一种猪β-防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用

一种猪
β-防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体为一种猪β-防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用。


背景技术：

2.种公猪对猪群繁殖性能有巨大影响。提高种公猪繁殖力是当今畜牧业中突出的核心问题，公猪的繁殖性能取决于其精子的受精能力，而精液中的蛋白成分决定了精子受精能力的高低。精液蛋白作为受精能力标志因素，影响着精子生殖生理过程。精液蛋白作为精子冷冻保存、精液保护和人工授精等精子生物技术提供新思路。探索精清蛋白对公猪精子受精能力的影响及机制，为选育高繁品系种公猪提供便捷方法。
3.猪β防御素129(porcine beta-defensins；pbd129)，是近年来在生殖器官中新发现的猪β-防御素，并且在附睾中高表达。有研究证明pbd129可以抑制肠道炎症来减轻大肠杆菌攻击诱导的感染，表现出免疫调节分子的强大功能和炎症激活。而且在牛中β-防御素129参与了免疫反应和精子成熟，抑制精子表面的β-防御素129蛋白后降低胚胎卵裂率、桑葚胚和囊胚形成率。基于这些结果提示pbd129蛋白可能影响受精和胚胎的形成。但是pbd129蛋白的表达模式和生物学功能仍不清楚。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪β-防御素129 蛋白的制备方法。
5.本发明的另一目的在于，提供一种猪β-防御素129蛋白的多克隆抗体的制备方法。
6.本发明的另一目的在于，提供上述蛋白及其多克隆抗体的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种猪β-防御素129蛋白的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将pbd129基因与pmd18-t载体连接后得到pbd129-18t重组质粒，并转化感受态细胞；
10.(2)从步骤(1)中制备得到的感受态细胞中提取克隆质粒，酶切后得到 pbd129片段，回收后与线性化的pet-28a载体连接，得到pet-28a-pbd129重组质粒，并转化工程菌；
11.(3)将步骤(2)中得到的工程菌进行诱导培养，之后离心、裂解、分离得到猪β-防御素129蛋白。
12.步骤(1)中所述的感受态细胞为dh5α感受态细胞。
13.步骤(2)中所述的工程菌为bl21表达菌。
14.步骤(3)中所述的诱导培养的培养基为含有卡那霉素的lb液体培养基。
15.步骤(3)中所述的诱导培养的条件为35～39℃下培养15～20h，优选为37℃下培养18h。
16.步骤(3)中所述的诱导培养的诱导剂为iptg，优选为终浓度为1mmol/l 的iptg。
17.步骤(3)中所述的离心的条件为2000～4000rpm下离心10～20min，优选为3000rpm下离心15min。
18.步骤(3)中所述的裂解的条件为超声破碎仪破碎菌体。
19.步骤(3)中所述的分离的条件为在3～5℃、10000～15000rpm条件下离心 8～12min，优选为4℃、12000rpm条件下离心10min。
20.一种猪β-防御素129蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
21.s1.取猪β-防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行初次免疫；
22.s2.初次免疫15天后，取猪β-防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第二次免疫；
23.s3.第二次免疫15天后，取猪β-防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第三次免疫；
24.s4.第三次免疫7天后，采集实验动物全血，分离血清得到抗血清；
25.s5.对抗血清进行纯化，得到猪β-防御素129蛋白多克隆抗体。
26.步骤s1中所述的佐剂为弗氏完全佐剂。
27.步骤s2中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。
28.步骤s3中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。
29.所述的猪β-防御素129蛋白与弗氏完全佐剂混合后，猪β-防御素129蛋白的浓度为0.8～1.2μg/μl，优选为1μg/μl。
30.所述的混合为充分乳化。
31.步骤s4中所述的纯化为使用层析柱纯化，优选为使用protein a/g-sepharose 层析柱纯化。
32.所述的猪β-防御素129蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
33.一种猪β-防御素129蛋白多克隆抗体，通过上述制备方法制备得到。
34.所述的猪β-防御素129蛋白多克隆抗体在选育高繁品系种公猪中的应用。
35.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
36.针对现有技术中存在的难以表达猪pbd129蛋白表达的问题，本发明设计了一种猪pbd129蛋白的原核表达纯化与多克隆抗体制备的研究方法。通过本方法确定了：
37.(1)pbd129蛋白在pet-28a载体且在37℃、iptg浓度1.0mm、诱导18h 的条件下获得表达，该方法易于大量制备，操作简单；
