促进卵泡成熟的化合物

促进卵泡成熟的化合物


背景技术：

1.怀孕的能力通常似乎是最自然和最频繁发生的事情，代表了维持我们社会持续发展所必需的事件。然而，有大量且不断增加的不育女性群体，目前的治疗无法帮助她们。
2.目前针对不孕症唯一可用的治疗是标准激素治疗。在治疗之前，测量内源性激素水平，并从这种治疗中排除具有高促卵泡激素(fsh)水平的女性，因为它可能是致命的。标准激素治疗主要以静脉给药方式施用5-6天，旨在支持在每月卵巢周期中已经激活的卵泡，并且需要激素支持以完成卵泡的生长和成熟。随后，如果该程序成功，则使用超声波和收集管吸出卵子，并进行体外受精(ivf)。现在将使用胚胎发育观察器监测受精卵，如果胚胎发育质量高(根据形态学判断)，则将胚胎转移回到接受治疗的女性的子宫。在接受标准激素治疗的女性中，不到10％的女性能够成功生下体外受精的婴儿。由于目前的生育治疗是针对卵泡发育的后期阶段，很大一部分女性仍然不孕，这可能是由于原始(静止)卵泡没有被激活。因此，在提高治疗雌性不育症的成功率方面，存在重大的未满足的医疗需求。


技术实现要素：

3.本发明公开了经鉴定用于促进卵泡成熟的化合物，特别是用于促进卵泡的原始向初级的转化的化合物。当扁平颗粒细胞开始增殖并变成立方形并且卵母细胞尺寸增大时，原始卵泡的激活在形态学上以原始向初级的转化为标志。
4.我们的发明已经鉴定了可以启动原始卵泡的这种激活的化合物。这为患有排卵障碍(ovulation disorder)导致不孕症(infertility)且对标准激素治疗无反应的女性提供了一种新的治疗线。
附图说明
5.图1：显示了原始向初级的转化的示意图。原始卵泡由几乎完全被一层扁平的体颗粒细胞包围的卵母细胞组成。激活后，原始卵泡转化为初级卵泡，伴随着卵母细胞尺寸的增加以及周围颗粒细胞的生长和转化，所述周围颗粒细胞现在变成立方体并完全覆盖卵母细胞。
6.图2：显示用化合物582孵育卵巢切片的结果。(a)显示用582孵育的卵巢的横截面。(b)是用582和对照处理的卵巢的不同阶段(原始、初级和次级)的卵泡分布之间的比较。(c)显示了582的结构。
7.图3：显示用化合物583孵育卵巢切片的结果。(a)显示用583孵育的卵巢的横截面。(b)是用583和对照处理的卵巢的不同阶段(原始、初级和次级)的卵泡分布之间的比较。(c)显示了583的结构。
8.图4：显示用化合物797孵育卵巢切片的结果。(a)显示用797孵育的卵巢的横截面。(b)是用797和对照处理的卵巢的不同阶段(原始、初级和次级)的卵泡分布之间的比较。(c)显示了797的结构。
9.图5：显示用化合物798孵育卵巢切片的结果。(a)显示用798孵育的卵巢的横截面。
(b)是用798和对照处理的卵巢的不同阶段(原始、初级和次级)的卵泡分布之间的比较。(c)显示了798的结构。
10.图6：用环巴胺(cyclopamine)和对照处理的卵巢的不同阶段(原始、初级和次级)的卵泡分布之间的比较。
11.发明详述
12.本发明涉及式(i)化合物，
[0013][0014]
其中r3是低级烷基或芳基。
[0015]
如本文所用，“低级烷基”是指包含1至约4个碳原子的支链或直链无环烷基。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基。如本文所用，术语“芳基”是指具有6至14个碳原子的碳环芳环。芳基的实例包括例如苯基和萘基。
[0016]
在一个实施方案中，r3是甲基或乙基。
[0017]
在一个优选实施方案中，r3是甲基。该化合物的通用名称是5-羧基-1,2-二甲基吡啶-1-鎓。
[0018]
在另一个优选实施方案中，r3是苯基。该化合物的通用名称是5-羧基-1-甲基-2-苯基吡啶-1-鎓。
[0019]
本发明的一个实施方案涉及式(ii)化合物，
[0020][0021]
该化合物的通用名称是3-羧基-1-甲基喹啉-1-鎓。
[0022]
在又一个优选实施方案中，本发明涉及式(iii)化合物，
[0023][0024]
其中，r1选自：氧代环己烷基、氧代环戊烷基和氧代环丁烷基。在一个优选实施方案中，r1是氧代环己烷基。该化合物的通用名称是3-羧基-1-(四氢-2h-吡喃-4-基))吡啶-1-鎓。在本技术中，3-羧基-1-(四氢-2h-吡喃-4-基))吡啶-1-鎓由数字798表示。
