一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶、制备方法及应用

1.本发明属于口腔医学技术领域，尤其涉及一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶、制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，年轻恒牙在发育过程中易受到龋坏和发育畸形等因素的影响，发生牙髓炎及根尖周炎，导致牙根发育停滞、根尖孔粗大、根骨壁薄，降低了口腔健康质量和牙齿使用寿命。再生性牙髓治疗是当前前沿的治疗方法，已取得了可观的治疗效果。再生性牙髓治疗中，感染控制至关重要。传统根管消毒剂氢氧化钙依赖强碱性杀菌，但对牙本质小管内，其高ph无法难以维持，细菌杀灭效果差。新兴的根管消毒剂由由甲硝唑、米诺环素、环丙沙星组成，简称为三联抗生素(triple antibiotics paste,以下简称tap)，tap具有广谱抗菌性以及较好的渗透性，其抑菌效果明显优于氢氧化钙，不仅对根管感染的常见菌群牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,p.g)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum,f.n)有明显效果，且对难治性根管感染常常检出的粪肠球菌(enterococcus faecalis,e.f)等有较好抑菌性。
3.tap由三种抗生素混合而成，临床上常常使用无菌水或生理盐水作配制，其流动性较强，不利于临床操作，特别是对上颌牙齿的操作中，药物会因重力流出，无法保障消毒效果；配制的药物不具有缓释效果，局部浓度过高还对根尖周组织细胞具有一定的细胞毒性。
4.水凝胶是一种具有三维空间网络结构的亲水性聚合物，具有较高的水溶胀性、生物相容性以及适当的生物力学性能，在组织工程上应用较广。海藻酸钠是常用的水凝胶之一，它是一种天然高分子材料，主要从海带、叶藻等褐藻类植物中提取，被美国食品药物监督管理局(food and drug administration，fda)等批准用于生物医学，具有良好的生物相容性、低毒性、易于凝胶等特点。海藻酸钠可与阳离子如钙离子、钡离子等发生离子交联，形成具有一定力学性能和形状的充填物。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的药物不能彻底溶解，有残留，消毒效果不佳，且不具备缓释效果，具备一定毒性，安全性不高。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶、制备方法及应用。
7.本发明是这样实现的，一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶的制备方法，所述可快速去除的三联抗生素相变凝胶的制备方法包括：
8.步骤一，分别进行海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap的配制；
9.步骤二，基于配制的海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap制备tap为不同浓度的alg-tap水凝胶。
10.进一步，步骤一中，所述分别进行海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap的
配制包括：
11.配制海藻酸钠溶液：取一定量的海藻酸钠，溶于50倍量的ddh2o中，搅拌过夜，得到浓度为2％的海藻酸钠溶液，利用0.22μm滤器在无菌条件下过滤，4℃保存；
12.配制caso4悬浮液：取一定量的caso4·
2h2o，分散于4.6-4.8倍量的ddh2o中，得到1.22m的caso4悬浮液，高温高压消毒，常温保存；
13.配制na2hpo4溶液：取一定量na2hpo4溶于7.8倍量的ddh2o中，得到0.9m的na2hpo4溶液，利用0.22μm滤器过滤后，常温保存；
14.配制tap：取相同量的甲硝唑、盐酸米诺环素、盐酸环丙沙星，利用10分之一量的ddh2o进行溶解，得到10mg/ml的tap溶液，利用0.22μm滤器过滤，4℃保存。
15.进一步，步骤二中，所述基于配制的海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap制备tap为不同浓度的alg-tap水凝胶包括：
16.(1)将配制好的alg溶液添加至无菌注射器a中，排除气泡；将配制好的caso4溶液和ddh2o添加至1ml的无菌注射器b中；
17.(2)向无菌注射器b中加入不同体积的na2hpo4溶液，并基于加入的na2hpo4溶液的体积量排出相同体积量的ddh2o，调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比；
18.(3)利用连接器联通无菌注射器a与无菌注射器b，排除气泡，混合均匀；向无菌注射器b中加入适量的tap溶液，制备得到tap为不同浓度的alg-tap水凝胶。
19.进一步，所述添加alg溶液、caso4溶液、ddh2o包括：
20.按照体积比alg溶液：caso4溶液：ddh2o＝40:1:3比例添加alg溶液、caso4溶液、ddh2o。
21.进一步，所述加入不同体积的na2hpo4溶液包括：加入0、1、3、5、10、20μl的0.9m的na2hpo4溶液。
22.进一步，步骤三中，所述调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比包括：调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比为10:1。
