黑茶多糖的应用的制作方法

1.本发明涉及化妆品技术领域，更具体地说，涉及黑茶多糖的应用。


背景技术：

2.黑茶(dark tea)，因成品茶的外观呈黑色，故得名。黑茶属于六大茶类之一，属后发酵茶，传统黑茶采用的黑毛茶原料成熟度较高，是压制紧压茶的主要原料。黑茶制茶工艺一般包括杀青、揉捻、渥堆和干燥四道工序。黑茶按地域分布，主要分类为湖南黑茶(茯茶、千两茶、黑砖茶、三尖等)、湖北青砖茶、四川藏茶(边茶)、云南黑茶(普洱熟茶)、广西六堡茶等等。
3.植物多糖具有多种功效活性，茶叶中的多糖复合物，即茶多糖也不例外。由于茶多糖随着茶叶的老化逐渐积累，故黑茶中的茶多糖含量居于榜首。黑茶多糖，是从黑茶中提取出来，能与蛋白质、矿质元素相结合的一种酸性多糖或一种酸性糖蛋白。黑茶在发酵加工和储藏的过程中，黑茶中的微生物能分泌大量纤维素酶，分解黑茶中的纤维素产生水溶性多糖，故黑茶中水溶性多糖含量比绿茶和红茶高。由于黑茶中微生物分泌的多种酶的联合作用，使黑茶多糖水解成易吸收、药理活性强和分子链长度较短的肽链和糖链。目前发明以及技术研究，主要集中在黑茶的提取活性物与其他功效物进行组合复配，缺乏黑茶多糖原料本身在功效方面的验证。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供黑茶多糖的应用，通过本发明的制备方法得到的分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖，对细胞抗衰有良好的效果。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.分子量＜10kd的黑茶多糖和/或分子量＞100kd的黑茶多糖在制备抗衰产品中的应用。
7.具体地，本发明提供了分子量＜10kd的黑茶多糖和/或分子量＞100kd的黑茶多糖在制备促进细胞修复产品中的应用。
8.具体地，本发明提供了分子量＜10kd的黑茶多糖和/或分子量＞100kd的黑茶多糖在制备促进胶原蛋白分泌产品中的应用。
9.所述分子量＜10kd的黑茶多糖的制备方法包括：
10.(1)将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；
11.(2)对黑茶提取液依次进行醇沉、精制，得到不同分子量的黑茶多糖；
12.(3)使用截留分子量为10kd的分离装置对所述黑茶多糖进行分离，得到分子量＜10kd的黑茶多糖；
13.所述分子量＞100kd的黑茶多糖的制备方法包括：所述步骤(3)中，使用截留分子量为100kd的分离装置对所述黑茶多糖进行分离。
14.将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；优选将黑茶粉与提取溶剂混合；黑茶粉
优选过60～80目筛，再优选过80目筛；所述黑茶和提取溶剂的质量比为1:(25～30)；提取溶剂优选为水；所述混合的温度为80～100℃，再优选为80℃，时间为60～80min，再优选为60min。
15.在本发明的一个实施例中，将黑茶与提取溶剂经过混合后，固液分离，得到滤渣和第一滤液，将滤渣与提取溶剂混合，固液分离，得到第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合，得到黑茶提取液。
16.黑茶与提取溶剂混合前，优选对黑茶进行干燥；干燥的温度优选为50～60℃，再优选为60℃，时间优选为15～20min，再优选为15min。
17.采用乙醇进行所述醇沉；所述醇沉的温度为4℃，时间为20～30h。
18.在所述醇沉前，优选将黑茶提取液进行浓缩，得到黑茶浓缩液；所述黑茶浓缩液和黑茶提取液的体积比为1:(5～10)，优选为1:10；浓缩的温度优选为60～65℃，再优选为65℃；黑茶浓缩液和乙醇的体积比为1:(3～5)，再优选为1:(3～4)。
19.在本发明的一个实施例中，得到黑茶提取液后，将其减压浓缩，得到黑茶浓缩液，对黑茶浓缩液进行醇沉，体系出现沉淀后离心收集，离心的转速优选为8000r/min，时间优选为6min；醇沉得到的沉淀物优选进行冷冻干燥；冷冻干燥的时间优选为72h；在冷冻干燥前，优选用乙醇清洗所述沉淀物。
