用于分析AAV衣壳蛋白的方法与流程

用于分析aav衣壳蛋白的方法
1.相关申请交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求于2020年1月03日提交的美国临时申请第62/956,681号、于2020年9月01日提交的美国临时申请第63/073,188号和于2020年12月01日提交的美国临时申请第63/119,909号的权益，所述美国临时申请中的每个临时申请的内容均以全文引用的方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及用于使用液相色谱和质谱来表征腺相关病毒(aav)颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白以及aav组合物的纯度的方法。


背景技术：

4.腺相关病毒(aav)正迅速成为用于递送基因疗法的最广泛使用的媒剂之一。出色的安全特性以及广泛靶组织转导的高效率已经使aav成为基因疗法的最广泛使用的平台。aav是属于细小病毒科的小病毒。所述病毒由非包膜二十面体衣壳构成，所述非包膜二十面体衣壳含有约4.7个千碱基的线性单链dna基因组。aav通常在合适的宿主细胞中重组表达。然而，重组aav可能被来自宿主细胞裂解物中的蛋白质所污染。
5.aav衣壳包含vp1、vp2和vp3蛋白的混合物，所述蛋白质由单病毒cap基因通过交替剪接和翻译产生，并且自组装以形成衣壳。aav衣壳蛋白在病毒感染性、组织嗜性和效力方面发挥着重要作用，并且完全表征衣壳蛋白的质量和比率的能力对于用于基因疗法的aav的商业化制造越来越重要。
6.特别是，vp的化学计量对于病毒载体的感染性至关重要。例如，高水平的vp3衣壳与不良的转导效率和降低的效力负相关，即使在vp1/vp2比率不平衡的情况下也是如此。(《基因疗法(gene therapy)》第25卷,第415-424页(2018))。由于结构蛋白vp1、vp2和vp3的比率从制造开始可能大范围内波动，例如1:1:5到1:1:20(《生物技术进展(biotechnol adv.)》,26(1):73-88(2008))，因此在aav载体质量控制中，准确测量三种衣壳蛋白之间的比率很重要。然而，目前的方法试图测量衣壳蛋白的质量，但未能测定vp中的每种vp的化学计量(wo 2018/035059)。因此，基因疗法行业需要鲁棒的用于更准确地表征aav衣壳蛋白的比率和修饰以及raav组合物的纯度的方法。


技术实现要素：

7.本公开提供了使用液相色谱和质谱来表征腺相关病毒(aav)颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的方法。本文公开的方法用于测定aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率和/或所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。
8.在一些方面，本公开提供了一种用于测定腺相关病毒(aav)颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率的方法。所述方法包含以下步骤：在约70℃到约90℃下
使所述aav颗粒经受液相色谱，其中通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量和比率。在一些方面，通过质谱测定所述衣壳蛋白的单独质量。在一些方面，所述aav颗粒上的衣壳在所述液相色谱的柱上变性为单独的vp1、vp2和vp3蛋白。在一些方面，通过所述液相色谱来分离所述衣壳蛋白。
9.在一些方面，所述方法进一步包含使用质谱测定所述aav颗粒中所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。
10.在一些方面，通过分析所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白的紫外(uv)色谱图测定所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白的相对量。在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱。在一些方面，所述aav颗粒为aavrh74。
11.在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包括含三氟乙酸的水。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含三氟乙酸的乙腈和水的混合物。在一些方面，第一流动相和第二流动相的组合中第二流动相在色谱中的百分比随时间的推移而增加。
12.在一些方面，所述质谱包含约125-350v的碎裂电压。
13.脱酰胺化为在蛋白质中观察到的常见翻译后修饰(ptm)之一，其已知对蛋白质的活性和稳定性具有显著影响。脱酰胺化通常是由天冬酰胺的酰胺侧链水解以形成天冬氨酸和异天冬氨酸的混合物引起的。在一些方面，所述脱酰胺化是胞嘧啶水解反应为尿嘧啶，从而在此过程中释放氨。这可以在体外通过使用亚硫酸氢盐发生，所述亚硫酸氢盐使胞嘧啶脱氨，但不会使5-甲基胞嘧啶脱氨。在一些方面，5-甲基胞嘧啶脱酰胺化会产生胸腺嘧啶和氨。在一些方面，谷氨酰胺残基也会经历脱酰胺化以形成谷氨酸和异谷氨酸的混合物，然而相比于天冬酰胺，谷氨酰胺残基显著不太易于进行脱酰胺化。在一些方面，鸟嘌呤脱酰胺化会导致黄嘌呤形成。在一些方面，腺嘌呤脱酰胺化会导致次黄嘌呤形成。衣壳蛋白脱酰胺化可能影响aav调配物的稳定性和活性。
14.在本公开的一些方面，使用质谱来研究如脱酰胺化等翻译后修饰。在一些方面，可以使用如胍和脲等试剂使蛋白质变性。使用1,4-二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧基乙基)膦(tecp)来使经变性的蛋白质还原以打破二硫键。然后使用碘乙酰胺对经还原的二硫键进行烷基化。进行变性和烷基化步骤以确保蛋白质未进行折叠并因此可完全用于蛋白酶。然后使用几种蛋白酶之一，如胰蛋白酶来消化经变性且经还原的蛋白质。使用rp-hplc在hplc/uplc上分离经消化的肽。然后使用m/z比在质谱仪，通常为q-tof或轨道阱(orbitrap)，上检测经分离的肽。使用适当的软件和数据库，对肽进行鉴定。脱酰胺化被鉴定为比肽的理论值增加了大约1da。
15.在一些方面，所述方法进一步包含测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的至少一种的翻译后修饰。在一些方面，所述方法进一步包含vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的至少一种的翻译后磷酸化或乙酰化。
16.本公开还提供了一种表征aav组合物中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括从所述组合物中免疫沉淀病毒衣壳蛋白；消化残余宿主细胞蛋白；以及用液相色谱四极杆飞行时间质谱(lc-qtof-ms)分析经消化的蛋白质以鉴定宿主细胞蛋白。
17.在一些方面，所述免疫沉淀包括将所述aav组合物与抗aav vp1抗体、抗aav vp2抗体、抗aav vp3抗体或其组合一起温育。
18.在一些方面，所述方法进一步包括用迭代ms/ms分析所述经消化的宿主细胞蛋白。
19.在一些方面，所述消化在溶液中完成。在一些方面，所述消化在约60℃到约80℃的温度下进行。在一些方面，所述消化在约70℃下进行。
20.在一些方面，所述方法进一步包括向所述aav组合物中掺入已知量的至少一种已知蛋白质标准品。在一些方面，所述至少一种已知蛋白质标准品为人或牛蛋白质标准品。在一些方面，所述方法进一步包括相对于所述至少一种蛋白质标准品，对所述经消化的宿主细胞蛋白的量进行定量。
21.在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱。在一些方面，使用c18柱、c8柱或c4柱进行所述反相液相色谱。在一些方面，使用c8柱进行所述液相色谱。在一些方面，所述柱包括约1.2-3.5μm的颗粒。在一些方面，所述柱包括约1.7μm或约1.8μm的颗粒。在一些方面，所述柱为约50mm到约300mm长，并且其内径为约1mm到约4.6mm。在一些方面，所述柱为约150mm长，并且其内径为约2.1mm。
22.在一些方面，在约40℃到约50℃下进行所述液相色谱。在一些方面，在约45℃下进行所述液相色谱。
23.在一些方面，所述液相色谱包括第一流动相，所述第一流动相包括甲酸。在一些方面，所述第一流动相包括约0.05体积％到约0.15体积％的甲酸。在一些方面，所述第一流动相包括约0,1体积％的甲酸。
24.在一些方面，所述液相色谱包括第二流动相，所述第二流动相包括含甲酸的乙腈和水的混合物。在一些方面，所述第二流动相包括约0.05体积％到约0.15体积％的甲酸。在一些方面，所述第二流动相包括约0.1体积％的甲酸。在一些方面，所述第二流动相包括约80-95体积％的乙腈。在一些方面，所述第二流动相包括约90体积％的乙腈和约10体积％的水。
25.在一些方面，与所述第一流动相和所述第二流动相的组合相比，所述第二流动相在所述液相色谱中的百分比随时间的推移而增加。在一些方面，所述第二流动相的百分比从约2％增加到约50％。在一些方面，所述第二流动相的百分比在约120分钟内从约2体积％增加到约50体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后在约25分钟内增加到100体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后维持在100体积％持续约一分钟。在一些方面，所述第二流动相随后在约4分钟内减少到约2体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后在约5分钟内增加到100体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后维持在100体积％持续约3分钟。在一些方面，所述第二流动相随后在约2分钟内减少到约2体积％。
26.在一些方面，使用约125-350v的碎裂电压进行质谱。在一些方面，使用约135v的碎裂电压进行质谱。在一些方面，使用约3-6kv的毛细管电压进行质谱。在一些方面，使用约4kv的毛细管电压进行质谱。
27.本公开的一些方面涉及一种重组aav(raav)，所述raav包括衣壳蛋白的异质群组，所述衣壳蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群。在一些方面，所述修饰为脱酰胺化或氧化。
