一种高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法与流程

1.本发明属于蛋白组学技术领域，具体地，涉及一种高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法。


背景技术：

2.血清/血浆由于是体内自由流动的液体，含有生物体各个组织器官释放的物质，蕴藏着大量的潜在可利用的生理或病理信息。随着蛋白质组学的发展，其相应的血清/血浆去除高丰度的分子筛以及液相质谱检测器也在快速发展，样本通量迅速变大，从以前单样本采集时间90-180min，目前可以缩减到10min完成单样本数据采集，同时数据分析平台也在往云平台发展，上千样本同时处理仅需几天时间。然而，样本前处理目前还处在耗时长、效率低的单个样本操作阶段，此时，提高每批次样本数量及方法优化显得尤为重要。
3.目前提取血清/血浆样本蛋白质组的方法，需要每个样本单独操作，存在操作繁琐、耗时长、通量小、样本见稳定性差等问题。比如：使用seer公司生产的proteograph assay kit，每96个样本操作时间大约为7h左右；使用thermofisher公司生产的high-select
tm
top14丰度蛋白去除中型离心柱，每个样本单独使用top14丰度蛋白去除中型离心柱提取血清/血浆样本蛋白质组，工作需耗时至少6-8h，而每个人每批次最多操作24个样本，同时耗时会增加为每批次2h。