[0025]
本发明的另一个实施方案涉及式(iv)化合物，
[0026][0027]
其中，r4是低级烷基、酰胺、苯基或苄基，
[0028]
其用于治疗排卵障碍。
[0029]
如本文所用，“低级烷基”是指包含1至约4个碳原子的支链或直链无环烷基。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基。在进一步的实施方案中，所述低级烷基是：乙基、丙基或异丙基。
[0030]
在一个实施方案中，所述低级烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。在一个优选的实施方案中，r4是异丙基，用于治疗排卵障碍。该化合物的通用名称是3-羧基-1-异丙基吡啶-1-鎓。在本技术中，3-羧基-1-异丙基吡啶-1-鎓用数字797表示。
[0031]
在另一个实施方案中，r4是乙酰胺。该化合物的通用名称是1-(2-氨基-2-氧代乙基)-3-羧基吡啶-1-鎓。
[0032]
在另一个实施方案中，r4是苯基。该化合物的通用名称是3-羧基-1-苯基吡啶-1-鎓。
[0033]
在又一个实施方案中，r4是苄基。该化合物的通用名称是1-苄基-3-羧基吡啶-1-鎓。
[0034]
在又一个优选实施方案中，本发明涉及式(v)化合物：
[0035][0036]
其中，r5：h、f、cl或甲氧基，
[0037]
其用于治疗排卵障碍。
[0038]
在一个优选实施方案中，r5是h。该化合物的通用名称是1-苄基-3-氨甲酰基吡啶-1-鎓。在本技术中，1-苄基-3-氨甲酰基吡啶-1-鎓用数字582表示。在另一个实施方案中，r5是邻位的f。在又一个实施方案中，r5是间位或对位的cl。在又一个实施方案中，r5是间位的甲氧基。
[0039]
在又一个实施方案中，本发明涉及式(vi)化合物：
[0040][0041]
其中r7是低级烷基，并且r6是h或甲基，其用于治疗排卵障碍。在一个实施方案中，所述低级烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。在一个优选实施方案中，r7是异丙基。
[0042]
在另一个优选实施方案中，r7是甲基，并且r6是h。该化合物的通用名称是3-氨甲酰基-1-甲基吡啶-1-鎓。在本技术中，3-氨甲酰基-1-甲基吡啶-1-鎓用数字583表示。在另一个实施方案中，r7是乙基，并且r6是h。在又一个实施方案中，r7是甲基，并且r6是邻位的甲基。在又一个实施方案中，r7是甲基，并且r6是对位的甲基。
[0043]
本文上述化合物可通过以下两种一般合成路线制备：
[0044]
路线1：
[0045]
这是使用烷基卤化物在氮处烷基化。x可以是i或br。r表示吡啶部分上的任何取代基。
[0046][0047]
路线2：
[0048]
路线2是zincke反应。r表示吡啶部分上的任何取代基，r2表示要加到吡啶的氮上的取代基。
[0049][0050]
在一个替代实施方案中，本发明涉及用于治疗排卵障碍的环巴胺。环巴胺由下式vii的结构表示：
[0051][0052]
环巴胺是一种从玉米百合中分离出来的天然存在的化学物质。
[0053]
根据本发明的一些化合物包含正电荷。因此，适合用于本发明的用途的化合物的
药学上可接受的盐可以通过包含带负电荷的离子来获得。这种带负电荷的离子的实例是：氯离子、碘离子和溴离子。其他带负电荷的离子可用于获得根据本公开的化合物的药学上可接受的盐。
[0054]
如实施例1所述，所测试的化合物均未显示出对哺乳动物细胞的毒性。因此，在一个实施方案中，根据本发明的化合物可以用作药物。
[0055]
在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗医学病症的方法，包括向有需要的人或动物施用治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐。
[0056]
在另一个实施方案中，根据本发明的化合物可以用于制造药物。
[0057]