28.在一些方面，所述异质群组包括位于aav.rh74的n57、n255、n256和n263或aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 13或aavrh10的等效残基中的一个或多个处的经脱酰胺化的天冬酰胺(n)，如通过质谱和/或紫外(uv)-可见
光光谱测量的。在另一实施例中，所述异质群组包括seq id no:1-5中的任一个的肽序列或所述肽序列的其它aav血清型的等效肽序列内的经脱酰胺化的天冬酰胺(n)。
29.在一些方面，所述异质群组包括小于70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％的具有位于aav.rh74衣壳的n57处的脱酰胺化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于15％的具有位于aav.rh74衣壳的n57处的脱酰胺化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％的具有位于aav.rh74衣壳的n254和/或n255处的脱酰胺化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％的具有位于n263处的脱酰胺化的衣壳蛋白。
30.在一些方面，所述异质群组包括位于aav.rh74的m437、m473、m526、m544、m560和m637或aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、caav11、aav12、aav 13或aavrh10的等效残基中的一个或多个处的经氧化的甲硫氨酸，如通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测量的。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或1％的具有位于m437处的氧化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或1％的具有位于m473处的氧化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或3％的具有位于m526处的氧化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或2％的具有位于m544处的氧化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或2％的具有位于m560处的氧化的衣壳蛋白。在一些方面，所述异质群组包括小于30％、20％、10％、5％或1％的具有位于m637处的氧化的衣壳蛋白。
31.本领域的技术人员将意识到，本文所描述的本发明受制于除具体描述的那些变化和修改之外的变化和修改。应当理解的是，本文所描述的本发明包含所有此类变化和修改。本发明还包含在本说明书中单独地或共同地参考或指示的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及步骤或特征中的任何两个或更多个的任何组合和所有组合。
附图说明
32.以下附图构成本说明书的一部分并且被包含在内以进一步展示本发明的各方面。
33.图1描绘了aavrh74衣壳蛋白的uv色谱图，其中积分确认了衣壳蛋白比率。
34.图2描绘了aavrh74衣壳蛋白的总离子色谱图。
35.图3分别示出了vp1(图3a)、vp2(图3b)和vp3(图3c)衣壳蛋白的解卷积的ms谱，从而确认了所有三种衣壳蛋白的完整质量以及对衣壳蛋白的翻译后修饰的检测。图3d示出了多个样品中的vp1的解卷积的ms谱。图3e示出了多个样品中的vp2的解卷积的ms谱。图3f示出了多个样品中的vp3的解卷积的ms谱。
36.图4示出了以tris-hcl作为缓冲液进行脱酰胺化分析的过程。
37.图5示出了用tris-hcl缓冲液对aav.rh74进行脱酰胺化的结果。
38.图6示出了用tris-hcl缓冲液对aav.rh74进行氧化的结果。
具体实施方式
39.提供了用于使用液相色谱、质谱或紫外(uv)-可见光光谱来表征腺相关病毒(aav)
颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的方法。在一些方面，提供了用于测定aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率和/或vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量的方法。本公开还提供了用于使用液相色谱和质谱来表征raav组合物的纯度的方法。
40.定义
41.为了方便起见，在进一步描述本发明之前，在此收集了说明书、实例和所附权利要求中所使用的某些术语。这些定义应根据本公开的其余部分阅读并且如本领域的技术人员所理解的那样理解。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非另外在具体实例中有所限制，否则贯穿本说明书所使用的术语定义如下。
42.使用冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”来指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。
43.如本文所使用的，“约”用于表示值包含装置、用于测定所述值的方法的固有误差变化，或者研究受试者间存在的变化。在一些方面，“约”表示给定值或范围的5％到10％以上(例如，至多5％到10％以上)和5％到10％以下(例如，至多5％到10％以下)的偏差仍在所述值或范围的预期含义内。
44.术语“aav”或“腺相关病毒”是指病毒的细小病毒属内的依赖性细小病毒。在此，aav可以指野生型病毒或衍生自天然存在的野生型病毒的aav，例如，衍生自包装到衍生自被天然存在的cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的raav基因组和/或包装到衍生自被非天然衣壳cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的raav基因组的aav，例如aavrh.74。
45.aav可以是任何血清型，例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav-10、aav-11、aav-12、aav-13、aav rh.10、aav rh.74或其变体和衍生物。在一些方面，raav具有血清型aavrh.74。假型raav的产生在例如wo 01/83692中公开，所述文献通过引用以其整体并入。还设想了其它类型的raav变体，例如具有衣壳突变的raav。参见例如marsic等人,《分子疗法(molecular therapy)》，22(11):1900-1909(2014)。
46.如本文所用，术语“aav颗粒”、“aav载体”、“aav病毒体”、“aav病毒颗粒”或“aav载体颗粒”用于指代由aav衣壳和包裹的aav基因组构成的病毒颗粒。在一些方面，aav颗粒包括异源性多核苷酸(即如要递送给哺乳动物细胞的转基因等野生型aav基因组以外的多核苷酸)。在一些方面，aav病毒颗粒的产生包含产生aav载体，因为aav载体颗粒中含有此类载体。
47.例如，野生型(wt)aav病毒颗粒包括与aav衣壳蛋白衣壳涂层相关联的线性单链aav核酸基因组。所述aav病毒体可以是单链(ss)aav或自补(sc)aav。在一些方面，具有互补意义的单链aav核酸分子，例如“有义”或“反义”链，可以被包装到aav病毒体中，并且两个链是同等感染性的。
48.术语“重组aav”或“raav”在本文被定义为由aav蛋白外壳构成的感染性复制缺陷型病毒，所述aav蛋白壳包封aav itr侧接在两侧的所关注异源性核苷酸序列。在一些方面，raav产生于合适的宿主细胞中，所述宿主细胞具有aav载体、aav辅助功能以及引入其中的附属功能。以此方式，宿主细胞能够编码aav多肽，所述aav多肽是将aav载体(含有所关注重组核苷酸序列)包装到感染性重组病毒体颗粒中以供后续基因递送所需要的。
49.如本文所用，术语“衣壳蛋白”是指形成病毒的涂层或外壳的蛋白质。术语“aav衣壳蛋白”是指形成腺相关病毒(aav)的涂层的蛋白质，所述aav由总共60个亚基构成；每个亚基是一个氨基酸序列，例如病毒蛋白1(vp1)、vp2或vp3。
50.如本文所用，术语“液相色谱(lc)”是指用于分离、识别和定量混合物中的组分的技术。在柱液相色谱中，液体流动相穿过柱，并且流动相的组分与固体固定相相互作用。在分离运行期间可以改变流动相的组成，以改变所关注化合物的相互作用的强度。在流动相继续流过柱时，典型地以级分的形式收集洗脱液，同时监测随着时间的推移从柱中洗脱的化合物的浓度，以产生洗脱曲线或色谱图。
51.如本文所用，术语“固定相”是指保持固定在柱中的物质。最常用的固定相柱为碳链结合的二氧化硅、苯基结合的二氧化硅和氰基结合的二氧化硅。在一些方面，固定相可以包含特定长度的疏水性烷基链，如c4、c8或c18。在一些方面，反相色谱为c8反相色谱(例如，利用c8固定相的反相色谱)。
52.如本文所用，术语“流动相”是指用于从柱中洗脱化合物的水、溶剂或水和溶剂的混合物。最常见的流动相溶剂包含但不限于乙腈、甲醇、四氢呋喃、乙醇或异丙醇等。在一些方面，使用了两种流动相。例如，第一流动相和第二流动相可以原位混合，以获得用于从柱中洗脱物质的溶剂。在一些方面，第二流动相与第一流动相的体积比呈在洗脱步骤中增加的梯度。
53.如本文所用，术语“质谱”或“ms”是指测量离子的质荷(m/z)比，以鉴定和定量简单和复杂混合物中的分子的分析技术。ms技术总体上包含：(1)对化合物进行电离以形成带电化合物；以及(2)检测带电化合物的质荷比并计算分子量。可以通过任何合适的方式对化合物进行电离和检测。“质谱仪”总体上包含电离器、质量分析器和离子检测器。通常，对一种或多种所关注分子进行电离，并且随后将离子引入到质谱仪器中，在所述质谱仪器中，由于磁场和电场的组合，离子在空间中遵循某个路径，所述路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。在一些质谱方法中，可以使用例如飞行时间(tof)、轨道阱、傅里叶变换离子回旋共振光谱仪、四极杆或离子阱将离子彼此分离，并然后使用离子检测器进行检测。
54.如本文所用，术语“紫外-可见光光谱”、“紫外-可见光分光光度法”、“uv-vis”或“uv/vis”是指用于测定液体和固体的光学性质(透射率、反射率和吸光度)的吸收光谱或反射光谱。在一些方面，紫外-可见光光谱用于表征aav颗粒的衣壳蛋白。
55.如本文所用，术语“总离子色谱图(tic)”是指通过将属于同一扫描的所有质谱峰的强度汇总而产生的一种类型的色谱图。
