口服富勒烯结构及制剂、及其防治类风湿性关节炎的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及口服富勒烯结构及制剂、以及它们在预防和/或治疗类风湿性关节炎中的应用。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(ra)是一种慢性自身免疫性关节疾病，影响全世界大约1％的人口，多发于女性和老年人，类风湿性关节炎患者还容易患上其他并发症，如心血管疾病等，这些并发症也会加大治疗类风湿性关节炎的难度。虽然类风湿性关节炎是由异常的自身免疫反应引起的疾病，但其潜在的致病机制尚未完全了解，目前认为是由遗传因素和环境因素的复杂相互作用触发。该疾病不仅涉及手和脚的小关节，也常见于较大的关节，其特征在于滑膜炎相关滑膜增生，并伴有新生血管生成，淋巴细胞和巨噬细胞浸润到滑膜组织中等，此外还会造成关节软骨和骨的损伤。
3.迄今为止，多种药物已被许可用作治疗类风湿性关节炎。治疗类风湿性关节炎最初使用改善病情的抗风湿药物(dmard)，如非甾体类抗炎药和糖皮质激素等。较好的dmard是甲氨蝶呤，可以与这种类型的其他药物联合使用。但如今的治疗效果仍不能令人满意，当关节炎严重时，这类药物无法提供较好的治疗效果，而且dmard也会产生毒性作用。因此，目前仍迫切需要寻找具有良好治疗效果且副作用较小的新型抗类风湿性关节炎的药物。
4.富勒烯球状分子类似一个球体，常见的富勒烯有c60、c70、c84等。富勒烯具有高度不饱和的结构以及出色的电子受体特性，因此，富勒烯及其功能化衍生物已经被广泛应用为自由基清除剂。富勒烯及其衍生物具有良好的抗氧化活性，可以发挥许多优异的生物学作用，包括肝脏保护，减少神经元损伤，延长寿命，调控免疫细胞等。目前许多研究表明，富勒烯及其衍生物在体外显著抑制了促炎细胞因子的产生，而且已经有研究证明了富勒烯及其衍生物对许多炎性疾病模型的治疗作用，这些结果都表明富勒烯及其衍生物在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中具有重大的应用潜力。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物或保健食品组合物中的应用。本发明的目的之二在于提供一种使用上述富勒烯药物组合物或保健食品组合物预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物和方法。本发明的目的之三在于提供一种使用富勒烯并能改善类风湿性关节炎的保健食品组合物或保健品。特别地，本发明所述药物组合物或保健食品组合物为非适用于局部给药的制剂，特别地，本发明涉及一种口服给药的预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物或保健食品组合物，其中使用的富勒烯结构为非水溶性。
6.为解决以上技术问题，本发明提供了一种富勒烯结构在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物或保健食品组合物中的应用。
7.优选地，所述药物组合物或保健食品组合物为口服制剂。
8.在一个实施方式中，所述富勒烯结构为水不溶性富勒烯。
9.在一个实施方式中，所述富勒烯结构包括原型富勒烯、富勒烯的功能化修饰物中的一种或多种。
10.在一个实施方式中，所述原型富勒烯包括空心富勒烯、金属富勒烯中的一种或多种。
11.在一个实施方式中，所述富勒烯的功能化修饰物选自下组的一种或多种富勒烯：
12.(1)表面修饰有功能化基团的富勒烯，
13.(2)被功能化生物小分子包裹的富勒烯，
14.(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯，
15.(4)自组装形成的功能化超分子体系富勒烯。
16.在一个实施方式中，所述表面修饰有功能化基团的富勒烯包括氨基、羟基、羧基修饰的富勒烯。
17.在一个实施方式中，所述空心富勒烯为一种或多种通式为c
2m
的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，优选地，30≤m≤45；更优选地，m为30、35或42。
18.在一个实施方式中，所述金属富勒烯包括m@c
2n
、m2@c
2n
、ma@c
2n
、m3n@c
2n
、m2c2@c
2n
、m2s@c
2n
、m2o@c
2n
和m
xa3-x
n@c
2n
中的一种或多种，其中：m、a均代表金属元素且m、a均选自sc、y和镧系金属元素中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3；优选地，所述金属富勒烯为gd@c
82
。
19.在一个实施方式中，所述富勒烯为原型富勒烯。
