含诃子果提取物的组合物、制备方法、应用及护发产品与流程

1.本发明具体涉及一种含诃子果提取物的组合物、制备方法、应用及护发产品。


背景技术：

2.目前，脱发已成为全球性问题，其中雄性激素源性脱发(androgenetic alopecia，aga)又被称为“脂溢性脱发”，是最常见的脱发疾病之一，多见于中年男性，但现在女性也在呈增多趋势。雄性激素源性脱发的发病与遗传和雄激素依赖有关，主要表现为患者头皮脂肪过量溢出，常伴有头屑增多，头皮油腻，瘙痒明显的症状，表现为发际线后移，头顶部分毛发进行性减少。该疾病一般于青春期出现，随年龄增长逐渐加重，严重影响生活质量。欧美国家流行病学调查发现，50岁的人群中发病率可达50％，而我国男性发病率也达21.3％。现阶段被fda批准的治疗雄性激素源性脱发的方法有以下两种，口服非那雄胺及外用米诺地尔溶液，这两种方法主要是依靠抑制5α-还原酶活性和抑制雄激素受体的表达来进行治疗。
3.口服非那雄胺可以特异性抑制ii型5α-还原酶，减少毛囊中二氢睾酮的产生从而达到治疗效果。但全身用药可能存在性欲减退、皮疹、乳房触痛或肿大等不良反应，且该药对约30％的患者无效。一项长达7年的前列腺癌预防试验结果显示，与安慰剂组相比，非那雄胺组的高分化前列腺癌的发病率增加，这无疑重新引起了人们对非那雄胺安全性的重视。
4.米诺地尔是一种周期血管舒张药，局部长期使用时，可刺激雄性激素源性脱发患者和斑秃患者的毛发生长，适用于治疗雄性激素源性脱发和斑秃。临床上，偶尔报道使用本品后可有下列不良反应，包括刺激性皮炎(红肿、皮屑和灼痛)、非特异性过敏反应、风团、过敏性鼻炎、面部肿胀、过敏、气短、头痛、神经炎、眩晕、晕厥、水肿、胸痛、血压变化、心悸和脉搏频率幻化，但这些不良反应与使用米诺地尔药物的因果关系尚不明确。而外用米诺地尔也会出现局部头皮刺激的副作用，导致头皮轻度皮炎。另一方面，米诺地尔只能在医药方面使用，在个人护理品中是被禁止使用的原料。
5.来自泛喜马拉雅地区的诃子，是使君子科榄仁树属植物诃子(terminadia chebula retz.)及其变种绒毛诃子(terminadia chebula retz.var.tomentella kurt.)的干燥成熟果实，名诃黎勒、诃梨。
6.咖啡因有很多功效，因此它们被用于许多种类的化妆品。咖啡因对雄性激素源性脱发患者的脱发有治疗作用，主要是通过抗双氢睾酮诱导的毛囊微小化的作用机制实现该作用。咖啡因能抑制磷酸二酯酶，通过上调细胞camp水平，刺激细胞代谢从而促进细胞增殖。但促进头发生长的机理十分复杂，单纯靠抑制磷酸二酯酶，其应用和效果是有限的。此外，在长期摄取的情况下，大剂量的咖啡因是一种毒品，能够导致“咖啡因中毒”，因此在配方配制中咖啡因的浓度和纯度也受到一定限制。
7.二氨基嘧啶氧化物和吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物，与米诺地尔结构相似，是有效的防脱剂。二氨基嘧啶氧化物有助于软化胶原蛋白，可用于治疗由于发根过早损耗造成的脱发。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物通过改善皮肤表面血液循环为发根提供所需的营养，达
到抑制脱发和坚固发根的作用。但以上两种成份的添加量是有明确规定限定其添加量的，二氨基嘧啶氧化物用于防脱固发的使用量上限为1.5％。在添加量较少的情况下，二氨基嘧啶氧化物和吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物的防脱发效果明显变差。
8.因此，本领域技术人员亟需研发一种安全有效的坚固发根、防止脱发的护发产品。


技术实现要素：

9.本发明所解决的技术问题在于解决现有药物在治疗脱发问题时，不能兼顾安全性和有效性的缺陷，从而提供一种含诃子果提取物的组合物、制备方法、应用及和护发产品。本发明制备的诃子果提取物及含其的组合物具有良好的抗氧化能力，能多方面提供毛发、毛囊生长所需的营养，有效坚固发根、防止脱发。