23.本发明的另一目的在于提供一种利用所述可快速去除的三联抗生素相变凝胶的制备方法制备的可快速去除的三联抗生素相变凝胶。
24.本发明的另一目的在于提供一种所述可快速去除的三联抗生素相变凝胶在制备用于治疗、缓解、预防再生性牙髓的药物中的应用。
25.进一步，所述应用方法包括：将所述凝胶放置于根管中，一段时间后，利用根管锉取出大部分凝胶，并通过冲洗去除粘在根管壁上的残余凝胶，即可。
26.进一步，所述冲洗包括：利用edta冲洗液反复冲洗。
27.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明克服了三联抗生素直接调合成糊剂置入根管造成的技术偏见，本发明以海藻酸钠为载体，降低了直接糊剂植入的毒性，延长了药物作用效果、减少了药物残留，提高了临床可操作性、治疗成功性和患者舒适性。
28.本发明填补了可快速清除的根管消毒剂的空白，在本发明之前，尽管临床医生在操作中发现了药物残留对于治疗失败的重要影响，尚未出现相关产品，本发明提供了一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶，可搭载tap，并具有一定的凝胶时间，符合临床操作习惯；在消毒后、复诊时，可使用临床常用的edta冲洗液彻底溶解取出，达到良好的治疗效果。
29.本发明的可快速去除的三联抗生素相变凝胶可在牙髓再生过程中进行根管消毒，具备相变特性，消毒后更容易快速、彻底去除。
30.本发明可调整合适的成分配比，既保证充足的临床操作时间，避免过早凝固，同时保证复诊治疗时可以快速溶解，避免延长患者张口时间、造成不适。
31.本发明在保留三联抗生素消毒能力的同时，增强了药物的缓释效果，在复诊治疗时可以快速去除，减少药物残留，提高诊疗效果和临床舒适度。
32.本发明提前将配制海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap的高浓度储存液方便调整参数。
附图说明
33.图1是本发明实施例提供的可快速去除的三联抗生素相变凝胶的制备方法流程图；
34.图2是本发明实施例提供的alg-tap水凝胶的多孔性示意图；
35.图2中的a是本发明实施例提供的添加0mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
36.图2中的b是本发明实施例提供的添加0.001mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
37.图2中的c是本发明实施例提供的添加0.01mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
38.图2中的d是本发明实施例提供的添加0.1mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
39.图2中的e是本发明实施例提供的添加0.5mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
40.图2中的f是本发明实施例提供的添加1.0mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
41.图3是本发明实施例提供的alp-tap水凝胶的缓释性能示意图；
42.图3中的a是本发明实施例提供的甲硝唑在alp-tap水凝胶的缓释性能示意图；
43.图3中的b是本发明实施例提供的米诺环素在alp-tap水凝胶的缓释性能示意图；
44.图3中的c是本发明实施例提供的米诺环素在alp-tap水凝胶的缓释性能示意图；
45.图4是本发明实施例提供的alg-tap水凝胶对细菌生长曲线的影响示意图；
46.图4中的a是本发明实施例提供的e.f在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线示意图；
47.图4中的b是本发明实施例提供的e.f生长曲线在10小时的统计图；
48.图4中的c是本发明实施例提供的p.g在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线示意图；
49.图4中的d是本发明实施例提供的p.g生长曲线在48小时的统计图；
50.图4中的e是本发明实施例提供的f.n在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线示意图；
51.图4中的f是本发明实施例提供的f.n生长曲线在48小时的统计图；
52.图5是本发明实施例提供的e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
53.图5中的a是本发明实施例提供的tap浓度为0时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
54.图5中的b是本发明实施例提供的tap浓度为0.001mg/ml时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
55.图5中的c是本发明实施例提供的tap浓度为0.01mg/ml时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
56.图5中的d是本发明实施例提供的tap浓度为0.1mg/ml时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
57.图5中的e是本发明实施例提供的tap浓度为0.5mg/ml时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
58.图5中的f是本发明实施例提供的tap浓度为1.0mg/ml时e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图；