20.在一个实施方式中，所述富勒烯为c
60
。
21.在一个实施方式中，所述口服制剂包括口服固体制剂或口服液体制剂。
22.在一个实施方式中，所述药物组合物为口服片剂、口服胶囊剂、口服颗粒剂、口服丸剂和/或口服混悬剂。
23.在一个实施方式中，所述口服液体制剂的药物组合物中富勒烯的含量为4mg/ml。
24.在一个实施方式中，所述富勒烯结构的平均粒径为1～1000nm，可选的如平均粒径为1～200nm。
25.在一个实施方式中，所述方法包括向需要预防和/或治疗的类风湿性关节的生物体内口服施用有效剂量的前述任一种药物组合物或保健食品组合物的步骤。
26.在一个实施方式中,所述药物组合物或保健食品组合物包括混悬剂的形式，生物体内的使用浓度范围为500ppm-5000ppm。
27.有益效果：
28.(1)发明人经过大量实验发现，富勒烯结构不仅具有较强的清除自由基的能力，而且能够较快的在体内代谢，生物相容性好，对生物体毒副作用小。
29.(2)该药物可为口服摄入，方便且可长期服用，经消化系统过滤吸收，降低机体损伤，副作用小，疗效显著。
30.(3)该药物可以代谢出生物体外，由于其高效的清除自由基的效果，在体内具有优异的防治类风湿性关节炎的作用，能明显改善类风湿性关节炎引起的关节红肿、关节炎症、软骨和骨的损伤。
31.(4)本发明中对于类风湿性关节炎的防治，富勒烯结构可以在类风湿性关节炎模型成熟前使用作为预防效果；同时在类风湿性关节炎发病后使用可清除体内过多自由基，
从而防治和修复类风湿性关节炎中受损的关节功能和其他器官损伤
附图说明
32.图1为c
60
混悬剂和c
60-ala治疗类风湿性关节炎小鼠后肢的照片；
33.图2为c
60
混悬剂治疗类风湿性关节炎小鼠关节评分的变化图；
34.图3为c
60
混悬剂治疗类风湿性关节炎小鼠四爪截面面积平均值的变化图；
35.图4为c
60
混悬剂治疗类风湿性关节炎小鼠后肢膝关节切片的苏木精-伊红染色图；
36.图5为c
60
混悬剂治疗类风湿性关节炎小鼠后肢膝关节切片的番红固绿染色图；
37.图6为c
60
混悬剂治疗类风湿性关节炎小鼠后肢膝关节切片的抗酒石酸酸性磷酸酶染色图。
具体实施方式
38.根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
39.i.定义
40.除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
41.如本文所用，术语“富勒烯”是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子，是由碳原子组成的笼状结构。富勒烯包括空心富勒烯、金属富勒烯，所述空心富勒烯是单独由碳原子组成的笼状结构。
42.术语“金属富勒烯”是指在富勒烯的碳笼结构内包入各种不同的原子、离子或原子簇，形成一类具有特殊结构和性质的化合物，此类化合物通常被称为内嵌富勒烯，一般用m@c
2n
形式表示，其中m代表金属元素。
43.术语“水溶性富勒烯”或称“富勒烯水溶性修饰物”，是指对空心富勒烯、金属富勒烯颗粒等富勒烯颗粒进行水溶化修饰。修饰后的富勒烯颗粒外部修饰了多个水溶性官能团。这些化学官能团含有一种或多种羟基、羧基、巯基或氨基等亲水性基团或其组合，使富勒烯颗粒可溶于水，或直接用亲水性生物小分子如氨基酸、肽链等修饰金属富勒烯或其衍生物，也可以借助具有生物相容性的载体材料负载富勒烯或其衍生物，如脂质体、细胞膜载体等包覆，亦可以通过自组装形成水溶性超分子体系等。上述修饰方法均可按照现有技术公开的方法进行修饰。
44.本发明中所有范围的公开应当视为对范围内所有子范围和所有点值的公开。例如：1-1000的公开应当视为也公开了1-200,200-300等范围，同时也公开了200、300、400、500、600、700、800、900和100等点值。
45.术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
46.术语“减少”、“抑制”、“减轻”或“减小”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
47.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻被治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确的剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病，以及所施用的治疗。有效量的效果可以相对于对照。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论，并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或没有施用时的受试者的状况，或在药物组合的情况下，可以将组合效果与仅施用一种药物的效果进行比较。