10.本发明提供一种含诃子果提取物的组合物，其包括诃子果提取物和组分a，所述组分a为咖啡因和/或二氨基嘧啶氧化物类化合物。
11.所述诃子果提取物的制备方法包括下述步骤：干诃子果经溶剂提取、过滤，干燥滤液，即得。
12.所述干诃子果可为本领域常规，较佳地为使君子科诃子属植物诃子(terminadia chebula retz.)和/或绒毛诃子(terminadia chebula retz.var.tomentella kurt.)的干燥成熟果实。
13.所述干诃子果较佳地产自泛喜马拉雅地带。
14.所述溶剂可为去离子水。
15.所述干诃子果和所述溶剂的质量比可为1:8-1:11，较佳地为1:10。
16.所述提取可为本领域常规操作，较佳地为搅拌萃取。
17.所述提取的次数可为1-3次，较佳地为2次。
18.所述提取的时间可为1-3h，较佳地为2h。
19.所述提取的温度可为80-110℃，较佳地为90℃。
20.所述提取前较佳地还包括清洗和粉碎的步骤。
21.所述粉碎可为本领域常规操作，较佳地通过高速粉碎机实现。
22.所述粉碎后可经筛网过筛，所述筛网的目数较佳地为60目。
23.所述过滤可为本领域常规操作，较佳地为离心。
24.所述干燥可为本领域常规操作，较佳地为冷冻干燥。
25.所述二氨基嘧啶氧化物类化合物可为二氨基嘧啶氧化物和/或吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物。
26.所述含诃子果提取物的组合物的用量可为0.001-2％，较佳地为0.003-2％。
27.所述诃子果提取物的用量可为0.0001-1％，较佳地为0.001-1％。
28.所述组分a的用量可为0.0001-3％，较佳地为0.001-1.5％，更佳地为0.001-1.49％。
29.较佳地，当所述组分a为咖啡因时，所述含诃子果提取物的组合物的用量为0.001-2％；其中，所述诃子果提取物的用量为0.0001-1％，所述咖啡因的用量为0.0001-1.49％；所述诃子果提取物与所述咖啡因的质量比为1:15～10:1。
30.较佳地，当所述组分a为二氨基嘧啶氧化物时，所述含诃子果提取物的组合物的用
量为0.001-2％；其中，所述诃子果提取物的用量为0.0001-1％，所述二氨基嘧啶氧化物的用量为0.0001-1.49％；所述诃子果提取物与所述二氨基嘧啶氧化物的质量比为1:(1-15)。
31.较佳地，当所述组分a为咖啡因和二氨基嘧啶氧化物时，所述含诃子果提取物的组合物的用量为0.003-2％；其中，所述诃子果提取物的用量为0.001-1％，所述咖啡因的用量为0.001-1.5％，所述二氨基嘧啶氧化物的用量为0.0001-1.5％；所述诃子果提取物、所述咖啡因和所述二氨基嘧啶氧化物的质量比为10:(1-10):(1-100)。
32.本发明还提供一种上述含诃子果提取物的组合物的制备方法，其包括下述步骤：将所述诃子果提取物和所述组分a混合，即可。
33.本发明还提供一种上述含诃子果提取物的组合物在制备抗刺激剂、抗氧化剂、血管内皮生长因子vegf分泌促进剂、5α-还原酶抑制剂、细胞内atp分泌促进剂或脱发育发相关基因的表达促进剂中的应用；所述脱发育发相关基因包括人毛囊真皮乳突细胞中的相关基因，例如bmp2、ar、noggin、ki67、igf-1、cd44、alpl或cyp1b1。
34.本发明还提供一种护发产品，其包括上述含诃子果提取物的组合物。
35.所述含诃子果提取物的组合物在所述护发产品中的用量可为0.001-2％。
36.所述护发产品可为防脱发产品和/或生发育发产品。
37.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
38.本发明所用试剂和原料均市售可得。
39.本发明的积极进步效果在于：
40.(1)本发明制备的含诃子果提取物的组合物可以提供头发所需的营养物质，促进人毛囊乳突细胞的增殖，恢复毛囊活力，防止脱发；可以改善头皮皮肤表面的血液循环、抗炎、抗氧化，从而达到坚固发根，抑制头发脱落的作用；