此外，根据本发明的化合物通过刺激卵泡从原始向初级卵泡的转化来促进卵泡的成熟。根据本发明的化合物可以在体内使用，其中将它们施用于有需要的雌性个体。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物用于在体内促进卵泡的成熟。
[0058]
这些化合物也可以在体外使用，其中它们在体外被添加到卵泡中。因此，在另一个实施方案中，本文所述的化合物用于在体外促进卵泡的成熟。
[0059]
在一个优选的实施方案中，所述卵泡是哺乳动物卵泡。哺乳动物卵泡可以来自任何哺乳动物，例如家畜，例如马、猪或牛。在一个优选的实施方案中，哺乳动物是牛。在一个优选的实施方案中，哺乳动物是人。
[0060]
许多雌性不孕症是由排卵障碍引起的。下丘脑或垂体对生殖激素的调节出现问题，或卵巢出现问题，都可能导致排卵障碍。由于目前的标准生育治疗针对卵泡发育的后期阶段，因此标准激素治疗对可以产生次级卵泡的女性非常有效。
[0061]
我们的研究已表明，大多数排卵障碍是由于原始卵泡缺乏初始激活或激活太少，导致没有产生初级和次级卵泡。本发明的化合物促进卵泡从原始向初级卵泡的转化。因此，我们的发明表明一种新的治疗线是靶向原始卵泡，这是开始卵巢周期以产生成熟和受精卵所必需的。
[0062]
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗对目前标准激素治疗无响应的女性的不孕症。在一个优选的实施方案中，这是由于排卵障碍。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的化合物用于治疗排卵障碍。
[0063]
在一个实施方案中，所述排卵障碍选自早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，poi)和过早绝经(premature menopause)。
[0064]
poi是一种导致不孕症的排卵障碍。poi，有时被称为过早绝经，发生在女性的卵巢在其40岁之前就发生衰竭时。poi可能由遗传异常(如特纳综合征(turner syndrome)或脆性x(fragile x)、自身免疫性疾病(autoimmune diseases)或暴露于药物或放射治疗)引起。然而，特发性poi(idiopathic poi)是一种相对知之甚少的疾病，它会导致不孕症，并且本身就表现出许多额外的健康影响，例如由于缺乏足够量的雌激素而导致的骨质疏松症(osteoporosis)、各种自身免疫性疾病、心理健康疾病(自杀风险增加)、甲状腺功能减退(hypothyroidism)和心脏病。poi经常出现在20岁出头的女性身上，此时会出现过早绝经样症状。绝经代表了主要的激素变化，其特征是雌激素和孕激素水平下降，以及随着卵巢储备耗尽，雌性生殖功能停止。
[0065]
某些暴露(例如化学疗法或盆腔放射疗法)以及某些医学病症可能导致poi，但是，原因通常无法解释。
[0066]
尽管本发明的化合物可以单独给药，但优选以药物制剂的形式存在。
[0067]
本发明的一个方面涉及包含至少一种如本文所定义的化合物的药物组合物，其用于治疗雌性哺乳动物的排卵障碍，优选雌性哺乳动物是人类女性。
[0068]
优选的是，药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。
[0069]
药学上可接受的载体可以是固体或液体。
[0070]
固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种赋形剂，它们也可以用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、润湿剂、片剂崩解剂或包封材料。
[0071]
还包括固体形式制剂，其旨在使用前不久转化为用于口服给药的液体形式制剂。这种液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。除了活性组分之外，这些制剂还可以含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
[0072]