48.术语“药物组合物”意指包含富勒烯以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
49.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本公开的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本公开上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本公开上述内容所实现的技术均属于本公开的范围。
50.ii.实施例
51.下面参照实施例进一步阐释本公开。对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本技术说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
52.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
53.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
54.实施例1：制备原型富勒烯混悬剂(c
60
混悬剂)
55.将富勒烯c
60
固体粉末(购买于厦门福纳新材料科技有限公司)、微晶纤维素、共聚维酮、山嵛酸甘油酯等辅料混合均匀，用压片机压成片剂；在进行动物实验之前，将片剂用超纯水溶解成浓度为4mg/ml(5.6mm)的c
60
混悬剂用于后续实施例。
56.实施例2：制备氨基酸修饰富勒烯(c
60-ala)
57.将100mg c
60
固体粉末(购买于厦门福纳新材料科技有限公司)加入80ml甲苯溶液中，超声溶解，转移至250ml单口烧瓶中。
58.将3gβ-丙氨酸和6g的氢氧化钠加入9ml的水溶液，再加入18ml乙醇，超声均匀后滴加入上述单口烧瓶中油浴加热到80℃，反应24h；
59.反应后使用m.w.＝3500透析袋除去小分子，使用电导率仪监测直至透析完成，浓缩得到的产物即可得到水溶性氨基酸化的富勒烯(c60-ala)，经dls测定，其在水溶液中的平均粒径为90-100nm，粒径分布均一。
60.实施例3：c
60
混悬剂、c
60-ala抑制类风湿性关节炎小鼠的四肢肿胀效果
61.动物模型：选用7-8周龄的dba/1雄性小鼠，将其随机分成3组，分别对应正常组、模型组、c
60-ala治疗组和c
60
混悬剂治疗组。
62.胶原佐剂乳化物制备：在无菌的条件下，用1ml的注射器吸取浓度为2mg/ml牛ii型胶原，用另一个1ml的注射器吸取等量佐剂，用两个注射器来回推拉，使牛ii型胶原和佐剂充分混匀，至液体呈乳白色。
63.正常组：第1天尾根部注射200微升生理盐水，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
64.模型组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
65.c
60-ala治疗组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天腹腔注射200微升4mg/ml的c
60-ala至第48天实验结束。
66.c
60
混悬剂治疗组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升4mg/ml(5.6mm)的c
60
混悬剂至第48天实验结束。
67.先培养小鼠1周，适应实验室环境，待到小鼠状态稳定后，根据小鼠体重进行分组，作为实验的第1天，小鼠类风湿性关节造模及治疗如实验分组情况所述，其它操作各组保持一致。在取材当天，即实验的第48天观察小鼠四肢的关节肿胀情况，并对不同组别的小鼠后肢进行拍照对比。
68.相应检测结果如图1所示，可以看出模型组小鼠后肢肿胀状态明显，c
60-ala治疗组并没有明显减轻类风湿性关节炎小鼠后肢肿胀情况，而c
60
混悬剂治疗组能够显著降低类风湿性关节炎小鼠的肿胀程度，使其接近正常小鼠水平。
69.实施例4：c
60
混悬剂抑制类风湿性关节炎小鼠发病程度的效果
70.动物模型：选用7-8周龄的dba/1雄性小鼠，将其随机分成3组，分别对应正常组、模型组和c
60
混悬剂治疗组。
71.胶原佐剂乳化物制备：在无菌的条件下，用1ml的注射器吸取浓度为2mg/ml牛ii型胶原，用另一个1ml的注射器吸取等量佐剂，用两个注射器来回推拉，使牛ii型胶原和佐剂充分混匀，至液体呈乳白色。
72.正常组：第1天尾根部注射200微升生理盐水，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