56.如本文所用，术语“aavrh74”是指具有aavrh74 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白或其变体的aav颗粒。美国专利第9,909,142的seq id no:4中列出了示例性aavrh74 vp1衣壳蛋白序列，所述美国专利通过引用以其整体在此并入。美国专利第9,909,142中还列出了aavrh74 vp1衣壳蛋白的示例性变体。
57.如本文所用，除非另有说明，否则术语vp蛋白的“亚群”是指vp蛋白的群组，所述群组具有至少一个限定的共同特性，并且由至少一个群组成员到少于参考群组的所有成员组成。例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群”可以为至少一种vp1蛋白并且可以少于组装的aav衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群”可以为至少一种vp3蛋白到少于组装的aav衣壳中的所有vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以为vp蛋白的亚群；vp2蛋白可
以为vp蛋白的单独亚群，并且vp3为组装的aav衣壳中的vp蛋白的仍另外的亚群。在另一实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可以含有，例如，在天冬酰胺-甘氨酸对处具有不同修饰，例如，至少一种、两种、三种或四种经高度脱酰胺化的天冬酰胺的亚群。
58.表征aav vp1、vp2和vp3衣壳蛋白
59.在一些方面，本公开提供了一种用于表征腺相关病毒(aav)颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的方法，所述方法包括在约70℃到约90℃下使所述aav颗粒经受液相色谱，其中通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量和比率。在一些方面，通过质谱和紫外(uv)-可见光光谱测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量和比率。在一些方面，所述aav颗粒上的衣壳在所述液相色谱的柱上变性为单独的vp1、vp2和vp3蛋白。在一些方面，通过所述液相色谱来分离所述衣壳蛋白。在一些方面，所述方法包含：(a)使所述aav颗粒经受液相色谱以分离所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白；以及(b)使在步骤(a)中产生的经分离的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白经受质谱和/或紫外-可见光光谱，以测定所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白的相对量，由此测定所述aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率。在一些方面，所述液相色谱操作在约70℃到约90℃下进行。在一些方面，所述液相色谱在约70℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃或90℃下进行。在一些方面，所述液相色谱操作在约80℃下进行。
60.在一些方面，所述方法进一步包含测定所述aav颗粒的所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。
61.在一些方面，通过比较所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白的总离子色谱图(tic)测定所述vp1衣壳蛋白、所述vp2衣壳蛋白和所述vp3衣壳蛋白的相对量。
62.在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水性相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱。
63.在一些方面，使用c18柱、c8柱或c4柱进行所述反相色谱。在一些方面，使用c8柱进行所述液相色谱。
64.在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含在约50-300mm长并且内径为约1-4.6mm的色谱柱内。在一些方面，所述柱为beh柱。在一些方面，所述柱的内径为1mm、2.1mm、3mm或4.6mm。在一些方面，所述柱的长度为50mm、75mm、100mm、150mm或300mm。在一些方面，柱尺寸为1mm
×
50mm、2.1mm
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50mm、3mm
×
50mm、4.6mm
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50mm、1mm
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75mm、2.1mm
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75mm、3mm
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75mm、4.6mm
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75mm、1mm
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100mm、2.1mm
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100mm、3mm
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100mm、4.6mm
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100mm、1mm
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150mm、2.1mm
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150mm，3mm
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150mm、4.6mm
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150mm、1mm
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300mm、2.1mm
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300mm、3mm
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300mm或4.6mm
×
300mm。在一些方面，柱尺寸为1.6
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50mm、1.6
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60mm、1.6
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70mm、1.6
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80mm、1.6
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90mm、1.6
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100mm、1.6
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110mm、1.6
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120mm、1.6
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130mm、1.6
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140mm、1.6
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150mm、1.7
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50mm、1.7
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60、1.7
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70mm、1.7
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80mm、1.7
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90mm、1.7
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100mm、1.7
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110mm、1.7
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120mm、1.7
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130mm、1.7
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140mm、1.7
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150mm、1.8
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50mm、1.8
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60mm、1.8