在粉剂中，载体是细碎的固体，其是与细碎的活性组分的混合物。在片剂中，活性组分与具有必要结合能力的载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和大小。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
[0073]
药学上可接受的载体的液体形式允许肠胃外给药，并且可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿、小瓶、预装注射器、输液袋，任选地添加防腐剂或其可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用前添加用于注射的无菌液体赋形剂，例如水。即时(extemporaneous)注射溶液剂和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。所述组合物可以采取诸如在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，例如在水性聚乙二醇中的溶液剂。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)，并且可以包含诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂或助悬剂、稳定剂和/或分散剂等试剂。或者，活性成分可以是粉末形式，通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冻干获得，在使用前用合适的溶媒(例如，无菌、无热原的水)进行重构。
[0074]
适合口服给药的其他形式可以包括液体形式制剂，包括乳剂、糖浆剂、酏剂、水性溶液剂、水性混悬剂。
[0075]
优选地，该制剂将包含按重量计约0.5％至75％的活性成分，其余部分由如本文所述的合适的药学赋形剂组成。
[0076]
可以制备的本发明化合物的药学上可接受的盐也旨在涵盖在本发明中。这些盐在其应用于药物用途时是可接受的。这意味着该盐将保留母体化合物的生物活性，并且该盐在其治疗疾病的应用和用途中不产生不良或有害的作用。
[0077]
药学上可接受的盐以标准方式制备。如果母体化合物是碱，则在合适的溶剂中用过量的有机或无机酸对其进行处理。如果母体化合物是酸，则在合适的溶剂中用无机或有机碱对其进行处理。
[0078]
本发明的化合物可以以其碱金属盐或碱土金属盐的形式与药学上可接受的载体或稀释剂同时(concurrently)、同时(simultaneously)或一起给药，特别是并优选以其药物组合物的形式以有效量给药，无论是通过口服、直肠或肠胃外(包括皮下)途径。
[0079]
用于本发明药物组合物的药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如
盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及有机酸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸、对甲苯磺酸和芳基磺酸的那些盐。
[0080]
根据本发明的滴剂可以包括无菌或非无菌的水性或油性溶液剂或混悬剂，并且可以通过将活性成分溶解在合适的水性溶液中来制备，该水性溶液任选地包括杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂，并且任选地包括表面活性剂。用于制备油性溶液剂的合适溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
[0081]
乳剂可以以在丙二醇水性溶液中的溶液剂形式制备，或者可以含有乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶。水性溶液剂可以通过将活性组分溶解在水中并添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。水性混悬剂可以通过将细碎的活性组分与粘性材料如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他众所周知的助悬剂分散在水中来制备。