20.所述精制包括：将醇沉后的沉淀物与有机溶剂混合，固液分离，收集精制沉淀物；所述有机溶剂优选为乙醇、丙酮，再优选为乙醇；优选地，对所述精制沉淀物进行冷冻干燥；在冷冻干燥前，优选用有机溶剂清洗所述精制沉淀物。优选地，所述精制的次数≥2。精制2次以上可除去一些醇沉后变性的茶蛋白和一些不溶性的色素和杂质等。
21.在本发明的一个实施例中，采用超滤离心管进行所述分离；离心的转速优选为3800r/min，时间优选为30min。
22.在本发明的一个实施例中，将所述精制沉淀物与溶剂混合，配置成黑茶多糖溶液，将所述黑茶多糖溶液进行所述分离；黑糖溶液的质量浓度优选为2％；溶剂优选为水。
23.本发明还提供了一种组合物，包括分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖。
24.所述分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖的质量比为1:(1～3)，优选为3：5。
25.本发明还提供了一种化妆品，其特征在于，包括分子量＜10kd的黑茶多糖和/或分子量＞100kd的黑茶多糖，以及化妆品上可接受的辅料。
26.在本发明中，所述化妆品包括分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖。
27.本发明的化妆品优选为化妆水、乳液、肌底液、精华、面膜、防晒霜、面霜、眼霜、手霜或身体乳霜；面膜优选为贴片式面膜或涂抹式面膜；精华优选为精华水、精华油或精华啫喱。
28.本发明的辅料为化妆品上可接受的辅料，优选为溶剂、增稠剂、保湿剂、成膜剂、脂质体、防腐剂、着色剂、ph调节剂和香精中的一种或多种；溶剂优选为水或醇类溶剂。
29.本发明针对现代人存在的皮肤问题，制备出不同分子量的黑茶多糖，对其进行多维度细胞功效测试后，筛选出最佳分子量的黑茶多糖，具体为：分子量＜10kd的黑茶多糖对
应激损伤的细胞具有较好的修复作用，分子量＞100kd的黑茶多糖能够促进细胞分泌胶原蛋白。另外，将本发明的最佳分子量的黑茶多糖进一步作为化妆品使用，能够安全有效地达到改善皮肤老化的目的。
30.本发明采用的热水浸提法、乙醇沉淀法和滤膜离心法所需要的仪器设备较为普遍、工艺操作流程较为简单，成本较低，大型工厂有广泛的应用实践经验，有利于工艺方法的实际放大和节能降耗。
附图说明
31.图1是蒽酮-硫酸法测定葡萄糖浓度的标准曲线；
32.图2是黑茶提取物以及不同分子量黑茶多糖对h2o2损伤后的hacat细胞修复作用图；
33.图3是黑茶提取物以及不同分子量黑茶多糖对hff-1细胞的i型胶原蛋白(col-i)分泌量的影响图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。本发明中所使用黑茶产地来源于湖南省益阳市安化县。本发明试验例中的黑茶提取物，其制备方法参照公告号为cn103356446b的中国专利中实施例1的步骤进行。
36.本发明采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。
37.实施例1
38.本实施例的不同分子量的黑茶多糖，其制备方法包括以下步骤：
39.(1)提取：将黑茶置于60℃烘箱干燥15min后，使用中药粉碎机粉碎并过80目筛，得到黑茶粉末。称取一定质量的黑茶粉末加入纯水作为提取溶剂，固液比为1:25；然后置于80℃的油浴锅中提取60min后，利用圆形滤纸抽滤，滤液备用；滤渣再次加入纯水，按照上述条件进行重复提取1次后，再经圆形滤纸抽滤，合并两次滤液，得到1l黑茶提取液，再经65℃减压浓缩至100ml，得到黑茶浓缩液。黑茶浓缩液加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，搅拌均匀后，放置于4℃冰箱中冷藏静置过夜。24h后，离心(8000r/min，6min)收集沉淀，使用无水乙醇反复清洗2次。再离心收集沉淀，放入冷冻干燥机中干燥72h成粉，即得黑茶多糖粉末。
40.(2)纯化：将步骤(1)制备的黑茶多糖粉末，按照1:100的质量比加入纯水，对黑茶多糖粉末进行复溶，可通过搅拌和低温超声处理加快黑茶多糖的溶解速度，确保黑茶多糖溶解完全。将该黑茶多糖溶液置于高速冷冻离心机(转速为10000r/min)中离心10min，得上清液后，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，搅拌均匀后，置于4℃冰箱中冷藏静置过夜。24h后，离心(8000r/min，6min)收集沉淀，无水乙醇反复清洗2次并离心收集沉淀，冷冻干燥制