技术实现要素：

4.发明目的：针对目前血清/血浆蛋白质及肽段组样品制备方法的局限性，本发明提供了一种高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，包括以下步骤：将分子筛材料和待测样本加入到装有微孔滤膜的多孔筛板中，依次进行分子筛材料与蛋白的结合、非特异性蛋白的清洗、还原烷基化、酶解、除盐、制备成蛋白质组样品，最后进行质谱检测。
7.优选的，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组，优选血清/血浆；所述分子筛材料选自a型、z型、y型或丝光沸石型中的一种或几种的混合物，或者某一类型中几种的混合物；优选y型分子筛。
8.优选的，所述装有微孔滤膜的多孔筛板，包括将微孔滤膜预装至多孔筛板上和将微孔滤膜预装至移液器吸头tips上两种方式。
9.进一步优选的，预装至多孔筛板上的微孔滤膜包括有机系尼龙微孔滤膜、pvdf聚偏氟乙烯微孔滤膜、玻璃纤维微孔滤膜、pp聚丙烯微孔滤膜、醋酸纤维滤膜、pes微孔滤膜、混合纤维素酯微孔滤膜中的一种或任意组合，优选0.22um孔径的pp聚丙烯微孔滤膜。
10.预装至tips上的微孔滤膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、sdb膜中的一种或任意组合，膜上蛋白提取效果阳离子交换膜＞sdb膜＞阴离子交换膜。
11.优选的，所述的高通量富集蛋白质和/或肽段组质谱鉴定方法，包括以下步骤：
12.s1、将待测样本、结合缓冲液与分子筛材料置于装有微孔滤膜的多孔筛板，直接在多孔筛板中进行分子筛材料与蛋白的结合；
13.s2、将多孔筛板中混悬液孵育后，进行高速离心或负压，沉淀ⅰ被截留在所述微孔滤膜上；
14.s3、将清洗缓冲液加入沉淀ⅰ得到重悬液，将所述重悬液高速离心后，沉淀ⅱ被截留在所述微孔滤膜上，重复该步骤数次；
15.s4、将还原烷基化试剂加入所述沉淀ii中进行还原烷基化；
16.s5、将胰蛋白酶加入到上述还原烷基化后溶液中，进行酶解；
17.s6、用溶剂对酶解后肽段样本进行清洗除盐、解吸附，使其从微孔滤膜上洗脱下来，制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。
18.进一步优选的，步骤s1中，所述结合缓冲液成分包括tris-hcl、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、edta、sds、np-40、chaps、吐温、triton、peg的中的一种或任意组合，优选为tris-hcl、edta的组合缓冲液；所述分子筛材料与蛋白结合条件为：18～37℃下孵育1～120min。
19.进一步优选的，步骤s2中，所述高速离心的条件如下：离心力为200～8,000g，温度为2～8℃，时间为5～120min；步骤s3中，所述清洗缓冲液选自结合缓冲液或相应稀释液；所述高速离心的条件为：离心力为200～8,000g，温度为2～28℃，时间为5～120min；该步骤可重复多次，优选3次。
20.进一步优选的，所述装有微孔滤膜的多孔筛板，包括将微孔滤膜预装至多孔筛板上和将微孔滤膜预装至tips上两种方式；步骤s4中，如使用预装至多孔筛板上的微孔滤膜，直接将还原烷基化试剂加入到沉淀ⅱ中进行膜上还原烷基化；如使用预装至tips上的微孔滤膜，需使用蛋白洗脱液将蛋白洗脱至多孔板中，然后再加入还原烷基化试剂进行还原烷基化反应；优选的，所述蛋白洗脱液为1～10％sdc或0.1～10％氨水或0.1mm～1m氢氧化钠溶液或上述溶液混合液；所述洗脱采用高速离心方法，高速离心的条件为：离心力为200～8,000g，温度为2～28℃，时间为5～120min；
21.步骤s4中，所述还原烷基化试剂中，还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原烷基化试剂后于45～95℃条件下反应0～60min；
22.进一步优选的，步骤s5中，所述胰蛋白酶的加入量为0.1～100ng/μl；所述酶解的条件为：温度为25～37℃，时间为1～16h。
23.进一步优选的，所述装有微孔滤膜的多孔筛板，包括将微孔滤膜预装至多孔筛板上和将微孔滤膜预装至tips上两种方式；步骤s6中，如使用预装至多孔筛板上的微孔滤膜，直接在微孔滤膜上加入有机溶剂进行除盐；如使用预装至tips上的微孔滤膜，需将酶解后肽段转移至微孔滤板中进行除盐；优选的，所述微孔滤板选自材质为sdb膜材质或c18膜材质的微量滤板；
24.步骤s6中，所述质谱检测的方法包括：
25.采用液相色谱-串联质谱法进行检测，使用软件对获得数据进行抽提，获得蛋白及肽段定性定量数据。
26.有益效果：与现有技术相比，本方法具有以下优势：
27.(1)本发明选用分子筛材料与待测样本在微孔滤膜上进行蛋白结合与清洗，微孔滤膜在制备过程中起到支撑和过滤的作用，全部操作使用排枪和离心/负压完成，可以有效的增加样本间操作的一致性，减少中间误差，在满足96孔高通量操作的同时，将整体样本制备时间缩短到6h以内。
28.(2)如使用的装有微孔滤膜的多孔筛板具有96孔，单个筛板可载样本96个，同时可根据样本数量多少灵活调整，比如8孔、12孔等。