[0082]
在一个实施方案中，药物组合物包含另外的活性剂。药物组合物还可包含如本文所述的化合物的组合。
[0083]
如本文所述，给药形式包括但不限于口服、肠胃外、肠内、直肠或含服给药。
[0084]
在一个实施方案中，药物组合物通过肠内、肠胃外或作为缓释植入物的一部分给药或适应于通过肠内、肠胃外或作为缓释植入物的一部分给药。肠胃外给药可以例如是静脉内、皮下、肌肉内、颅内或腹膜内。
[0085]
在一个优选的实施方案中，药物组合物通过注射给药或适应于注射。在一个优选的实施方案中，药物组合物通过注射到卵巢中给药或适应于注射到卵巢中。
[0086]
在一个实施方案中，本文所述的化合物将以1μg/kg-30,000μg/kg体重，例如1μg/kg-7,500μg/kg，例如1μg/kg-5,000μg/kg，例如1μg/kg-2,000μg/kg，例如1μg/kg-1,000μg/kg，例如1μg/kg-700μg/kg，例如5μg/kg-500μg/kg，例如10μg/kg至100μg/kg体重的剂量给药。在另一个实施方案中，本文所述的化合物将以1μg/kg-1,000μg/kg体重，例如1μg/kg-500μg/kg，例如1μg/kg-250μg/kg，例如1μg/kg-100μg/kg，例如1μg/kg-50μg/kg，例如1μg/kg至10μg/kg体重的剂量给药。在又一个优选实施方案中，本文所述的化合物将以10μg/kg-30,000μg/kg体重，例如10μg/kg-7,500μg/kg，例如10μg/kg-5,000μg/kg，例如10μg/kg-2,000μg/kg，例如10μg/kg-1,000μg/kg，例如10μg/kg-700μg/kg，例如10μg/kg-500μg/kg，例如10μg/kg至100μg/kg体重的剂量给药。
[0087]
本发明的药物组合物也可以在体外施用于来自所述雌性个体的原始卵泡。因此，可以从有需要的个体中取出原始卵泡，在体外用至少一种本发明的化合物进行处理并重新插入到所述雌性个体中。
[0088]
在一个实施方案中，所述雌性个体是雌性哺乳动物。优选地，所述雌性哺乳动物是人类女性。
实施例
[0089]
实施例a：5-羧基-1,2-二甲基吡啶-1-鎓碘化物的合成
[0090][0091]
将6-甲基烟酸、n,n-二甲基甲酰胺和碘甲烷置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到固体。
[0092]
1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.50(d,j＝1.4hz,1h),8.81(dd,j＝8.2,1.8hz,1h),8.13(d,j＝8.2hz,1h),4.29(s,3h),2.83(s,3h)
[0093]
实施例b：5-羧基-1-甲基-2-苯基吡啶-1-鎓碘化物的合成
[0094][0095]
将6-苯基烟酸、n,n-二甲基甲酰胺和碘甲烷置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到固体。
[0096]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.68(d,j＝1.8hz,1h),8.95(dd,j＝8.2,1.8hz,1h),8.17(d,j＝8.2hz,1h),7.73-7.65(m,5h),4.19(s,3h)
[0097]
实施例c：3-羧基-1-甲基喹啉-1-鎓碘化物的合成
[0098][0099]
将3-喹啉甲酸、n,n-二甲基甲酰胺和碘甲烷置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到固体。
[0100]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.96(d,j＝0.9hz,1h),9.79(br.s,1h),8.66(dd,j＝8.2,1.4hz,1h),8.56(d,j＝8.7hz,1h),8.42-8.37(m,1h),8.15-8.11(m,1h),4.70(s,3h)
[0101]
