物传递等领域获得广泛的研究。
5.10-羟基喜树碱(hcpt)作为该体系所载的抗癌药物，是从珙桐科植物喜树中分离出来的喹啉类生物碱。它是s期的特异性抗癌药物，作用机制为抑制dna拓扑异构酶ⅰ。毒性比喜树碱小，与常用抗癌药物无明显交叉耐药性。然而，由于其水溶性差以及在生理ph条件下打开不稳定内酯环而导致的内在不稳定性，使得hcpt在临床上无法得到有效的应用，而纳米药物载体的存在完美的解决了这个问题。


技术实现要素：

6.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体及其制备方法和应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体，其具有如下通式：
[0009][0010]
配体为二氢硫辛酸和聚乙二醇；qds为cdse/zns量子点；n＝44-46。
[0011]
本发明提供了上述基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体的制备方法，其合成路线如下所示：
[0012][0013]
具体包括如下步骤：
[0014]
1)将0.156g化合物1dl-硫辛酸(la)溶于甲醇，得到淡黄色的澄清透明液体，然后缓慢加入0.050-0.070g nabh4将硫辛酸的二硫键还原断裂为双巯基，室温搅拌2-5h后，停止搅拌，得到化合物2dhla；由于该反应产率较高，达到90％以上，且仅有产物二氢硫辛酸带有双巯基可修饰于量子点之上，原料药dl-硫辛酸及溶剂甲醇对后续反应无影响，且易除去，故此处可不进行相关的分离提纯，直接进行下一步反应；
[0015]
2)向步骤1)所得产物中加入适量含cdse/zns量子点的氯仿溶液，避光搅拌3-6h(可以观察到量子点转移至上层，并且量子点的颜色由原来的橘黄色转变成红色，下层为无色氯仿层)，将上层修饰后的水溶性量子点转移至ep管中，加入丙酮(水溶性量子点和丙酮可按照1:2-5的体积比混合)，晃动均匀，离心，弃去上清液，收集沉淀，即得纯净的水溶性量子点3cdse/zns@dhla固体；
[0016]
3)将0.100g步骤2)所得产物3溶于二甲基亚砜(dmso)中，再加入0.350-0.380g二环己基碳二亚胺(dcc)和0.0250-0.040g 4-二甲氨基吡啶(dmap)，搅拌0.5-2h以活化羧基，然后加入peg
2000
，室温避光搅拌10-24h，得到的产物转移至ep管中，加入丙酮(产物和丙酮可按照1:2-5的体积比混合)，晃动均匀，离心，弃去上层液体，得纯净的产物4cdse/zns@dhla-peg。
[0017]
具体的，步骤2)中所述cdse/zns量子点与化合物2的质量比为1：6-8，修饰后的量子点和丙酮的体积比为1:2-5。
[0018]
具体的，步骤3)中产物3与peg
2000
的质量比为1:6-10。
[0019]
本发明提供了一种利用上述纳米药物载体负载药物的方法，其合成路线如下所示：
[0020][0021]
具体包括如下步骤：
[0022]
a)取0.040g化合物6丁二酸酐，加入无水二甲基甲酰胺(dmf)搅拌溶解，再加入0.030-0.040g 4-二甲基吡啶(dmap)继续搅拌0.5-2h进行酸酐的开环及羧基活化，然后加入化合物5 10-羟基喜树碱(hcpt)，室温搅拌24-36h，再加入甲醇水溶液继续搅拌0.5-2h以水解过量酸酐，得到的黄色液体加入甲醇后在0-8℃下静置12-24h，待其析出结晶，收集产物，真空干燥并进行柱层析纯化，得到纯化合物7chcpt；
[0023]
b)取0.100g化合物7chcpt用无水dmso溶解后，再加入0.020-0.030g二环己基碳二亚胺(dcc)和0.035-0.045g 4-二甲氨基吡啶(dmap)活化羧基0.5-2h后，投放载体产物4，室温避光搅拌12-24h，将得到的产物转移至ep管中，加入丙酮(产物和丙酮按照1:2-5的体积混合)，晃动均匀，离心，收集产物，冷冻干燥，即得纯净的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)。
[0024]
具体的，步骤a)中化合物5与化合物6的摩尔比为1:1-3；步骤b)中产物4与化合物7的质量比为1:1-2。
[0025]
本发明还提供了采用上述方法负载所得的药物。
[0026]
本发明还提供了上述基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体在载药、细胞生物活性方面的应用。
[0027]
本发明还提供了上述药物在抑制癌细胞生物活性方面的应用。
[0028]
上述的应用，进一步的，所述癌细胞包括宫颈癌细胞、肺癌细胞、胶质瘤细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞等。
[0029]
本发明中，涉及的总合成路线如下所示：
[0030][0031]
本发明二氢硫辛酸修饰的量子点是通过二氢硫辛酸在碱性环境下与量子点在氯仿溶剂中反应，经过沉淀、离心分离提纯得到二氢硫辛酸修饰的量子点，再连接peg使其具有良好的生物相容性，以及延长整个体系的体内循环时间。和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0032]