29.(3)采用硅铝酸盐类分子筛及相应结合缓冲液，可有效应用于吸附不同种类的蛋白及肽段样本，尤其对于血清/血浆样本，可以实现血清/血浆中低丰度蛋白及肽段的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，可用于各种蛋白质谱鉴定，在常规色谱梯度下单针质谱分析可以对大于3000种血清/血浆蛋白进行定性定量分析。
附图说明
30.图1为本发明预装至多孔筛板上微孔滤膜上蛋白提取实验流程示意图。
31.图2为本发明基于tip spe膜上蛋白提取实验流程示意图。
32.图3为本发明方法高通量装置意图。
33.图4为实施例1样本相关性比较。
34.图5为实施例2样本相关性比较。
具体实施方式
35.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
36.实施例1
37.选取预装至多孔筛板上0.22um孔径的pp聚丙烯微孔滤膜(本领域技术人员可以自制实现)进行蛋白富集，分别选取96孔板不同板与不同位置进行蛋白富集：
38.1.从冰箱中取出不同血浆样本，每个样本取100μl血浆于37℃解冻，4℃、1,500g离心10min，去除底部沉淀后上清转移至新管；
39.2.将y型混合材料(hy:nay:lay，1:1:1，hy(nkf-8)硅铝比10，nay(nkf-7)硅铝比4.8～5.4，lay(nkf-8-2)硅铝比≥5.1)加入到装有pp聚丙烯微孔滤膜的多孔筛板上，加入260μl结合缓冲液(50mm tris-hcl,10mm edta)重悬材料，加入40μl血浆，室温孵育15min；
40.3.孵育完成后2000g离心5min去掉上清溶液，沉淀用500μl清洗缓冲液(50mm tris-hcl,10mm edta)重悬后，2000g离心5min去掉上清；
41.4.重复步骤3两次；
42.5.向微孔滤膜上加入一定体积三(2-羧乙基)膦和氯乙酰胺混合液，95℃反应10min；
43.6.向微孔滤膜上加入1.5μl胰蛋白酶，混匀，37℃酶解2h；
44.7.加入终浓度95％的乙腈1000rpm孵育5min，2000g离心5min去掉上清；
45.8.加入200μl浓度为95％的乙腈1000rpm孵育5min，2000g离心5min去掉上清；
46.9.重复步骤8；
47.10.加入100μl浓度为2％的乙腈1000rpm孵育5min，2000g离心5min收集上清，得到纯化肽段溶液；
48.11.冻干纯化肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段；
49.12.将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行dia数据采集；
50.13.使用spectronaut软件依据以及建立的血清/血浆数据库对质谱数据进行抽提，获得蛋白定性定量结果；
51.实验结果：
52.上机数据分析表明实验组肽段鉴定数大于20000，蛋白鉴定数大于3000(如表1)
53.表1.pp聚丙烯微孔滤膜上蛋白提取肽段、蛋白鉴定数比较
[0054][0055]
上述不同序号表示取自不同的孔板和孔位。
[0056]
实施例2
[0057]
选取预装至tips上阳离子交换膜(3m empore spe disk膜片)(本领域技术人员可以自制实现或者购买得到)进行蛋白富集分别选取96孔板不同板与不同位置进行蛋白富集：
[0058]
1、从冰箱中取出不同血浆样本，每个样本取100μl血浆于37℃解冻，4℃、1,500g离心10min，去除底部沉淀后上清转移至新管；
[0059]
2、将y型混合材料(hy:nay:lay，1:1:1，hy(nkf-8)硅铝比10，nay(nkf-7)硅铝比4.8～5.4，lay(nkf-8-2)硅铝比≥5.1)加入到装有阳离子交换膜的tips上，加入260μl结合缓冲液(50mm tris-hcl,10mm edta)，加入40μl血浆，200g离心15min去掉上清溶液；
[0060]
3、加入200μl清洗缓冲液(50mm tris-hcl,10mm edta)，200g离心5min去掉上清；
[0061]
4、重复步骤3两次；
[0062]
5、加入100μl蛋白洗脱液(10mm氢氧化钠)200g离心5min，将上清收集到多孔板中，使用盐酸中和至弱碱性；
[0063]
6、向多孔板中加入一定体积三(2-羧乙基)膦和氯乙酰胺混合液，95℃反应10min；
[0064]
7、向多孔板中加入1.5μl胰蛋白酶，混匀，37℃酶解2h；
[0065]
8、加入终浓度1％的甲酸溶液，加入甲酸后剧烈震荡，4,000g离心10min，上清转移到sdb膜材质的微孔滤板中，离心，使酶解后肽段结合与sdb膜上；
[0066]
9、清洗sdb膜数次并解吸附，得到纯化肽段溶液；
[0067]
10、冻干纯化肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段；
[0068]
11、将肽段使用纳升级高效液相色谱串联质谱进行dia数据采集；
[0069]
12、使用spectronaut软件依据以及建立的血清/血浆数据库对质谱数据进行抽提，获得蛋白定性定量结果；
[0070]
实验结果：
[0071]
上机数据分析表明实验组肽段鉴定数大于20000，蛋白鉴定数大于3000(如表2)
[0072]
表2.阳离子交换膜上蛋白提取肽段、蛋白鉴定数比较
[0073][0074]
上述不同序号表示取自不同的孔板和孔位。