59.图6是本发明实施例提供的alg-tap水凝胶浸提液持续对根尖牙乳头细胞(scaps)的细胞毒性示意图；
60.图6中的a是本发明实施例提供的第1-5天的细胞增殖折线图；
61.图6中的b是本发明实施例提供的第5-9天的细胞增殖折线图；
62.图6中的c是本发明实施例提供的第5天的细胞统计分析示意图；
63.图6中的d是本发明实施例提供的第9天的细胞统计分析示意图。
具体实施方式
64.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
65.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可快速去除的三联抗生素相变凝胶、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
66.如图1所示，本发明实施例提供的可快速去除的三联抗生素相变凝胶的制备方法包括：
67.s101，分别进行海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap的配制；
68.s102，基于配制的海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap制备tap为不同浓度的alg-tap水凝胶。
69.本发明实施例提供的分别进行海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap的配制包括：
70.配制海藻酸钠溶液：取一定量的海藻酸钠，溶于50倍量的ddh2o中，搅拌过夜，得到浓度为2％的海藻酸钠溶液，利用0.22μm滤器在无菌条件下过滤，4℃保存；
71.配制caso4悬浮液：取一定量的caso4·
2h2o，分散于4.6-4.8倍量的ddh2o中，得到1.22m的caso4悬浮液，高温高压消毒，常温保存；
72.配制na2hpo4溶液：取一定量na2hpo4溶于7.8倍量的ddh2o中，得到0.9m的na2hpo4溶液，利用0.22μm滤器过滤后，常温保存；
73.配制tap：取相同量的甲硝唑、盐酸米诺环素、盐酸环丙沙星，利用10分之一量的ddh2o中，得到10mg/ml的tap溶液，利用0.22μm滤器过滤，4℃保存。
74.本发明实施例提供的基于配制的海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap制备tap为不同浓度的alg-tap水凝胶包括：
75.(1)将配制好的alg溶液添加至无菌注射器a中，排除气泡；将配制好的caso4溶液和ddh2o添加至1ml的无菌注射器b中；
76.(2)向无菌注射器b加入不同体积的na2hpo4溶液，并基于加入的na2hpo4溶液的体积量排出相同体积量的ddh2o，调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比；
77.(3)利用连接器联通无菌注射器a与无菌注射器b，排除气泡，混合均匀；向无菌注射器b中加入适量的tap溶液，制备得到tap为不同浓度的alg-tap水凝胶。
78.本发明实施例提供的添加alg溶液、caso4溶液、ddh2o包括：
79.按照体积比alg溶液：caso4溶液：ddh2o＝40:1:3比例添加alg溶液、caso4溶液、ddh2o。
80.本发明实施例提供的加入不同体积的na2hpo4溶液包括：加入0、1、3、5、10、20μl的0.9m的na2hpo4溶液。
81.本发明实施例提供的调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比包括：调节无菌注射器a与无菌注射器b的体积比为10:1。
82.本发明实施例提供的可快速去除的三联抗生素相变凝胶在制备用于治疗、缓解、预防再生性牙髓的药物中的应用方法包括：将所述凝胶放置于根管中，一段时间后，利用根管锉取出大部分凝胶，并通过冲洗去除粘在根管壁上的残余凝胶，即可。
83.本发明实施例提供的冲洗包括：利用edta冲洗液反复冲洗。
84.本发明实施例提供的海藻酸钠溶液、caso4悬浮液、na2hpo4溶液、tap需现配现用，提前混合会缓慢发生反应，进而导致药物失效或无法成胶。
85.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
86.实施例1：
87.一种应用例
88.(一)溶液的配制
89.1.配制a液：取2g海藻酸钠，溶于100ml ddh2o中，搅拌过夜，制成终浓度为2％的海藻酸钠溶液。使用0.22μm滤器在无菌条件下过滤，4℃保存。
90.2.配制b液：取10.5gcaso4·
2h2o，溶于50ml ddh2o中，配制成1.22m caso4悬浮液，高温高压消毒，常温保存。
91.3.配制c液：取1.28gna2hpo4溶于10ml ddh2o中，配制成0.9m na2hpo4溶液，使用0.22μm滤器过滤后，常温保存。
92.4.配制tap：取甲硝唑、盐酸米诺环素、盐酸环丙沙星各100mg，溶于10ml ddh2o中，配制成10mg/ml的tap溶液，0.22μm滤器过滤，4℃保存。
93.(二)alg-tap相变水凝胶的制备
94.取600μl上述2％alg溶液于1ml无菌注射器(a管)中，排除气泡；取15μl 1.22m caso4溶液和45μl ddh2o于另一支注射器中(b管)，然后分别加入0,1,3,5,10,20μl 0.9m na2hpo4溶液，加入na2hpo4溶液时相应减少ddh2o体积，使a管与b管体积比为10:1。a管与b管
使用连接器联通(图1)，排除气泡，反复推挤至混匀。
95.在上述b管中加入适量的tap溶液，制作成tap为不同浓度的alg-tap水凝胶。
96.(三)alg-tap相变水凝胶的去除