38.(2)确定了pbd129重组蛋白以可溶性及包涵体表达并在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的胶图上可以观察到单一的目标蛋白条带；
39.(3)制备的pbd129多克隆抗体具有特异性；本方法为日后研究猪pbd129 蛋白在生殖中的作用机制和蛋白功能的领域提供原始材料以及科研数据。
附图说明
40.图1是猪β-防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备步骤示意图。
41.图2是重组菌bl21-pet-28a-pbd129的sds-page鉴定结果图，其中m泳道为marker；1号泳道为重组菌未诱导前；2号泳道为重组菌经iptg诱导后。
42.图3是重组菌bl21-pet-28a-pbd129的菌液蛋白western blot鉴定结果图，其中m
泳道为marker；1号泳道为重组菌诱导后细菌裂解液上清；2号泳道为重组菌诱导后包涵体。
43.图4是纯化后的重组pbd129蛋白的sds-page鉴定结果图。
44.图5是重组pbd129蛋白的液质联用所得数据使用mascot软件与数据库数据比对的结果图。
45.图6是重组pbd129蛋白的质谱鉴定结果图。
46.图7是图pbd129多克隆抗体特异性鉴定结果图，其中m泳道为蛋白 marker；1号泳道为转染pcdna3.1-pdb129-hek239t细胞上清；2号泳道为转染空载pcdna3.1-hek293t细胞上清；3号泳道为空白hek293t细胞上清。
具体实施方式
47.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
48.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
49.实施例1
50.pbd129基因扩增及原核表达质粒的构建
51.pbd129基因的cds核苷酸序列如seq id no:1所示，根据该序列设计引物，引物设计时，去除信号肽序列和终止子，并在引物上游加入ndei酶切位点与保护碱基，在引物下游加入xboi酶切位点和保护碱基，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。
52.引物序列：
53.pbd129-f：cgccatatgatggaatactttggcttgggaag
54.pbd129-r：ccgctcgagagtcatgctgtcggcagggt
55.按照天根生物公司动物组织总rna提取试剂盒操作说明书进行对采集的公猪附睾组织提取rna。以抽提的rna为模板，根据takara反转录试剂盒 primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser操作说明反转录为cdna。用先前合成的引物进行cdna扩增。电泳后对目的片段参照凝胶回收试剂盒进行胶回收，将回收产物使用紫外分光光度计测算浓度后，放-20℃保存。
56.根据载体与目的基因的摩尔浓度标准体系比例1：4连接pmd18-t载体 (pmd18-t载体购自日本takara公司，载体连接体系：pmd 18-t vector：1μl； solution i：5μl；回收产物：4μl；16℃过夜连接)与回收产物得到pbd129-18t 重组质粒。之后使用得到的pbd129-18t重组质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，提取pbd129-18t克隆质粒并用pcr扩增后测序对进行鉴定。
57.将得到的pbd129-18t克隆质粒和pet-28a质粒双酶切后(载体来源于实验室保存，双酶切体系：pbd-18t重组质粒：4μg；ndei：4μl；xboi：4μl；10
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buffer： 4μl；ddh2o：加至40μl。将上述混合液在37℃下酶切4h)得到pbd129片段及线性化的pet-28a载体，将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，获得的 dna片段放-20℃保存备用。将pbd129片段及pet-28a质粒的线性化产物用t4连接酶连接，放置过夜。使用连接得到的pet-28a-pbd129重组质粒转化bl21表达菌后，得到bl21-pet-28a-pbd129工程菌，提取质粒使用pcr鉴定阳性
菌落。将阳性菌落送样测序并保存菌种，测序结果证明实验成功得到了转入pdb129基因的bl21-pet-28a-pbd129工程菌。
58.实施例2
59.pbd129蛋白的诱导培养表达及sds-page凝胶电泳和western blot试验验证
60.将实施例1中制备得到的bl21-pet-28a-pbd129工程菌接种在含有卡那霉素的lb液体培养基过夜培养进行复苏；取1ml复苏好的菌液加入1l含有卡那霉素的lb液体培养基培养至od600值0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/l 的iptg诱导剂37℃下诱导表达18h；将上述诱导好的菌液分装在50ml离心管中，放置入离心机在3000rpm转速下离心15min，倒掉上清培养基后并收集菌体；清洗菌体两遍后加入8ml 1