得黑茶多糖粉末。按照以上操作，重复操作2次即可除去一些醇沉后变性的茶蛋白和一些不溶性的色素和杂质等。
41.(3)分离：将步骤(2)制备的黑茶多糖粉末溶于纯水中，配制质量浓度为2％的黑茶多糖溶液。
42.a)使用截留分子量100kd规格的超滤离心管对黑茶多糖溶液进行离心(3800r/min，30min)，收集分子量大于100kd的黑茶多糖截留液。
43.b)将步骤a)的透过液，用截留分子量30kd的超滤离心管进行分离处理，收集分子量在30kd～100kd的黑茶多糖截留液。
44.c)将步骤b)的透过液，用截留分子量10kd的超滤离心管进行分离处理，即可得分子量小于10kd以及10kd～30kd的黑茶多糖。将以上操作获得的不同分子量的黑茶多糖进行冻干处理得到粉末。
45.实施例2
46.本实施例的组合物，由质量比为3:5的分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖组成，其制备方法包括以下步骤：将实施例1中的分子量＜10kd的黑茶多糖和分子量＞100kd的黑茶多糖按照上述质量比进行混合。
47.试验例1不同分子量的黑茶多糖质量分布比
48.(1)葡萄糖标准溶液配制：精密称量经过干燥的无水葡萄糖10mg置于烧杯中，加入50ml超纯水使之溶解完全。冷却后移入100ml容量瓶中，继续加入超纯水定容至刻度线，得到浓度为100μg/ml的葡萄糖标准溶液。
49.(2)蒽酮-硫酸溶液配制：准确称量0.1g蒽酮试剂，加入事先配制好的浓度为80%的100ml浓硫酸水溶液中，待冷却完全后，置于棕色瓶中备用，整个过程中注意避光。（3）标准曲线绘制用移液枪分别精密吸取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0的葡萄糖标准溶液，置于10ml具塞试管中，用超纯水补齐至2 ml。然后再加入6 ml的蒽酮-硫酸溶液，混合均匀后，迅速盖紧具塞试管盖。将具塞试管放入沸水中加热15min后，再放入冰水中冷却10min。冷却后恢复至室温，酶标仪625nm。以吸光度值为纵坐标y，葡萄糖标准溶液浓度为横坐标x，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示，所测得的数据经过回归分析，以吸光度值为纵坐标（y），葡萄糖质量为横坐标（x），得到回归方程为：y=0.0023x 0.0019，r2=0.9991。在浓度0～200μg的范围内，葡萄糖标准溶液浓度与吸光度线性关系良好。对实施例1制得的不同分子量的黑茶多糖进行处理，可得到黑茶多糖质量分布，如表1所示：表1不同分子量的黑茶多糖质量分布比黑茶多糖分子量＜10k10k～30k30k～100k＞100k质量比36.13%7.92%5.94P.01%由表1可知，分子量大于100k的黑茶多糖约占50%；在分子量小于100k的多糖中，分子量小于10k的黑茶多糖占有较大比重，约为36%；10k～100k占比最低，共计约14%。由此可见，不同分子量的黑茶多糖不仅富含大分子量多糖，也富含较为丰富的小分子量多糖，这可能是由于黑茶中微生物的水解以及独特的发酵工艺，在储藏过程中促进了大分子量多糖水解成更小分子量的黑茶多糖。试验例2黑茶提取物及不同分子量的黑茶多糖对hacat细胞氧化损伤的修复作用将hacat细胞悬液密度调整至10000个/ml后接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5%co2培养箱中培养24 h。设置阴性对照组（nc）、阳性对照组(pc)、样品组（不同分子量的黑茶多糖）和黑茶提取物对照组，各组均设6个复孔。弃去旧培养基，加入h2o2(40μm)
溶液，100μl/孔，阴性对照组加入完全培养基，置于37℃，5%co2培养箱内培养3h后弃去。以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔,阴性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。在避光条件下，每孔加入10μl mtt溶液(5mg