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70mm、1.8
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80mm、1.8
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90mm、1.8
×
100mm、1.8
×
110mm、1.8
×
120mm、1.8
×
130mm、1.8
×
140mm、1.8
×
150mm、1.9
×
50mm、1.9
×
60mm、1.9
×
70mm、1.9
×
80mm、1.9
×
90mm、1.9
×
100mm、1.9
×
110mm、1.9
×
120mm、1.9
×
130mm、1.9
×
140mm、1.9
×
150mm、2.0
×
50mm、2.0
×
60mm、2.0
×
70mm、2.0
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80mm、2.0
×
90mm、2.0
×
100mm、2.0
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110mm、2.0
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120mm、2.0
×
130mm、2.0
×
140mm、2.0
×
150mm、2.1
×
50mm、2.1
×
60mm、2.1
×
70mm、2.1
×
80mm、2.1
×
90mm、2.1
×
100mm、2.1
×
110mm、2.1
×
120mm、2.1
×
130mm、2.1
×
140mm、2.1
×
150mm、2.2
×
50mm、2.2
×
60mm、2.2
×
70mm、2.2
×
80mm、2.2
×
90mm、2.2
×
100mm、2.2
×
110mm、2.2
×
120mm、2.2
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130mm、2.2
×
140mm、2.2
×
150mm、2.3
×
50mm、2.3
×
60mm、2.3
×
70mm、2.3
×
80mm、2.3
×
90mm、2.3
×
100mm、2.3
×
110mm、2.3
×
120mm、2.3
×
130mm、2.3
×
140mm、2.3
×
150mm、2.4
×
50mm、2.4
×
60mm、2.4
×
70mm、2.4
×
80mm、2.4
×
90mm、2.4
×
100mm、2.4
×
110mm、2.4
×
120mm、2.4
×
130mm、2.4
×
140mm、2.4
×
150mm、2.5
×
50mm、2.5
×
60、2.5
×
70mm、2.5
×
80mm、2.5
×
90mm、2.5
×
100mm、2.5
×
110mm、2.5
×
120mm、2.5
×
130mm、2.5
×
140mm、2.5
×
150mm、2.6
×
50mm、2.6
×
60mm、2.6
×
70mm、2.6
×
80mm、2.6
×
90mm、2.6
×
100mm、2.6
×
110mm、2.6
×
120mm、2.6
×
130mm、2.6
×
140mm或2.6
×
150mm。在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含在约100mm长并且内径为约2.1mm的色谱柱内。
65.在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包括大小设定在约1.2μm-2.5μm之间的颗粒。另一方面，所述反相液相色谱的固定相包括大小为约1.7μm、1.8μm或2.1μm的颗粒。在一些方面，颗粒大小为约1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm或2.5μm。在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含约1.7μm的颗粒。
66.在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包括含经氟取代的乙酸的水。所述经氟取代的乙酸包含单氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包括含三氟乙酸的水。
67.在一些方面，所述第一流动相包含约0.05体积％到约0.15体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第一流动相包括约0.05体积％、0.06体积％、0.07体积％、0.08体积％、0.09体积％、0.1体积％、0.11体积％、0.12体积％、0.13体积％、0.14体积％、0.15体积％、0.16体积％、0.17体积％、0.18体积％、0.19体积％或0.2体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第一流动相包含约0.05体积％或0.1体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第一流动相包含约0.1体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述经氟取代的乙酸为三氟乙酸。在一些方面，所述第一流动相包含约0.1体积％的三氟乙酸。
68.在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含经氟取代的乙酸的乙腈。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含三氟乙酸的乙腈。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含经氟取代的乙酸的乙腈和水的混合物。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含三氟乙酸的乙腈和水的混合物。
69.在一些方面，所述第二流动相包含约0.05-0.2体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第二流动相包含约0.05-0.15体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第二流动相包含约0.05体积％、0.06体积％、0.07体积％、0.08体积％、0.09体积％、0.1体积％、0.11体积％、0.12体积％、0.13体积％、0.14体积％、0.15体积％、0.16体积％、0.17体积％、0.18体积％、0.19体积％或0.2体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第二流动相包括约0.05体积％或0.1体积％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述第二流动相包含约0.1％的经氟取代的乙酸。在一些方面，所述经氟取代的乙酸为三氟乙酸。在一些方面，所述
第二流动相包含约0.1％的三氟乙酸。
70.在一些方面，所述第二流动相包含约75-95体积％的乙腈。在一些方面，所述第二流动相包含约75体积％、80体积％、85体积％、90体积％或95体积％的乙腈。在一些方面，所述第二流动相包含约90体积％的乙腈和10％的水。
71.在一些方面，第一流动相和第二流动相的组合中第二流动相在色谱中的百分比随时间的推移而增加。在一些方面，第二流动相的百分比从约10体积％增加到约40体积％。在一些方面，第二流动相的百分比从约10体积％增加到约45体积％。在一些方面，第二流动相的百分比从约10体积％增加到约100体积％。在一些方面，第二流动相的百分比在约30-40分钟内从约10％增加到约45％。在一些方面，第二流动相的百分比在约35分钟内从约10％增加到约45％。在一些方面，第二流动相的百分比在约30-50分钟内从约10体积％增加到约100体积％。在一些方面，第二流动相的百分比在约36分钟内从约10体积％增加到约100体积％。
72.在一些方面，第二流动相的百分比在约5-10分钟内从约10体积％增加到约40体积％，在约25-35分钟内从约40％增加到约45％。在一些方面，第二流动相的百分比在约0.5-2分钟内从约45％增加到约100％。在一些方面，第二流动相的百分比在约0.5-2分钟内从约100％减小到约10％。
73.在一些方面，第二流动相的百分比在约6分钟内从约10体积％增加到约40体积％，在约29分钟内从约40％增加到约45％。在一些方面，第二流动相的百分比在约1分钟内从约45％增加到约100％。在一些方面，第二流动相的百分比在约1分钟内从约100％减小到约10％。
74.在一些方面，液相色谱为高压液相色谱(hplc)。在一些方面，液相色谱为超高压液相色谱(uhplc)。
75.在一些方面，质谱可以使用任何电离模式，特别是那些适于分析生物分子的模式，所述模式包含但不限于：直接输注质谱、电喷雾电离(esi)ms、解吸电喷雾电离(desi)ms、实时直接分析(dart)ms、大气压化学电离(apci)ms、电子冲击(ei)或化学电离(ci)、基质辅助激光解吸/电离(maldi)ms和大气压电离-电喷雾(api-es)。在一些方面，质谱使用api-es电离模式。
76.在一些方面，质谱扫描在400-16000m/z的范围内的信号。在一些方面，质谱扫描在700-13700m/z的范围内的信号。
77.在一些方面，质谱的扫描类型为正极性。在一些方面，质谱的数据采集时间为约10-35分钟。在一些方面，质谱的数据采集时间为约17-28分钟。
78.在一些方面，质谱的喷嘴电压为约400-600v。在一些方面，质谱的喷嘴电压为约500v。在一些方面，质谱的锥孔体电压为约60-70v。在一些方面，质谱的锥孔体电压为约65v。在一些方面，喷嘴电压与锥孔体电压之间的差为约400-450v。在一些方面，喷嘴电压与锥孔体电压之间的差为约435v。
79.在一些方面，质谱的干燥气体温度为约200-350℃。在一些方面，质谱的干燥气体温度为约300℃。在一些方面，质谱的干燥气体流速为约5-13升/分钟。在一些方面，质谱的干燥气体流速为约13升/分钟。
80.在一些方面，质谱使用约3-6kv的毛细管电压。在一些方面，质谱使用约3kv、4kv、
5kv或6kv的毛细管电压。在一些方面，质谱使用约5kv的毛细管电压。