1)紫外和荧光数据显示：本发明通过带有双巯基的二氢硫辛酸修饰量子点，使得修饰的量子点具有较好的水溶性，稳定性；
[0033]
2)本发明在二氢硫辛酸修饰的量子点表面再连接peg使修饰的量子点具有良好的生物相容性，制成具有生物相容性高的纳米材料，实现其在化学生物学领域中作为纳米药物载体的作用；
[0034]
3)本发明基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体的制备方法简单易行，成本较低；
[0035]
4)本发明二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体具有很好的光学特征，可以为药物的运载和释放提供较好的光学信号，为药物的示踪提供便利条件。
附图说明
[0036]
图1为实施例1中量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)的透射电镜图谱；
[0037]
图2为实施例1中量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)紫外吸收图谱；
[0038]
图3为实施例1中量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)的荧光光谱谱。
具体实施方式
[0039]
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0040]
实验仪器名称与型号：
[0041]
美国perkin-elmer lambda-850紫外分光光度计；
[0042]
美国perkin-elmer ls55荧光分光光度计；
[0043]
日本jeol jem-200cx透射电子显微镜；
[0044]
美国biotek多功能酶标仪；
[0045]
下述实施例中，所用量子点cdse/zns采用本领域常规技术制备即可，本发明不再赘述。可参考下述文献：
[0046]
f.pinaud,d.king,h.-p.moore,s.weiss.bioactivation and cell targeting of semiconductor cdse/zns nanocrystals with phytochelatin-related peptides.j.am.chem.soc.2004,126(19):6115-6123；
[0047]
x.peng,j.wickham,a.p.alivisatos.kinetics of ii-vi and iii-v colloidal semiconductor nanocrystal growth:“focusing”of size distributions.j.am.chem.soc.1998,120(21):5343-5344。
[0048]
实施例1
[0049]
1，制备基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体时的合成步骤如下：
[0050][0051]
1)制备化合物2：称取0.156g的化合物1(dl-硫辛酸，la)粉末转移至100ml圆底烧瓶中，再向其中加入20ml甲醇，搅拌溶解后，得到淡黄色的澄清透明液体。然后准确称取0.060g的nabh4缓慢加入瓶中，室温搅拌2h将硫辛酸的二硫键还原断裂为双巯基，停止搅拌，得到化合物2(dhla)。由于该反应产率较高，达到90％以上，且仅有产物二氢硫辛酸带有双巯基可修饰于量子点之上，原料药dl-硫辛酸(la)，及溶剂甲醇对后续反应无影响，且易除去，故此处可不进行相关的分离提纯，直接进行下一步反应；
[0052]
2)制备化合物3：取上一步合成的二氢硫辛酸液体20ml(含0.157g化合物2的甲醇溶液)和2ml含0.020g cdse/zns量子点的氯仿溶液混合，避光搅拌3h，我们可以观察到量子点转移至上层，并且量子点的颜色由原来的橘黄色转变成红色，下层为无色氯仿层。我们将上层修饰后的量子点转移至7ml ep管中，水溶性量子点和丙酮按照1:2的体积比混合，晃动均匀，然后在10000rpm条件下离心5min，弃去上清液，收集沉淀，即得纯净的水溶性量子点产物3(cdse/zns@dhla)固体；
[0053]
3)制备纳米载体4：取0.100g产物3(cdse/zns@dhla)溶于15ml二甲基亚砜(dmso)中，再向其中加入0.366g二环己基碳二亚胺(dcc)和0.032g 4-二甲氨基吡啶(dmap)，搅拌
半小时溶解后，加入0.600g的peg
2000
，室温避光搅拌12h。得到的产物转移至7ml ep管中，产物和丙酮按照1:2的体积比混合，晃动均匀，在12000rpm条件下离心10min，弃去上层液体，得纯净的产物4(cdse/zns@dhla-peg)。
[0054]
2，二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体负载药物的合成步骤如下：
[0055][0056]