实施例d：3-氨甲酰基-1-(四氢-2h-吡喃-4-基)吡啶-1-鎓(798)的合成
[0102]
[0103]
用1-(2,4-二硝基苯基)吡啶-1-鎓-3-甲酰胺氯化物(200mg，0.616mmol)处理4-氨基四氢吡喃(125mg，1.23mmol)在甲醇(2.0ml)中的溶液，并将混合物在室温搅拌18小时。使反应混合物通过筛板(frit)，用meoh(4ml)洗涤。滤液用乙醚(10ml)稀释，所得沉淀在真空下过滤，得到标题化合物，为黄色固体(80mg，54％)。
[0104]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.56(s,1h),9.42-9.41(m,1h),8.96(dt,j＝8.2,1.4hz,1h),8.28(dd,j＝7.8,6.4hz,1h),7.39-7.14(明显1:1:1三冲锋，氯化铵，共计～0.73h),5.16(tt,j＝11.9,4.1hz,1h),4.07(dd,j＝11.0,4.1hz,2h),3.46(td,j＝11.7,2.0hz,2h),2.26-2.10(m,4h)。
[0105]
实施例e：3-羧基-1-苯基吡啶-1-鎓氯化物的合成：
[0106][0107]
将1-(2,4-二硝基苯基)吡啶-1-鎓-3-甲酰胺氯化物(0.20g，0.616mmol)溶解在无水甲醇(2.0ml)中，然后加入苯胺(0.16ml，1.24mmol)。将反应混合物保持过夜，然后通过烧结管过滤并将固体用甲醇(3x 1ml)洗涤。滤液用乙醚(～30ml)稀释，导致形成沉淀，混合物再次通过烧结管过滤。将固体用乙醚洗涤，然后短暂吸干，得到1-苯基吡啶-1-鎓-3-甲酰胺氯化物，为黄色固体(105mg，73％)。
[0108]
将1-苯基吡啶-1-鎓-3-甲酰胺氯化物(88mg，0.375mmol)和浓盐酸(32％)(1.0ml，10.2mmol)置于ace压力管中，用氮气吹扫，密封并放置在防爆罩后面，然后加热到60℃过夜。
[0109]
将反应混合物用二恶烷(5ml)稀释，然后真空浓缩至干。将残余物与甲苯(x 2)共沸。将残余物用异丙醇研磨，然后溶解在乙醇中，通过棉毛塞过滤并通过加入乙醚沉淀(重复两次)，得到标题化合物，为白色固体(29mg，33％)。
[0110]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.54(m,1h),9.49(dt,j＝6.0,1.4hz,1h),9.12(dt,j＝7.8,1.4hz,1h),8.38(dd,j＝8.0,6.2hz,1h),7.94-7.89(m,2h),7.76-7.72(m,3h)
[0111]
实施例f：1-苄基-3-羧基吡啶-1-鎓溴化物的合成：
[0112][0113]
将烟酸(100mg，0.812mmol)、n,n-二甲基甲酰胺(1ml)和苄基溴(0.11ml，0.894mmol)置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到淡黄色油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到白色固体(110mg，46％)。
[0114]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.54(1h,s),9.23-9.15(1h,m),8.91-8.83(1h,
m),8.20-8.12(1h,m),7.57-7.50(2h,m),7.48-7.38(3h,m),5.91(2h,s)
[0115]
实施例g：3-羧基-1-异丙基吡啶-1-鎓(797)的合成
[0116][0117]
将1-(2,4-二硝基苯基)吡啶-1-鎓-3-甲酰胺氯化物溶解在无水甲醇中，然后加入2-氨基丙烷。将反应混合物保持过夜，然后通过烧结管过滤并将固体用甲醇洗涤。滤液用乙醚稀释，导致形成沉淀，将混合物再次通过烧结管过滤。固体用乙醚洗涤，然后短暂吸干，得到3-氨甲酰基-1-异丙基吡啶-1-鎓氯化物。
[0118]
将3-氨甲酰基-1-异丙基吡啶-1-鎓氯化物和浓盐酸(32％)置于ace压力管中，用氮气吹扫，密封并放置在防爆罩后面，然后加热到60℃过夜。