81.在一些方面，质谱使用约125-350v的碎裂电压。在一些方面，质谱使用约125v、130v、135v、145v、155v、160v、165v、175v、185v、190v、195v、200v、205v、210v、215v、220v、225v、230v、235v、240v、245v、250v、255v、260v、265v、270v、275v、280v、285v、290v、295v、300v、305v、310v、315v、320v、325v、330v、335v、340v、345或350v的碎裂电压。在一些方面，质谱使用约175v的碎裂电压。
82.在一些方面，aav颗粒为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aavrh10、aavrh74或任何天然存在的重组或合成aav颗粒。在一些方面，所述aav颗粒为重组aav(raav)颗粒。在一些方面，所述aav颗粒为aavrh74。
83.在一些以上方面，本公开进一步包含测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的至少一种的翻译后修饰。在一些方面，本公开进一步包含测定vp1、vp2和vp3衣壳体蛋白中的至少一种的翻译后糖基化、唾液酸化、乙酰化、氨基酸丢失、酰胺化、磷酸化、甲酰化、羟基化、甲基化和/或硫酸化。翻译后修饰包括以下中的一种或多种：n末端甲硫氨酸丢失、苏氨酸丢失、磷酸化和乙酰化。
84.在一些方面，本公开包含测定vp1、vp2或vp3衣壳蛋白中n末端甲硫氨酸的去除。在一些方面，本公开包含测定vp1或vp3衣壳蛋白中n末端甲硫氨酸的去除。在一些方面，本公开包含测定去除了vp1、vp2或vp3衣壳蛋白中的n末端甲硫氨酸后的n末端乙酰化。在一些方面，本公开包含测定去除了vp1或vp3衣壳体蛋白中的n末端甲硫氨酸后的n末端乙酰化。
85.在一些方面，本公开提供了一种至少部分基于vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率和/或aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量来表征aav颗粒的衣壳蛋白的方法。
86.在一些方面，本公开提供了一种用于至少部分基于aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率和/或vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量来测定aav颗粒的血清型的方法，其中通过本文公开的方法测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率以及vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。
87.质谱是用于蛋白质表征的分析技术。在一些方面，提供了一种通过液相色谱和质谱来表征aavrh74衣壳蛋白比率连同所有三种衣壳蛋白的完整质量的方法。在一些方面，aavrh74衣壳在柱上变性为单独的衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。通过将柱隔室加热到80℃实现所述变性(3、4)。然后，借助于三氟乙酸作为流动相中的离子配对剂，在沃特世(waters)beh c8柱上对衣壳蛋白进行基线解析(5)。将经变性的蛋白质首先在uv中进行分析以实现衣壳比率，并且然后在质谱仪中进行分析以获得单独蛋白质的完整质量。
88.脱酰胺化是引起天冬酰胺残基转化为异天冬氨酸和天冬氨酸的混合物的常见翻译后修饰。还会发生谷氨酰胺残基的脱酰胺化，但以慢得多的速率。氧化也是引起蛋白质与各种自由基和活性氧物种反应的常见翻译后修饰。甲硫氨酸氧化最常见，然而还可以观察到如半胱氨酸和色氨酸等几种其它氨基酸残基的氧化。脱酰胺化/氧化还是用于在制造和储存期间存在的蛋白质的常见降解途径。脱酰胺化可以对蛋白质的活性和稳定性产生影响。氧化可以引起蛋白质的构象变化，并因此可以影响蛋白质活性和稳定性。氧化还可能影响蛋白质的免疫原性。因此，在翻译后修饰时，需要仔细监测蛋白质的关键质量属性(cqa)。
89.当前利用碳酸氢铵的方法产生了假信号或者过高估计了aav衣壳蛋白中的脱酰胺化(表7)。在此，本公开提供了一种用于利用tris-hcl更准确地测量衣壳蛋白上的翻译后修饰的方法。在一些方面，lc ms方法使用包括tris-hcl的缓冲液。在一些方面，所述缓冲液包括乙腈。在一些方面，所述缓冲液包括甲硫氨酸。在一些方面，所述缓冲液包括5mm到50mm的tris-hcl、5％-20％的乙腈以及1mm到50mm的甲硫氨酸。在一些方面，所述缓冲液包括20mm的tris-hcl、5％-10％的乙腈以及10mm的甲硫氨酸。
90.在一些方面，所述翻译后修饰包括位于aav8的n263、n514、n57、n502、n254和n94或其在aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 13、aavrh10或aavrh74处的等效残基中的一个或多个处的脱酰胺化。在一些方面，所述翻译后修饰包括位于aav.rh74的n57、n255、n256和n263中的一个或多个处的脱酰胺化。在一些方面，所述翻译后修饰包括位于aav.rh74的m437、m473、m526、m544、m560和m637中的一个或多个处的氧化。
91.aav组合物
92.本公开的一些方面涉及一种重组aav(raav)，所述raav包括衣壳蛋白的异质群组，所述衣壳蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群。在一些方面，所述修饰可以为脱酰胺化、乙酰化、异构化、磷酸化或氧化。在一些方面，所述修饰为脱酰胺化或氧化。
93.在一些方面，raav衣壳可以含有vp1、vp2和vp3的亚群，所述亚群具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个到至少约25个经脱酰胺化的氨基酸残基，其中与vp蛋白的经编码的氨基酸序列相比，至少约1％到约10％、至少约10％到约25％、至少约25％到约50％、至少约50％到约70％、至少约70％到约100％、至少约75％到约100％、至少约80％到约100％或至少约90％到约100％的所述氨基酸残基进行脱酰胺化。在一些方面，这些氨基酸残基中的大多数可以是n残基。在一些方面，q残基可以进行脱酰胺化。
94.在一些方面，本公开提供了一种aav组合物，所述aav组合物包括aav衣壳，所述aav衣壳包括位于aav.rh74的n57、n255、n256和n263或aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 13或aavrh10的等效残基中的一个或多个处的脱酰胺化，如通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测量的。在一些方面，通过本文所公开的方法中的任何方法测量脱酰胺化。
95.在一些方面，异质群组包括小于约80％、小于约78％、小于约76％、小于约74％、小于约72％、小于约70％、小于约68％、小于约66％、小于约64％、小于约62％、小于约60％、小于约58％、小于约56％、小于约54％、小于约52％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％或小于约10％的具有位于aav.rh74衣壳的n57处的脱酰胺化的衣壳蛋白。
96.在一些方面，其中异质群组包括小于约25％、小于约24％、小于约23％、小于约22％、小于约21％、小于约20％、小于约19％、小于约18％、小于约17％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％或小于约10％的具有位于aav.rh74衣壳的n57处的脱酰胺化的衣壳蛋白。
97.在一些方面，异质群组包括小于约80％、小于约78％、小于约76％、小于约74％、小
于约72％、小于约70％、小于约68％、小于约66％、小于约64％、小于约62％、小于约60％、小于约58％、小于约56％、小于约54％、小于约52％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、或小于约10％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的具有位于aav.rh74衣壳的n254和/或n255处的脱酰胺化的衣壳蛋白。
98.在一些方面，异质群组包括小于约80％、小于约78％、小于约76％、小于约74％、小于约72％、小于约70％、小于约68％、小于约66％、小于约64％、小于约62％、小于约60％、小于约58％、小于约56％、小于约54％、小于约52％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％或小于约10％的具有位于n263处的脱酰胺化的衣壳蛋白。
99.在一些方面，aav组合物包括aav衣壳，所述aav衣壳包括位于aav.rh74的m437、m473、m526、m544、m560和m637或aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav 13或aavrh10的等效残基中的一个或多个处的氧化，如通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测量的。在一些方面，通过本文所公开的方法中的任何方法测量脱酰胺化。
100.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m437处的氧化的衣壳蛋白。
101.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m473处的氧化的衣壳蛋白。
102.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m526处的氧化的衣壳蛋白。
103.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小
于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m544处的氧化的衣壳蛋白。
104.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m560处的氧化的衣壳蛋白。
105.在一些方面，异质群组包括小于约40％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约40％、小于约38％、小于约36％、小于约34％、小于约32％、小于约30％、小于约28％、小于约26％、小于约24％、小于约22％、小于约20％、小于约18％、小于约16％、小于约14％、小于约12％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％或小于约0.5％的具有位于m637处的氧化的衣壳蛋白。