41.(2)本发明制备的含诃子果提取物的组合物具有抗氧化的功效，可以有效的促进细胞内atp分泌，促进血管内皮生长因子vegf分泌，促进bmp2、ar、noggin、ki67、igf-1、cd44、alpl和cyp1b1基因的表达，抑制5α-还原酶的表达；
42.(3)本发明制备的含诃子果提取物的组合物通过添加诃子果提取物，能够有效解决咖啡因、二氨基嘧啶氧化物和吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物在配方中有用量限制的问题，在保证使用安全的同时，仍旧能够全方位提供毛发所需的营养，达到良好的防脱育发效果。
具体实施方式
43.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
44.实施例1
45.取产于泛喜马拉雅地带的干诃子果100g，清洗干净，干燥后经高速粉碎机粉碎后过60目筛，称取50g粉末于圆底烧瓶中，按照固液比1:10加入去离子水500ml搅拌提取，提取温度90℃，提取时间2h。离心过滤收集滤液，滤渣中再加入去离子水500ml在温度为90℃的条件下搅拌提取2h，离心过滤收集滤液。将两次滤液合并，对滤液进行冷冻干燥，得诃子果提取物。
46.将诃子果提取物、咖啡因和二氨基嘧啶氧化物按照10:1:1的质量比复配，得到含诃子果提取物的组合物。
47.效果实施例1
48.含诃子果提取物的组合物对人毛囊乳突细胞的细胞毒性
49.将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)以5000个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养72小时后移除上清，为每个培养孔更换不含血清的dmem基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，空白对照组为dmem基础培养基。细胞继续在37℃、5％co2的条件下培养48h，然后用cck-8试剂盒测定实施例1制备的含诃子果提取物的组合物对人毛囊真皮乳突细胞的毒性作用。
50.细胞相对存活率＝含诃子果提取物的组合物组吸光度值/空白对照组吸光度值
×
100％。
51.结果显示，含诃子果提取物的组合物对人毛囊真皮乳突细胞没有毒性作用。
52.效果实施例2
53.含诃子果提取物的组合物对人角质形成细胞的细胞毒性
54.将人角质形成细胞hacat复苏后置于37℃、5％co2的条件下培养。选取对数生长期细胞，以2
×
104/孔的密度接种于96孔板，设对照组、含诃子果提取物的组合物实验组，加样处理。细胞继续在37℃、5％co2的条件下培养24h，然后用cck-8试剂盒测定实施例1制备的含诃子果提取物的组合物对人角质形成细胞的毒性作用。
55.细胞相对存活率＝含诃子果提取物的组合物组吸光度值/对照组吸光度值
×
100％。
56.结果显示，含诃子果提取物的组合物对人角质形成细胞没有毒性作用。
57.效果实施例3
58.毛发生长特性评价
59.将实施例1中制备的含诃子果提取物的组合物溶于超纯水中，制备成母液，实验时用超纯水稀释分别制备得到不同浓度的含诃子果提取物的组合物样品，备用。
60.采用涂抹背部皮肤的方式，测试含诃子果提取物的组合物对小鼠在体毛囊生长的影响。将小鼠分为3组，分别为实验组(编号实验组1、实验组2)和对照组，每组3只小鼠。将小鼠剃毛后，实验组小鼠的背部连续七天涂抹含诃子果提取物的组合物样品，对照组涂抹超纯水。分别在抹药后对小鼠进行拍照，比较背部皮肤颜色差异，并进行切片染色观察，上述实验进行2次。
61.结果显示，涂抹含诃子果提取物的组合物七天后，实验组小鼠的背部皮肤变黑，毛发生长明显快于对照组，表明含诃子果提取物的组合物有一定促进小鼠毛发生长的作用。
62.效果实施例4
63.5α-还原酶抑制率检测