·
ml-1
)，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱内充分反应4h后弃去孔板内上清液，加入dmso，100μl/孔，震荡溶解10min，使用酶标仪检测各孔570nm处吸光度值，以630nm为参考波长。各组吸光度值减去本底吸收后，以细胞对照组吸光度值为100％，计算各浓度加样组细胞的细胞活力百分比，计算公式如下：
50.细胞活力百分比(％)＝样品孔平均od值/阴性对照组平均od值
×
100％
51.通过mtt法检测各组细胞od值并计算细胞生存率，结果如图2所示，**代表与损伤组即阳性组对比，具有显著性差异；ns代表与阳性组相比，无显著性差异。以阴性对照组细胞活力为100％计算，阳性对照组细胞生存率降至63.0％，小于10kd的黑茶多糖与阳性组相比有较为显著的差异，将细胞生存率提升至73.5％；同时分子量小于10kd的黑茶多糖与黑茶提取物对阳性组损伤修复效果对比来看，具有显著性差异。因此，相较于其他分子量区间的黑茶多糖，小于10kd的黑茶多糖对h2o2诱导的hacat细胞氧化应激受损有较好的修复作用。
52.试验例3黑茶提取物及不同分子量的黑茶多糖对hff-1细胞的i型胶原蛋白分泌量的影响
53.(1)将hff-1细胞按10000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。设置阴性对照组(nc)、阳性对照组(pc)、样品组(不同分子量的黑茶多糖)和黑茶提取物对照组，各组各设置6个复孔。以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔，阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
54.(2)取孔板中的上清，通过elisa法检测胶原含量，操作步骤如下：
55.a、预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温。
56.b、标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为500，250，125，62.5，0ng/ml。
57.c、收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000
×
g，5min)，取上清后，适当浓度稀释作为检测样本。
58.d、各反应孔中加入100μl标准品工作液及检测样本(稀释1倍)，各组均设2个复孔，于37℃孵箱孵育90min。
59.e、弃去液体，甩干，各反应孔中加入100μl生物素标记抗体工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育60min。
60.f、弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μl洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次。
61.g、各反应孔中加入100μl hrp标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min。
62.通过elisa检测各组胶原含量，根据实验结果得到标准曲线y＝0.0006x 0.0915，r2＝0.9934(横坐标x为样品组产生的胶原含量，纵坐标y为吸光度)，根据标准曲线的吸光度反推胶原含量，其变化趋势如图3所示，*代表与阴性组对比，具有显著性差异；ns代表与阳性组相比，无显著性差异。以阴性组胶原含量作为对照，不同分子量的黑茶多糖对hff-1
细胞的i型胶原蛋白(col-i)分泌量都有一定的促进作用，其中分子量大于100kd的黑茶多糖将胶原分泌量由4168.67ng/ml上调至6002.92ng/ml；同时，分子量大于100kd的黑茶多糖与黑茶提取物对胶原蛋白分泌量效果对比来看，具有明显优势。因此，相较于其他分子量区间的黑茶多糖和黑茶提取物；分子量大于100kd的黑茶多糖对hff-1细胞的i型胶原蛋白(col-i)分泌量呈现显著性上调的作用。
63.所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。