106.表征aav组合物中的宿主细胞蛋白
107.在一些方面，本公开提供了一种表征如基于aav的基因疗法药物产物等aav组合物中的宿主细胞蛋白的方法。在一些方面，所述表征aav组合物中的宿主细胞蛋白的方法包括从所述组合物中免疫沉淀病毒衣壳蛋白；消化残余宿主细胞蛋白；以及用液相色谱四极杆飞行时间质谱(lc-qtof-ms)分析经消化的蛋白质以鉴定宿主细胞蛋白。如本文所用，术语“残余宿主细胞蛋白”或“残余蛋白”是指免疫沉淀后保留在溶液中的蛋白质。在一些方面，所述方法进一步包括用迭代ms/ms分析所述经消化的宿主细胞蛋白。
108.在一些方面，免疫沉淀包括用vp抗体温育aav组合物。在一些方面，所述vp抗体包括抗aav vp1抗体、抗aav vp2抗体、抗aav vp3抗体或其组合。在一些方面，抗体可以为来自美国研究产物公司(american research products,inc.)的抗腺相关病毒(aav)vp1/vp2/vp3(目录号：03-61058)。
109.在一些方面，将残余宿主细胞蛋白在溶液中消化。在一些方面，消化为快速消化。在一些方面，快速消化在约60℃到约80℃下进行。在一些方面，快速消化在约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、或约80℃下进行。在一些方面，快速消化在约70℃下进行。
110.在一些方面，向aav组合物中掺入已知量的至少一种已知蛋白质标准品。在一些方面，所述至少一种已知蛋白质标准品为人或牛蛋白质标准品。在一些方面，所述方法进一步包括相对于所述至少一种蛋白质标准品，对所述残余宿主细胞蛋白的量进行定量。
111.在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水性相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。在一些方面，所述液相色谱为反相液相色谱。
112.在一些方面，液相色谱在约35℃到55℃下进行。在一些方面，液相色谱在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、
约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃或约55℃下进行。在一些方面，液相色谱在约45℃下进行。
113.在一些方面，使用c18柱、c8柱或c4柱进行所述反相色谱。在一些方面，使用c8柱进行所述液相色谱。
114.在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含在约50-300mm长并且内径为约1-4.6mm的色谱柱内。在一些方面，所述柱为beh柱。在一些方面，所述柱的内径为1mm、2.1mm、3mm或4.6mm。在一些方面，所述柱的长度为50mm、75mm、100mm、150mm或300mm。在一些方面，柱尺寸为1mm
×
50mm、2.1mm
×
50mm、3mm
×
50mm、4.6mm
×
50mm、1mm
×
75mm、2.1mm
×
75mm、3mm
×
75mm、4.6mm
×
75mm、1mm
×
100mm、2.1mm
×
100mm、3mm
×
100mm、4.6mm
×
100mm、1mm
×
150mm、2.1mm
×
150mm，3mm
×
150mm、4.6mm
×
150mm、1mm
×
300mm、2.1mm
×
300mm、3mm
×
300mm或4.6mm
×
300mm。在一些方面，柱尺寸为1.6
×
50mm、1.6
×
60mm、1.6
×
70mm、1.6
×
80mm、1.6
×
90mm、1.6
×
100mm、1.6
×
110mm、1.6
×
120mm、1.6
×
130mm、1.6
×
140mm、1.6
×
150mm、1.7
×
50mm、1.7
×
60、1.7
×
70mm、1.7
×
80mm、1.7
×
90mm、1.7
×
100mm、1.7
×
110mm、1.7
×
120mm、1.7
×
130mm、1.7
×
140mm、1.7
×
150mm、1.8
×
50mm、1.8
×
60mm、1.8
×
70mm、1.8
×
80mm、1.8
×
90mm、1.8
×
100mm、1.8
×
110mm、1.8
×
120mm、1.8
×
130mm、1.8
×
140mm、1.8
×
150mm、1.9
×
50mm、1.9
×
60mm、1.9
×
70mm、1.9
×
80mm、1.9
×
90mm、1.9
×
100mm、1.9
×
110mm、1.9
×
120mm、1.9
×
130mm、1.9
×
140mm、1.9
×
150mm、2.0
×
50mm、2.0
×
60mm、2.0
×
70mm、2.0
×
80mm、2.0
×
90mm、2.0
×
100mm、2.0
×
110mm、2.0
×
120mm、2.0
×
130mm、2.0
×
140mm、2.0
×
150mm、2.1
×
50mm、2.1
×
60mm、2.1
×
70mm、2.1
×
80mm、2.1
×
90mm、2.1
×
100mm、2.1
×
110mm、2.1
×
120mm、2.1
×
130mm、2.1
×
140mm、2.1
×
150mm、2.2
×
50mm、2.2
×
60mm、2.2
×
70mm、2.2
×
80mm、2.2
×
90mm、2.2
×
100mm、2.2
×
110mm、2.2
×
120mm、2.2
×
130mm、2.2
×
140mm、2.2
×
150mm、2.3
×
50mm、2.3
×
60mm、2.3
×
70mm、2.3
×
80mm、2.3
×
90mm、2.3
×
100mm、2.3
×
110mm、2.3
×
120mm、2.3
×
130mm、2.3
×
140mm、2.3
×
150mm、2.4
×
50mm、2.4
×
60mm、2.4
×
70mm、2.4
×
80mm、2.4
×
90mm、2.4
×
100mm、2.4
×
110mm、2.4
×
120mm、2.4
×
130mm、2.4
×
140mm、2.4
×
150mm、2.5
×
50mm、2.5
×
60、2.5
×
70mm、2.5
×
80mm、2.5
×
90mm、2.5
×
100mm、2.5
×
110mm、2.5
×
120mm、2.5
×
130mm、2.5
×
140mm、2.5
×
150mm、2.6
×
50mm、2.6
×
60mm、2.6
×
70mm、2.6
×
80mm、2.6
×
90mm、2.6
×
100mm、2.6
×
110mm、2.6
×
120mm、2.6
×
130mm、2.6
×
140mm或2.6
×
150mm。在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含在约150mm长并且内径为约2.1mm的色谱柱内。
115.在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包括大小设定在约1.2μm-2.5μm之间的颗粒。在一些方面，反相液相色谱的固定相包括大小设定为约1.7μm、1.8μm或2.1μm的颗粒。在一些方面，颗粒大小为约1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm或2.5μm。在一些方面，所述反相液相色谱的固定相包含约1.7μm的颗粒。
116.在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包括含经氟取代的乙酸的水。所述经氟取代的乙酸包含单氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包括含三氟乙酸的水。
117.在一些方面，所述色谱使用第一流动相，所述第一流动相包含甲酸。
118.在一些方面，第一流动相包含约0.05体积％到约0.15体积％的甲酸。在一些方面，
第一流动相包括约0.05体积％、0.06体积％、0.07体积％、0.08体积％、0.09体积％、0.1体积％、0.11体积％、0.12体积％、0.13体积％、0.14体积％、0.15体积％、0.16体积％、0.17体积％、0.18体积％、0.19体积％或0.2体积％的甲酸。在一些方面，第一流动相包括约0.05体积％或0.1体积％的甲酸。在一些方面，第一流动相包含约0.1体积％的甲酸。
119.在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含经氟取代的乙酸的乙腈。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含三氟乙酸的乙腈。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含经氟取代的乙酸的乙腈和水的混合物。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含三氟乙酸的乙腈和水的混合物。
120.在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含甲酸的乙腈。在一些方面，所述色谱使用第二流动相，所述第二流动相包括含甲酸的乙腈和水的混合物。
121.在一些方面，第二流动相包含约0.05-0.2体积％的甲酸。在一些方面，第二流动相包含约0.05-0.15体积％的甲酸。在一些方面，第二流动相包含约0.05体积％、0.06体积％、0.07体积％、0.08体积％、0.09体积％、0.1体积％、0.11体积％、0.12体积％、0.13体积％、0.14体积％、0.15体积％、0.16体积％、0.17体积％、0.18体积％、0.19体积％或0.2体积％的甲酸。在一些方面，第二流动相包括约0.05体积％或0.1体积％的甲酸。在一些方面，第二流动相包含约0.1体积％的甲酸。
122.在一些方面，所述第二流动相包含约75-95体积％的乙腈。在一些方面，所述第二流动相包含约75体积％、80体积％、85体积％、90体积％或95体积％的乙腈。在一些方面，第二流动相包含约90体积％的乙腈和约10体积％的水。
123.在一些方面，第一流动相和第二流动相的组合中第二流动相在色谱中的百分比随时间的推移而增加。在一些方面，第二流动相的百分比从约2体积％增加到约50体积％。在一些方面，第二流动相的百分比从约50体积％增加到约100体积％。在一些方面，第二流动相的百分比在约110-130分钟内从约2％增加到约50％。在一些方面，第二流动相的百分比在约120分钟内从约2％增加到约50％。在一些方面，第二流动相的百分比在约20-30分钟内从约50体积％增加到约100体积％。在一些方面，第二流动相的百分比在约25分钟内从约50体积％增加到约100体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后在约5分钟内增加到100体积％。在一些方面，所述第二流动相的百分比随后维持在100体积％持续约3分钟。在一些方面，所述第二流动相随后在约2分钟内减少到约2体积％。