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pbs重新悬浮菌体后，在冰水混合液冰浴条件下用超声破碎仪破碎菌体；将破碎的菌体在4℃、12000rpm条件下离心10 min并分别收集上清液和沉淀物，沉淀物用8mol/l尿素溶液充分溶解。分别取 25μl的上清液和沉淀溶解液进行sds-page凝胶电泳蛋白考马斯亮蓝染色分析和western blot验证。
61.实验结果如图3所示，结果显示发现在约21kda处有明显条带，与预期大小相符，初步可以认定诱导出的即为目标蛋白。将诱导破碎后的bl21菌体分离出可溶性蛋白和包涵体，western blot后发现，在非包涵体和包涵体中均能够检测到目的蛋白的表达，表明pbd129蛋白以可溶性蛋白和包涵体蛋白两种形式表达。
62.实施例3
63.pbd129蛋白纯化与鉴定
64.将ni-nta agarose树脂加进合适的底部有盖子的色谱柱中；把底部的盖子拿掉，使树脂中的乙醇流出，再加入5ml 20％的乙醇冲洗两次，将树脂重新沉淀在色谱柱的底部中；加入5ml的裂解液平衡树脂，打开盖子待液体自然流出，重复一次；缓慢加入10ml实施例2中菌体离心得到的上清液，注意控制加样速度，确保目的蛋白与树脂充分接触，以提高纯化效率，将色谱柱放在旋转混合器中缓慢混匀30min，结束后打开盖子待液体自然流出；加入3ml蛋白洗涤液，将树脂重悬，让蛋白洗涤液充分与树脂接触，静置5min；树脂自然沉淀，打开盖子待液体流出，第二次缓慢加入洗涤液，静置5min，重复一遍；加入蛋白洗脱液1ml，缓慢加入，静置5min，打开盖子待洗脱液自然流出，收集洗脱液，重复6次；收集的蛋白洗脱液装入透析袋放在pbs中透析12h，透析重复3次；用sds-page做蛋白质谱鉴定，结果如图4所示。
65.使用bca试剂盒检测纯化后重组蛋白的浓度为0.39mg/ml。样品采用 lc-ms/ms做质谱检测，根据样品物种来源从uniprot下载对应物种的蛋白质组数据库，使用mascot、maxquant、proteome discoverer、peaks等软件将液质联用得到的数据与数据库中数据进行匹配，通过肽段的一级和二级碎片的质量在数据库中找到匹配的蛋白质，结果如图5～6所示，结果表明鉴定样品中的蛋白质为pbd129蛋白。
66.实施例4
67.多克隆抗体的制备
68.balb/c小鼠购自广东省实验动物中心，小鼠在动物房饲养三天以适应环境。免疫时首次免疫取100μg蛋白与100μl弗氏完全佐剂，之后几次免疫取50μg 蛋白与50μl弗氏不完全佐剂充分乳化，将蛋白和佐剂混匀在振荡器上震荡检测乳化程度，滴在水中呈滴状不扩散为止。初次免疫取100μg蛋白使用100μl弗氏完全佐剂充分乳化后颈背部皮下多点注
射；二次及三次免疫取50μg蛋白使用 50μl弗氏不完全佐剂充分乳化后颈背部皮下多点注射，具体免疫程序如表1所示；第三次免疫后7天，断尾采血获取少量全血，放4℃过夜，第二天3000 rpm/min离心5分钟分离血清，使用elisa法检测抗血清效价，结果如表1所示，结果显示本次制备的抗血清效价在104以上，表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性。免疫程序结束后，眼球采血法取全血，分离血清后用于抗体纯化制备多克隆抗体。
69.血清纯化步骤：protein a/g-sepharose柱亲和纯化
70.取适量的蛋白a/g-sepharose的乙醇悬浮液，静置等胶沉淀后吸去上层乙醇，再用缓冲液多次悬浮胶沉淀彻底洗去乙醇；将缓冲液与蛋白a/g混合成50～ 70％的浆状物，把浆状物倒入柱内；连接蠕动泵，以50cm/h的速率装柱，待柱体完全沉降后，继续用5～10倍体积的结合缓冲液清洗柱体；取血清进行0.45μm 孔径过滤器过滤后使用0.01m pbs ph7.2稀释5倍；将缓冲好的抗体样品以0.4 ml/min流速加入亲和柱内；样品进入介质后，将流速调低至0.7ml/min，继续用10倍体积缓冲液清洗；保持速率不变，换洗脱缓冲液洗脱结合在柱中的抗体，洗脱液以2ml为洗脱组分分部收集(2ml/管)。收集试管中要加入0.1ml中和缓冲液，以便及时中和洗脱所得抗体液的ph值；检测每管的a280，当a280＜ 0.05时停止洗脱，汇集a280大于等于0.2的峰组分；之后装入透析袋在pbs中透析。
71.表1 pbd129蛋白对balb/c小鼠的免疫程序
[0072][0073]
表2免疫pbd129蛋白小鼠的血清效价检测
[0074][0075]
实施例5
[0076]
多克隆抗体特异性鉴定
[0077]
猪pdb129基因(genbank登录号：nm_001129975.1)由生工生物技术有限公司(中国广州)合成并克隆到pcdna3.1( )的bamhi/xhoi位点得到 pcdna3.1-pbd129质粒。使用lipofectamine3000(invitrogen)将 pcdna3.1-pbd129质粒转染至hek293t细胞。空pcdna3.1质粒也转染到 hek293t中用作阴性对照，未转染的hek293t用作空白对照。转染或未转染的293t细胞在转染后24～48小时参照western blot试验检测。
[0078]
利用实施例4中制备的纯化后的pbd129多抗使用western blot试验检测转染后的hek293t细胞培养液，验证pbd129多抗是否能检测pbd129天然蛋白。结果如图7所示，实验组在30kda有单一的条带，而阴性对照组和空白组均没有，证明制备的pbd129多抗能特异检测pbd129天然蛋白。
[0079]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。