64.将实施例1中制得的含诃子果提取物的组合物溶于双蒸水中，得到不同质量浓度的溶液。获取新鲜的5α还原酶，分装，-80℃保存备用，bca法(蛋白质定量法)测定蛋白浓度。分别依次加入试剂，磷酸盐缓冲液、5α还原酶粗液、无水乙醇、含诃子果提取物的组合物、睾酮和nadph四氢钠。37℃孵育10min后，在340nm处测定吸光度，比较含诃子果提取物的组合物对5α还原酶的抑制作用。
65.5α还原酶抑制率(％)计算公式：5α-还原酶抑制率(％)＝(加入含诃子果提取物的组合物的溶液吸光度值/未加样品溶液吸光度值-1)
×
100％。
66.结果显示，含诃子果提取物的组合物在抗5α还原酶能力上比较突出，且随着浓度的提高，其抑制率越高。
67.效果实施例5
68.含诃子果提取物的组合物对毛囊乳突细胞相关基因表达的影响
69.将实施例1中制得的含诃子果提取物的组合物溶于双蒸水中，得到不同质量浓度的培养基。将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)消化，将含不同浓度的含诃子果提取物的组合物的培养基重悬为5
×
105cells/ml的细胞悬液，用移液管取20ul细胞悬液，垂直接种到一个倒置的10cm培养皿盖子上，向10cm培养皿底部加入15ml pbs，然后轻轻地拿起带有细胞液滴的培养皿盖子，培养72h收获球状培养物做rt-pcr(逆转录pcr)实验，检测基因表达情况。
70.结果显示，含诃子果提取物的组合物可以显著促进人毛囊真皮乳突细胞生长标志基因bmp2，雄激素性脱发相关基因ar，促毛囊再生基因noggin的表达。
71.效果实施例6
72.含诃子果提取物的组合物对毛囊乳突细胞内atp的作用：
73.将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)以5000个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养72小时后移除上清，为每个培养孔更换不含血清的dmem基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，空白对照组为dmem基础培养基。培养48h后使用试剂测量细胞atp含量。取出100μl培养基，设置标准品孔，加入100μl工作液，室温避光反应10min，使用化学发光酶标仪读板，计算细胞内相对atp含量。
74.相对atp含量＝含诃子果提取物的组合物组atp含量/空白对照组atp含量
×
100％。
75.结果显示，含诃子果提取物的组合物可以显著促进人毛囊真皮乳突细胞细胞内atp含量。
76.效果实施例7
77.含诃子果提取物的组合物对毛囊乳突细胞相关基因表达的影响：
78.将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)消化，用含不同浓度诃子果提取物的培养基重悬为5
×
105cells/ml的细胞悬液，用移液管取20μl细胞悬液，垂直接种到一个倒置的10cm的培养皿盖子上，向10cm培养皿的底部加入15mlpbs缓冲液，将带有细胞液滴的培养皿盖培养72h，得到的球状培养物进行rt-pcr实验。
79.结果显示，含诃子果提取物的组合物可以显著促进人毛囊真皮乳突细胞增殖标志基因ki67、细胞生长标志基因igf-1、细胞衰老标志基因cd44、细胞特征基因alpl和抗污染相关蛋白基因cyp1b1的表达。
80.效果实施例8
81.含诃子果提取物的组合物的总抗氧化能力测试：
82.使用总抗氧化能力检测试剂盒(abts快速法)(碧云天s0121)对含诃子果提取物的组合物进行总抗氧化能力检测。abts在适当的氧化剂作用下会氧化成绿色的abts ，在抗氧
化物存在时abts 的产生会被抑制，在414nm或734nm测定abts 的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。
83.结果显示，含诃子果提取物的组合物有较强的抗氧化能力。