[0119]
将反应混合物用二恶烷稀释，然后真空浓缩至干。将残余物与甲苯(x 2)共沸。将残余物用异丙醇研磨，然后溶解在乙醇中，通过棉毛塞过滤并通过加入乙醚沉淀(重复两次)，得到标题化合物。
[0120]1h nmr归属：(400hz,dmso-d6)δ9.55(s,1h),9.40-9.38(m,1h),8.94(dt,j＝8.2,1.4hz,1h),8.27(dd,j＝8.2,6.0hz,1h),7.39-7.11(m,近似1:1:1三冲锋，铵离子，～4h),5.18(明显五重峰，预期七重峰的最外层线不可区分，j＝6.8hz,1h),1.63(d,j＝6.4hz,6h)
[0121]
实施例h：1-(2-氨基-2-氧代-乙基)吡啶-1-鎓-3-甲酸溴化物的合成：
[0122][0123]
将烟酸、n,n-二甲基甲酰胺和2-溴乙酰胺置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到白色固体。
[0124]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.36(1h,s),9.02-8.97(1h,m),8.94-8.88(1h,m),8.20-8.13(1h,m),8.04(1h,s),7.70(1h,s),5.46(2h,s)
[0125]
实施例i：1-苄基-3-氨甲酰基吡啶-1-鎓(582)溴化物的合成
[0126][0127]
将烟酰胺、n,n-二甲基甲酰胺和苄基溴置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。粗物质从水中重结晶
得到白色固体。
[0128]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.63(1h,s),9.32-9.27(1h,m),9.00-8.93(1h,m),8.60(1h,s),8.33-8.25(1h,m),8.19(1h,s),7.61-7.53(2h,m),7.51-7.39(3h,m),5.92(2h,s)。
[0129]
实施例j：3-氨甲酰基-1-甲基吡啶-1-鎓(583)碘化物的合成
[0130][0131]
将烟酰胺、n,n-二甲基甲酰胺和溴甲烷置于小瓶中。将其密封并用箔覆盖以避光并将混合物在50℃搅拌18小时。将反应混合物真空浓缩，得到油状物。将粗产物溶解在甲醇中并通过加入乙醚沉淀为油状物。除去乙醚层并将残余物真空干燥。将粗物质从水中重结晶得到白色固体。
[0132]1h nmr归属：(400mhz,dmso-d6)δ9.36(1h,s),9.02-8.97(1h,m),8.94-8.88(1h,m),8.20-8.13(1h,m),8.04(1h,s),7.70(1h,s),5.46(2h,s)。
[0133]
实施例1-毒性测定
[0134]
将id8小鼠卵巢表面上皮细胞系(milipore，scc145)在35mm培养皿中以150000个细胞密度铺板在高葡萄糖dmem培养基(sigma cat.no.d6429)、4％fbs(cat.no.es-009-c)、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白和5ng/ml亚硒酸钠(1x its；gibco cat.no.41400045)和1x青霉素-链霉素溶液(thermo fisher cat.no.15140122)。立即向培养基中加入1μm化合物，使细胞生长2天，并使用光学显微镜检查形态。
[0135]
在毒性测定中测试了化合物3-氨甲酰基-1-(四氢-2h-吡喃-4-基)吡啶-1-鎓(798)、3-羧基-1-甲基喹啉-1-鎓(797)、1-苄基-3-氨甲酰基吡啶-1-鎓(582)、3-氨甲酰基-1-甲基吡啶-1-鎓(583)和环巴胺，发现全都未改变细胞的形态，也未对生长的细胞产生毒性。
[0136]
实施例2
–
评价使用化合物798、797、582、583和环巴胺处理后的卵泡数量
[0137]
动物
[0138]
c57bl/6j
×