73.模型组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
74.c
60
混悬剂治疗组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升4mg/ml的c60混悬剂至第48天实验结束。
75.先培养小鼠1周，适应实验室环境，待到小鼠状态稳定后，根据小鼠体重进行分组，作为实验的第1天，小鼠类风湿性关节造模及治疗如实验分组情况所述，其它操作各组保持一致。在给药后每2-3天对小鼠进行关节评分，并且用游标卡尺测量小鼠四只爪子的宽和厚计算小鼠四只爪子截面面积的平均值，直到实验结束。
76.相应检测结果如图2、3所示，从图2可以看出相对于模型组，c
60
混悬剂治疗组能够降低类风湿性关节炎小鼠关节评分，从图3可以看出c
60
混悬剂治疗组能够显著缓解类风湿性关节炎小鼠爪的肿胀情况，证明c
60
混悬剂治疗能够降低小鼠关节肿胀情况，抑制类风湿性关节炎的发病程度。
77.实施例5：c
60
混悬剂抑制类风湿性关节炎小鼠关节的炎症效果
78.动物模型：选用7-8周龄的dba/1雄性小鼠，将其随机分成3组，分别对应正常组、模型组和c
60
混悬剂治疗组。
79.胶原佐剂乳化物制备：在无菌的条件下，用1ml的注射器吸取浓度为2mg/ml牛ii型
胶原，用另一个1ml的注射器吸取等量佐剂，用两个注射器来回推拉，使牛ii型胶原和佐剂充分混匀，至液体呈乳白色。
80.正常组：第1天尾根部注射200微升生理盐水，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
81.模型组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
82.c
60
混悬剂治疗组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升4mg/ml的c60混悬剂至第48天实验结束。
83.先培养小鼠1周，适应实验室环境，待到小鼠状态稳定后，根据小鼠体重进行分组，作为实验的第1天，小鼠类风湿性关节造模及治疗如实验分组情况所述，其它操作各组保持一致。取材后将小鼠的后肢膝关节通过石蜡包埋切片并进行苏木精-伊红(he)染色观察关节处炎症情况。
84.相应检测结果如图4所示，从图中可以看出模型组小鼠关节处炎症细胞大量聚集，炎症浸润情况严重，而c
60
混悬剂治疗组能够显著缓解类风湿性关节炎小鼠炎症细胞浸润情况，抑制炎症浸润程度。
85.实施例6：c
60
混悬剂缓解类风湿性关节炎小鼠关节软骨及骨损伤的效果
86.动物模型：选用7-8周龄的dba/1雄性小鼠，将其随机分成3组，分别对应正常组、模型组和c60混悬剂治疗组。
87.胶原佐剂乳化物制备：在无菌的条件下，用1ml的注射器吸取浓度为2mg/ml牛ii型胶原，用另一个1ml的注射器吸取等量佐剂，用两个注射器来回推拉，使牛ii型胶原和佐剂充分混匀，至液体呈乳白色。
88.正常组：第1天尾根部注射200微升生理盐水，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
89.模型组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升生理盐水至第48天实验结束。
90.c
60
混悬剂治疗组：第1天尾根部注射200微升牛ii型胶原佐剂乳化物，从第28天起每天灌胃200微升4mg/ml的c60混悬剂至第48天实验结束。
91.先培养小鼠1周，适应实验室环境，待到小鼠状态稳定后，根据小鼠体重进行分组，作为实验的第1天，小鼠类风湿性关节造模及治疗如实验分组情况所述，其它操作各组保持一致。取材后将小鼠后肢膝关节通过石蜡包埋切片并进行番红固绿染色，其中嗜碱性的软骨组织与碱性染料番红结合呈现红色，嗜酸性的骨组织和酸性染料固绿结合而呈绿色或蓝色，以便观察小鼠关节软骨和骨的破坏情况。此外，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色观察关节处破骨细胞的数量，其中trap染色使破骨细胞呈红色，用以显示破骨细胞的分布及数量情况。
92.相应检测结果如图5和图6所示，从图5中可以看出模型组小鼠关节软骨和骨均被大面积破坏，骨被侵蚀的情况严重，c
60
混悬剂治疗组能够显著降低类风湿性关节炎小鼠关节软骨和骨的破坏缺失。从图6中可以看出模型组小鼠关节中含有大量破骨细胞，而c
60
混悬剂治疗组能够显著降低类风湿性关节炎小鼠关节处破骨细胞的数量，抑制破骨细胞的产生及聚集，从而减少对软骨和骨的破坏。
93.前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。