124.在一些方面，所述第二流动相的百分比维持在约100体积％持续约0.5-1.5分钟。在一些方面，所述第二流动相的百分比维持在100体积％持续约1分钟。
125.在一些方面，第二流动相的百分比在约1-10分钟内从约100％减小到约2％。在一些方面，第二流动相的百分比在约4分钟内从约100％减小到约2％。
126.在一些方面，液相色谱为高压液相色谱(hplc)。在一些方面，液相色谱为超高压液相色谱(uhplc)。
127.在一些方面，质谱可以使用任何电离模式，特别是那些适于分析生物分子的模式，所述模式包含但不限于：直接输注质谱、电喷雾电离(esi)ms、解吸电喷雾电离(desi)ms、实时直接分析(dart)ms、大气压化学电离(apci)ms、电子冲击(ei)或化学电离(ci)、基质辅助激光解吸/电离(maldi)ms和大气压电离-电喷雾(api-es)。在一些方面，质谱使用api-es电
离模式。
128.在一些方面，质谱扫描在40-5000m/z的范围内的信号。在一些方面，质谱扫描在50-3000m/z的范围内的信号。在一些方面，质谱扫描在300-3000m/z的范围内的信号。
129.在一些方面，质谱的扫描类型为正极性。在一些方面，质谱的数据采集时间为约1-130分钟。在一些方面，质谱的数据采集时间为约2-120分钟。
130.在一些方面，质谱的喷嘴电压为约400-600v。在一些方面，质谱的喷嘴电压为约500v。在一些方面，质谱的锥孔体电压为约60-70v。在一些方面，质谱的锥孔体电压为约65v。在一些方面，喷嘴电压与锥孔体电压之间的差为约400-450v。在一些方面，喷嘴电压与锥孔体电压之间的差为约435v。
131.在一些方面，质谱的干燥气体温度为约200-375℃。在一些方面，质谱的干燥气体温度为约325℃。在一些方面，质谱的干燥气体流速为约5-13升/分钟。在一些方面，质谱的干燥气体流速为约12升/分钟。
132.在一些方面，质谱使用约3-6kv的毛细管电压。在一些方面，质谱使用约3kv、4kv、5kv或6kv的毛细管电压。在一些方面，质谱使用约5kv的毛细管电压。
133.在一些方面，质谱使用约125-350v的碎裂电压。在一些方面，质谱使用约125v、130v、135v、145v、155v、160v、165v、175v、185v、190v、195v、200v、205v、210v、215v、220v、225v、230v、235v、240v、245v、250v、255v、260v、265v、270v、275v、280v、285v、290v、295v、300v、305v、310v、315v、320v、325v、330v、335v、340v、345或350v的碎裂电压。在一些方面，质谱使用约135v的碎裂电压。
134.虽然参照本发明主题的某些方面对本发明主题进行了相当详细地描述，但其它方面也是可能的。因此，所附权利要求书的精神和范围不应局限于本文中包含的具体方面的描述。
135.实例
136.现在将利用工作实例来说明本公开，所述工作实例旨在说明本公开的工作并且不旨在限制对本公开的范围的任何限制。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践所公开的方法和组合物，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。
137.实例1：一般方法和设备
138.1.1试剂
139.从飞世尔科学公司(fisher scientific)获得lcms用水、乙腈和三氟乙酸，并且从西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich)获得碳酸氢铵。表1提供了用于液相色谱和溶液制备的试剂。
140.表1：用于液相色谱的试剂
141.试剂名称cas编号所需等级、纯度或浓度建议来源/目录编号lcms用水7732-18-5lcms飞世尔公司/w6乙腈67-63-0lcms飞世尔公司/a955三氟乙酸76-05-1lcms飞世尔公司/a11610x1amp碳酸氢铵1066-33-7bioultra西格玛奥德里奇公司/09830
142.1.2设备
143.使用以下设备来执行本文所公开的实例。
144.a)沃特世acquity uplc beh c8柱，2.1
×
100mm，1.7μm；部件编号：186002878
145.b)pierce洗涤剂去除旋转柱，0.5ml；目录号：87777
146.c)合适的分析天平
147.d)自动移液器
148.e)a级计量玻璃器皿
149.f)hplc小瓶和盖
150.g)刮铲和称量舟皿
151.h)安捷伦(agilent)1290infinity ii uhplc系统
152.i)安捷伦6545xt advancebio四极杆飞行时间质谱仪(q-tof)
153.实例2：溶液制备
154.2.1制备100mm碳酸氢铵
155.在50ml 管中称取0.395
±
0.01克的碳酸氢铵。使用量筒，将50ml lcms用水转移到管中，使用涡旋混合器以将碳酸氢铵彻底溶解，以获得100mm碳酸氢铵溶液。所述溶液在2-8℃下稳定一个月。
156.2.2制备第一流动相(含0.1％三氟乙酸的水)
157.使用量筒，将1l lcms用水转移到1l瓶子中。使用移液器，将1000μl三氟乙酸转移到瓶子中。将三氟乙酸和水充分混合5分钟以获得第一流动相。第一流动相在环境条件下稳定至多一个月。
158.2.3制备第二流动相制备(含0.1％三氟乙酸的90％乙腈和10％水)
159.将900ml乙腈添加到1l量筒中。将lcms用水添加到1l量筒中以制成1l溶液。将溶液转移到1l瓶子中。使用移液器，将1000μl三氟乙酸转移到瓶子中。将三氟乙酸和溶液充分混合5分钟，以获得第二流动相。第二流动相在环境条件下稳定至多一个月。
160.实例3：样品制备
161.移除旋转柱的底部封口，并且松开旋转柱的盖。将柱放置到2ml收集管中，并且以1500
×
g离心1分钟。当使用固定角度转子时，在离心柱的压实树脂向上倾斜的侧做标记。然后将柱放置在离心机中，其中标记面朝外，以进行所有后续步骤。
162.将400μl 100mm碳酸氢铵溶液添加到柱中，并且将柱以1500
×
g离心1分钟。将此步骤重复另外两次，并且在每个步骤之后丢弃流过液。然后将柱放置到新的2ml收集管中。将5μg样品缓慢施加到压实树脂床的顶部，并且在室温下温育2分钟。将柱以1500
×
g离心2分钟，并且收集不含聚合物的样品。然后用100mm碳酸氢铵将样品体积补足到100μl，并且然后转移到hplc小瓶中。
163.实例4：表征aav颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白
164.本实施例描述了测定aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率以及vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量的方法。此处，aav颗粒在液相色谱中变性并分离为vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白。使经分离的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白首先经受uv以测定aav颗粒中vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的比率，并且然后经受质谱以获得vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白中的每一
种的质量。
165.4.1lc操作条件
166.在使用acquity beh 1.7μm、2.l
×
l00 mm、c8分析柱(部件编号：186002878)的acquity 上进行aav vp1、vp2和vp3衣壳蛋白分离。使用的流动相为：
167.第一流动相(a)：含0.1％三氟乙酸的水；以及
168.第二流动相(b)：含0.1％三氟乙酸的90％乙腈和10％水。
169.将柱温度维持在约80℃，并且通过使用以0.4毫升/分钟的流速从10％增加到40％并且从40％增加到45％的流动相b，然后用100％流动相b冲洗1分钟，并且用起始流动相组合物(10％流动相b)重新平衡另外五分钟来实现分离。
170.lc的操作条件在表2中列出。
171.表2：lc操作条件
[0172][0173][0174]
4.2质谱仪(ms)操作条件
[0175]
利用api-es电离，在检查扫描中在700-13700m/z的m/z值范围内，使用安捷伦6545xt advancebio四极杆飞行时间质谱仪(q-tof)进行质谱。分别将毛细管电压、喷嘴电压、碎裂电压和锥孔体电压设定为5kv、500v、175v和65v。将干燥气体温度和干燥气体流量分别设定为300℃和13升/分钟。
[0176]
质谱仪操作条件在表3中列出。
[0177]
表3：质谱仪(ms)操作条件
[0178][0179][0180]
注意：ms参数用于安捷伦6545xt qtof，并且可能需要根据所使用的仪器进行修改。
[0181]
4.3分析和结果
[0182]
通过首先将柱隔室加热到80℃来使衣壳蛋白变性。然后将三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3通过使用沃特世uplc beh c8柱(部件编号：186002878)基线分离，通过包括含0.1％三氟乙酸的水的第一流动相与包括含0.1％三氟乙酸的乙腈和水的混合物的第二流动相的组合进行洗脱，其中第二流动相的百分比随时间的推移而增加。在流动相中使用0.1％三氟乙酸作为离子配对剂有助于基线解析。
[0183]
使在液相色谱中分离出的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白首先经受uv以测定相对量，并且然后经受质谱以测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量。通过如图1和表4所示的uv色谱图的基线积分获得vp1/vp2/vp3的化学计量，即1:1:10左右。
[0184]
表4
[0185]
aavrh74样品vp1vp2vp3样品11.00.99.5样品21.01.77.9样品31.01.49.7
[0186]