a)制备化合物7：称取0.040g(0.0004mol)化合物6(丁二酸酐)于25ml圆底烧瓶中，向其中加入5ml无水二甲基甲酰胺(dmf)进行搅拌溶解，再向其中加入0.035g的4-二甲基吡啶(dmap)继续搅拌0.5h进行酸酐的开环及羧基活化，之后加入0.104g(0.0003mol)药物5(10-羟基喜树碱，hcpt)，室温搅拌24h。之后加入0.5ml的20％甲醇水溶液继续搅拌0.5h以水解过量酸酐。得到的黄色液体加入15ml甲醇后在4℃下静置12h，待其析出结晶，收集产物28℃真空干燥12h，并进行柱层析纯化(v
二氯甲烷
：v
甲醇
从100:1、50:1、20:1、10:1进行梯度洗脱)，得到纯化合物7(chcpt)；
[0057]
b)制备产物8：取合成的0.100g化合物7(chcpt)用15ml无水dmso溶解后，再用0.024g dcc和0.041g dmap活化羧基0.5h后，按照药物化合物7与载体质量比1:1投放载体产物4，即加入0.100g cdse/zns@dhla-peg，室温避光搅拌12h。同样的是，将得到的产物转移至7ml ep管中，产物和丙酮按照1:2的体积混合，晃动均匀，在10000rpm条件下离心15min，将收集的产物-80℃进行冷冻干燥48h，得到纯净的载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)。
[0058]
利用透射电镜对量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)的大小、分散程度进行表征，结果见图1。图1可以看出：二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4在水中均分散均匀，呈球形，二氢硫辛酸修饰后的量子点作为纳米药物载体负载chcpt后粒径由～4.7nm增加到～5.5nm。
[0059]
利用紫外吸收光谱对量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)进行表征，结果见图2。图2可以看出：二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4仍然具有量子点典型的吸收峰，修饰后的量子点吸收峰相对于原来的量子点发生不同程度的红移，说明二氢硫辛酸已经成功修饰到了量子点上。
[0060]
利用荧光光谱对量子点(cdse/zns)及二氢硫辛酸修饰后的量子点载体4(cdse/zns@dhla-peg)和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)进行表征，结果见图3。图3可以看出：吸附了chcpt后，发射光谱出现稍微的蓝移，同原来的量子点相比，载药后的产物8
发射光谱带更宽，量子点之间荧光的差异是二氢硫辛酸和peg
2000
以及chcpt在其表面的复合引起的。
[0061]
活性实验
[0062]
取hela(人宫颈癌细胞)，qsg-7701(人正常肝细胞)，a549(人肺癌细胞)，sh-sy5y(人胶质瘤细胞)，hepg2(人肝癌细胞)，mda-mb-231(人乳腺癌细胞)生长对数期细胞接种到96孔板中，每孔90μl、7
×
103个细胞，培养24h后，加入dmem培养基(含10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％(v/v)的双抗(每毫升含100单位青霉素和100g链霉素))稀释的不同浓度(20-500μg/ml)的实施例1中的样品二氢硫辛酸修饰后的量子点产物4(载体cdse/zns@dhla-peg)、化合物7chcpt和载药后的产物8(cdse/zns@dhla-peg-hcpt)，加药体积为10μl，每个药物浓度做3个平行。加药48h后，每孔各加入50μlmtt，在培养箱中作用4h，然后弃去孔中液体，再向每个孔加入100μl二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶，用酶标仪测定570nm处的吸光度。计算样品对细胞的ic
50
值(半数致死药物浓度)，评价样品的细胞毒性。结果见下表1
[0063]
表1实施例1制备得到的载体及载药后产物的细胞毒性
[0064][0065]
表1测试了实施例1制备得到的二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体4及载药后产物8对hela，qsg-7701，a549，sh-sy5y，hepg2和mda-mb-231细胞的体外生长抑制活性。ic
50
值为能使正常分裂生长的细胞数抑制到50％水平时的样品浓度值(μg/ml)，ic
50
值越大表明样品的细胞毒性越弱。实验结果表明：本发明基于二氢硫辛酸修饰的量子点纳米药物载体4对细胞的毒性很小，适合做纳米药物载体；化合物7chcpt对癌细胞和正常细胞都有抑制作用且效果较差；而载药后的产物8对癌细胞的抑制作用明显增强，且对正常细胞的抑制作用较癌细胞低。
[0066]
综上说明：本发明二氢硫辛酸修饰的量子点药物载体4可以作为纳米药物载体应用于药物化学领域，其可为更好地设计纳米药物载体奠定基础。