cba f1杂交小鼠(janvier labs，法国)在奥胡斯大学生物医学系的动物设施中安置和饲养。将动物安置在12:12小时控制的明暗环境中，并随意提供食物和水。该研究使用7天龄的雌性幼崽。
[0139]
卵巢分离和器官培养
[0140]
处死幼崽并切除卵巢。使用立体显微镜mz75(leica microsystems，德国)，去除多余的组织。在解剖过程中，使卵巢在培养基中保持在37℃：αmem(thermo fisher)，补充有10％fbs(thermo fisher)、100miu/ml fsh(sigma-aldrich)、100iu/ml青霉素(thermo fisher)、100μg/ml链霉素(thermo fisher)和1％胰岛素-转铁蛋白-硒(thermo fisher)。将分离的卵巢转移到24孔板(组织培养物处理的，20细胞培养板；costar)中的孔内嵌小室(insert)(pet膜thincert，0.4μm孔径；greiner bio-one)。将200-300μl培养基添加到内嵌小室下方的孔中，并将最多两个卵巢放置在每个内嵌小室的膜上。在培养基中添加0.5μm和1μm化合物(化合物582和583)或25μm化合物(化合物798和798)，最后添加0.5μm化合物(环
巴胺)。24孔板中最多6个孔用于内嵌小室。将无菌dh2o添加到其余的孔中以确保湿度。卵巢在37℃、5％co2下培养4天。每隔一天用新鲜培养基替换150μl培养基。
[0141]
组织学分析和卵泡计数
[0142]
卵巢在器官培养物中保持4天，在4℃、4％多聚甲醛溶液中固定24小时。固定后，卵巢在使用70％、96％和99.9％乙醇的乙醇系列中脱水。使用二甲苯作为透明剂，然后将卵巢浸润在石蜡中。使用切片机(cut 6062，slee medical，德国)将石蜡中样品切割成5μm切片。将石蜡切片安装在玻璃载玻片上，石蜡在60℃下熔化，样品用苏木精和伊红染色(使用标准方案)。样品通过在二甲苯中孵育2
×
15分钟去除石蜡，然后在一系列乙醇中再水化；在99.9％乙醇中3
×
2分钟，在96％乙醇中2分钟，在70％乙醇中2分钟。然后在dh2o中冲洗样品，在苏木精中染色40秒，在dh2o中冲洗5分钟，并在伊红中染色46秒。样品在乙醇中脱水：在96％乙醇中脱水2
×
2分钟，在99.9％乙醇中脱水2
×
2分钟，最后在二甲苯中透明至少30分钟，然后使用eukitt安装介质(sigma-aldrich)和盖玻片安装样品。使用倒置研究显微镜(dmi4000b，leica microsystems，德国)对每个发育阶段的卵泡数量进行计数。对每个卵巢每第3～4切片的卵泡进行计数，并测定卵泡在不同阶段的百分比分布。每种处理在至少三个生物重复上重复。仅计数具有可见卵母细胞核的卵泡。卵泡被分类为原始卵泡、初级卵泡或次级卵泡。简言之，原始卵泡由被扁平鳞状颗粒细胞包裹的卵母细胞组成。初级卵泡是由被一层立方颗粒细胞包裹的卵母细胞，次级卵泡是由被多于一层的立方颗粒细胞包裹的卵母细胞组成。
[0143]
统计分析
[0144]
对来自每个生物重复的不同阶段的卵泡百分比计算平均值。在比较两个组时，进行了非配对t检验。当比较多于两个组时，进行单因素方差分析，然后使用holm-sidak方法确定统计学显著性。如果p≤0.05，则认为组具有统计学显著差异。借助graphpad prism(版本7.00graphpad software，la jolla，ca，usa)计算统计数据。
[0145]
结果
[0146]
如上所述，评价了用化合物3-氨甲酰基-1-(四氢-2h-吡喃-4-基)吡啶-1-鎓(798)、3-羧基-1-甲基喹啉-1-鎓(797)、1-苄基-3-氨甲酰基吡啶-1-鎓(582)、3-氨甲酰基-1-甲基吡啶-1-鎓(583)和环巴胺孵育卵巢的效果。
[0147]
在用化合物798、797、582和583孵育后目测检查卵巢切片(图2a-5a)。结果发现，培养中的卵巢整体外观健康，大小正常，未观察到收缩。此外，卵泡的形态看起来很健康，因为就细胞的大小和细胞之间的接触而言，这些卵泡的生长是正常的。卵母细胞和颗粒细胞未分离。最后，发现与未添加化合物的样品相比，对于已添加化合物的样品，卵泡的激活，即从原始卵泡向初级和次级卵泡的转化是显著的(图2b-5b和图6)。