然后使用表5中列出的参数对三种衣壳蛋白的峰进行解卷积。所有三个峰的总离子色谱图和解卷积的谱在图2和图3a-3c中示出。在vp1峰(理论质量81587da)下检测到的三个主要质量为81496da、81578da和81658da。81496da峰表示具有n末端甲硫氨酸丢失和单个乙酰化修饰的vp1蛋白。质量偏移为 80da的另外两个峰表示磷酸化。vp2峰(理论质量
66381da)的解卷积示出两个主要质量：66282da和66360da。66282da峰表示具有苏氨酸丢失的vp2蛋白，并且66360da峰匹配质量偏移为 80的单个磷酸化。vp3峰(理论质量59750da)显示出59662da的单一主要质量，所述主要质量与具有n末端甲硫氨酸丢失和单个乙酰化的vp3蛋白的质量相匹配。
[0187]
表5：解卷积参数
[0188]
参数设置解卷积算法最大熵质量范围45000-90000道尔顿质量步骤0.1道尔顿m/z范围700.00-3000.00基线扣除因子7.00同位素宽度自动峰值信噪比30.0峰的最大数量100计算平均质量使用峰高度的90％最小连续电荷5最小蛋白质拟合评分8
[0189]
图3示出了对vp1、vp2和vp3的翻译后修饰的检测。表6示出了aav.rh74衣壳蛋白的完整质量分析。
[0190]
表6：质量分析
[0191][0192]
实例5：使用lcms表征aavrh74的脱酰胺化
[0193]
通过质谱可以是测定衣壳蛋白中的广泛脱酰胺化，其中可以测定衣壳蛋白中脱酰胺化的位点以及这些位点处的脱酰胺化的水平。为了测量aav衣壳脱酰胺化，在存在2m盐酸胍和10mm dtt的情况下，使衣壳蛋白在90℃下变性并还原10分钟。在将样品冷却到室温后，添加30mm碘乙酰胺以进行烷基化处理，并且在室温下在黑暗中温育30分钟。然后通过添加1ml dtt淬灭烷基化。将20mm碳酸氢铵添加到样品中以便将盐酸胍稀释到200mm。然后将样品使用胰蛋白酶以1:20的酶:蛋白质比率消化，并且在37℃下温育过夜。在过夜温育后，通过添加到最终浓度为0.5％的三氟乙酸中淬灭消耗，并且在与具有nanoflex源的q exactive hf偶联的赛默ultimate 3000rslc系统上分析样品。
[0194]
表7示出了鉴定出的主要脱酰胺化位点以及这些位点处的脱酰胺化的水平(即脱酰胺化百分比)。表7中aav8的数据由现有出版物(《分子疗法》,第26卷第12期,第2848-2962
页(2018年))公开。
[0195]
表7：aav衣壳的脱酰胺化分析结果
[0196][0197]
分别使用两种缓冲液(碳酸氢铵和tris-hcl)来测量aav.rh74的脱酰胺化状态。
[0198]
对于碳酸氢铵，通过将缓冲液交换为100mm碳酸氢铵来使样品变性。通过添加10mm dtt使经变性的样品还原，并且在37℃温度下温育45分钟。然后通过在样品中添加碘乙酰胺达到30mm的最终浓度来进行烷基化。然后使用10kda amicon ultra过滤器将经变性、经还原且经烷基化的样品交换回到100mm碳酸氢铵。然后使用胰蛋白酶将样品消化，并且在37℃下温育过夜。使用在碳酸氢铵中进行消化的这种样品制备，获得了aavrh74的类似水平的脱酰胺化，如表7所见。
[0199]
对于tris-hcl，使用amicon 10k离心过滤器将60μg样品等分试样缓冲液交换为4m胍和ph为7.5的200mm tris，以去除样品基质并浓缩蛋白质。将胍浓度调节到6m，并且将dtt(10mm)添加到60μg等分试样中。将反应混合物在56℃下温育45分钟，然后冷却到室温。添加碘乙酰胺(30mm)，其中在室温下在黑暗中温育60分钟。然后添加tris缓冲液(100mm，ph＝7.5)以将盐酸胍浓度稀释到0.6m。将胰蛋白酶/lys-c(60μg)添加到60μg经还原且经烷基化的样品中(酶:蛋白质比率为约1:1(w:w))。在消化中将甲硫氨酸添加到10mm，以使人为氧化最小化。在37℃下进行消化过夜(17小时)。然后添加tfa(1％)，之后进行lc-ms/ms分析。
[0200]
如表7中所示，以tris-hcl作为缓冲液，脱酰胺化状态显著比使用碳酸氢铵的脱酰胺化状态低。
[0201]
为了进一步优化使用tris-hcl的方法，根据图4中的流程图对八种单独aav衣壳样品进行了测量。首先通过将缓冲液交换为6m盐酸胍、ph为7.5的20mm tris-hcl使样品变性。然后通过添加dtt达到10mm的最终浓度来还原样品，并且在37℃下温育45分钟。通过添加碘乙酰胺达到30mm的最终浓度来进行烷基化，并且在室温下在黑暗中温育1小时。使用10kda amicon ultra过滤器将样品再次缓冲液交换为ph为7.5的20mm tris-hcl。然后将乙腈添加到样品中达到10％的最终浓度，并且还添加甲硫氨酸达到10mm的最终浓度。使用胰蛋白酶
在37℃下将样品消化过夜。然后在安捷伦1290u-hplc上使用rp-hplc来分离肽。然后使用安捷伦6545xt qtof检测经分离的肽，并且使用masshunter和bioconfirm软件进行脱酰胺化分析。脱酰胺化状态在图5中示出，并且氧化状态在图6中示出。在存在的52个天冬酰胺残基中，在48个残基处未观察到脱酰胺化(vp1中的总体天冬酰胺残基：56)。在存在的39个谷氨酰胺残基中，在所有39个残基处均未观察到脱酰胺化(vp1中的总体谷氨酰胺残基：48)。使用以o18标记的水，少量位于n57处的脱酰胺化被示出为样品制备相关的伪影。在5个其余甲硫氨酸残基中未检测到氧化(vp1中的总体甲硫氨酸残基：11)。在检测到的14个色氨酸残基中，在所有14个残基处均未观察到氧化(vp1中的总体色氨酸残基：15)。
[0202]
由于ph随时间的推移而增加，碳酸氢铵中的消化可能显著增加脱酰胺化伪影。因此，观察到的脱酰胺化的较高水平可能是在样品制备期间产生的脱酰胺化伪影。在萨雷普塔公司设置基于tris hcl的消化以确认脱酰胺化水平：使用ph为7.5的20mm tris hcl作为缓冲液；将10％乙腈添加到消化溶液中，因为所述乙腈已知会减少脱酰胺化伪影；并且还将10mm甲硫氨酸添加到消化溶液中以减少氧化伪影。
[0203]
因此，本公开的方法在通过tris-hcl缓冲液测量脱酰胺化、氧化或其它翻译后修饰时更为准确。
[0204]
实例6：使用lc-qtof-ms表征宿主细胞蛋白
[0205]
借助于通过lc-qtof-ms表征保留在aav组合物中的宿主细胞蛋白来分析基于raav的基因疗法药物产物的纯度。
[0206]
6.1制备样品
[0207]
向aavrh74样品中掺入已知量的人硫氧还蛋白1(ht1)蛋白质标准品invitgen(目录号：lf-p0001)和牛碳酸酐酶ii(bcaii)蛋白质标准品sigma(目录号：c7749)。分别选择人硫氧还蛋白1(ht1)和牛碳酸酐酶ii(bcaii)作为用于定量性人和牛hcp实测值的掺入蛋白质标准品。对于免疫耗竭过程，将100μl 0.05mg/ml抗腺相关病毒(aav)、vp1/vp2/vp3抗体和100μl样品溶液以及20μl 0.05mg/ml bcaii和10μl 0.1mg/ml hti移液到来自pierce ms相容性磁性ip试剂盒的270μl ip-ms细胞裂解缓冲液中。然后用来自美国研究产物公司的抗腺相关病毒(aav)vp1/vp2/vp3(目录号：03-6105)和pierce ms相容性磁性ip试剂盒(目录号：90409)，从样品中免疫沉淀aav衣壳蛋白。然后使样品通过pierce洗涤剂去除旋转柱(目录号：87777)。
[0208]
然后将样品缓冲液交换为promega快速消化缓冲液(目录号：va1060)。对样品进行还原、烷基化并且在70℃下用快速消化胰蛋白酶进行消化持续60-180分钟。
[0209]
6.2lc操作条件
[0210]
使用沃特世acquity肽beh c18、1.7μm、2.1
×
150mm柱，在安捷伦1290hplc系统上进行经消化的残余宿主细胞蛋白分离。所使用的流动相为：
[0211]
第一流动相(a)：含0.1％甲酸的水溶液；以及
[0212]
第二流动相(b)：含0.1％甲酸的90％乙腈和10％水。
[0213]
将柱温度维持在约45℃，并且通过使用以0.3毫升/分钟的流速从2％增加到50％并且从50％增加到100％的流动相b，然后用100％流动相b冲洗3分钟，并且用起始流动相组合物(2％流动相b)重新平衡另外5分钟来实现分离。
[0214]
lc的操作条件在表8中列出。
[0215]
表8：lc操作条件
[0216][0217]
6.3质谱仪(ms)操作条件
[0218]
利用api-es电离，在检查扫描中在50-3000m/z的m/z值范围内，使用安捷伦6545xt advancebio四极杆飞行时间质谱仪(q-tof)进行质谱。分别将毛细管电压、喷嘴电压、碎裂电压和锥孔体电压设定为4kv、500v、135v和65v。将干燥气体温度和干燥气体流量分别设定为325℃和12升/分钟。
[0219]
质谱仪操作条件在表9中列出。
[0220]
表9：质谱仪(ms)操作条件
[0221]
[0222][0223]
6.4分析和结果
[0224]
通过来自蛋白质度量公司(protein metrics)的byos软件对实例6.3中产生的数据进行处理，以针对某些uniprot蛋白质数据库进行搜索。针对掺入的蛋白质标准品的量的量来计算每种残余蛋白质的身份和相对数量。hcp分析表明，对于三个批次的aav病毒颗粒，通过ms鉴定出仅几种残余宿主细胞蛋白(两种牛蛋白质，但无人蛋白质)(表10)。蛋白质的浓度按ng/ml或基于掺入的蛋白质标准品的ppm水平的顺序。
[0225]
表10：三个批次的通过lc/ms分析的宿主细胞蛋白
[0226][0227]
以下参考文献以其整体并入本文：
[0228]
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(characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in kb cells)”《病毒学杂志(j virol)》25:1978,第331-338页。
[0229]
2.johnson fb、ozer hl、hoggan md.“腺病毒相关病毒的结构蛋白(structural proteins of adenovirus-associated viruses)”《病毒学杂志》8:1971,第776-770页。
[0230]
3.d.w.bauer.等人“探索疱疹病毒和噬菌体中的dna压力与衣壳稳定性之间的平衡(exploring the balance between dna pressure and capsid stability in herpesviruses and phages.)”《病毒学杂志》2015,9288-98。
[0231]
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[0232]
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