97.使用根管锉取出大部分凝胶后，使用edta冲洗液反复冲洗，去除粘在根管壁上的残余凝胶。
98.下面结合具体实验对本发明的技术效果做进一步说明。
99.如图2所示，本发明实施例提供的alg-tap水凝胶的多孔性示意图；
100.图2中的a为添加0mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
101.图2中的b为添加0.001mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
102.图2中的c为添加0.01mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
103.图2中的d为添加0.1mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
104.图2中的e为添加0.5mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图；
105.图2中的f为添加1.0mg/ml的tap的alg-tap水凝胶多孔性示意图。
106.由图2可知，载入tap后，海藻酸钠水凝胶的孔隙大小无明显变化。海藻酸钠水凝胶通过冷冻干燥后，充分保留了自身的结构，通过电镜扫描，观察其空间结构。从sem的结果中可以看出，海藻酸钠水凝胶是具有多孔性的微观结构，使用image j软件测量，孔隙直径大约在60-160μm之间。加入抗生素后，水凝胶仍具有多孔性，孔隙大小基本在50-200μm之间，实验组与对照组间的孔隙大小无明显变化。tap对海藻酸钠水凝胶的多孔性状无明显影响，孔隙大小无明显改变。
107.如图3所示，三种抗生素均能从海藻酸钠水凝胶中释放，在12小时内释放的较快，甲硝唑和米诺环素的释放量高于70％，随后缓慢释放，在120小时候，释放量在90％以上；而米诺环素在12小时内释放量约45％，随后也缓慢释放，但释放总量在40％-60％之间。
108.图4是本发明实施例提供的alg-tap水凝胶对细菌生长曲线的影响；
109.图4中的a为e.f在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线；
110.图4中的b为e.f生长曲线在10小时的统计图；
111.图4中的c为p.g在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线；
112.图4中的d为p.g生长曲线在48小时的统计图；
113.图4中的e为f.n在alg-tap水凝胶培养基内的生长曲线；
114.图4中的f为f.n生长曲线在48小时的统计图。
115.由图4中的a与图4中的b可知，e.f在正常培养基中，2小时后进入对数生长期，8小时达稳定期。实验组中，当tap浓度为0～0.001mg/ml时，几乎对e.f的生长曲线无影响；当tap浓度增加至0.01mg/ml时e.f生长迟缓，对数生长期延长；当tap浓度大于等于0.1mg/ml后，e.f几乎不出现增长。e.f生长至10小时，对其od600进行统计分析(图4中的b)。tap浓度为0.001mg/ml时，alg-tap水凝胶对e.f的生长无明显影响(p》0.05)；tap浓度为0.01mg/ml时，alg-tap水凝胶对e.f的生长有明显的抑制作用(p《0.01)；tap浓度高于或等于0.1mg/ml时，alg-tap水凝胶对e.f的生长有显著的抑制作用(p《0.001)。
116.p.g的生长曲线如图4中的c与图4中的d可知所示，生长至48小时的统计分析见图4中的d所示，实验组中tap浓度为0.001mg/ml时，alg-tap水凝胶对p.g的生长无明显影响(p》0.05)，而tap浓度大于或等于0.01mg/ml时，alg-tap严重抑制p.g的生长(p《0.001)，p.g几
乎停止增殖。
117.f.n的生长曲线如图4中的e与图4中的f所示，生长至48小时的统计分析见图4中的f所示，实验组中当tap浓度小于或等于0.001时，f.n生长缓慢(p《0.005)，当tap浓度大于或等于0.01mg/ml时，f.n基本停止生长(p《0.001)。
118.图5是e.f在alg-tap水凝胶表面粘附(
×
20000)示意图。
119.图5中的a中tap浓度为0，水凝胶表面粘附大量的细菌；图5中的b中tap浓度为0.001mg/ml，水凝胶表面仅见少量的细菌；图5中的c中、图5中的d中、图5中的e中以及图5中的f中tap浓度一次为0.01、0.1、0.5、1.0mg/ml，水凝胶表面均无细菌粘附。
120.海藻酸钠水凝胶在与e.f培养24小时，水凝胶冻干后，经表面处理，电镜扫描。不含tap的海藻酸钠水凝胶表面粘附了大量的细菌，tap浓度为0.001mg/ml的水凝胶表面仅见数量较少的细菌，当tap浓度大于或等于0.01mg/ml时，水凝胶表面未见粘附的细菌。
121.图6表示alg-tap水凝胶浸提液持续对根尖牙乳头细胞(scaps)的细胞毒性；
122.图6中的a和图6中的b为细胞增殖折线图，alg-tap水凝胶浸提液持续培养细胞5天，细胞增殖速度随tap浓度增大而减慢，5天后换为正常培养基，被抑制的细胞重新恢复增殖活性。
123.由图6中的c可知第5天细胞统计分析，alg-tap水凝胶均抑制了scaps的增殖(p《0.01)。
124.由图6中的d可知第9天细胞统计分析，被抑制的细胞恢复增殖，不含tap的alg-tap水凝胶的细胞数量与对照组接近(p》0.05)，其余实验组仍低于对照组(p《0.05)。
125.在scaps与海藻酸钠水凝胶浸提液持续培养5天，alg-tap水凝胶抑制了scaps的增殖(p《0.01)，并且抑制程度随tap的浓度增加而增强，当浓度达1mg/ml时，scaps几乎停止增殖，表现出完全的增殖毒性；当海藻酸钠水凝胶浸提液持续作用scaps 5天，换为正常培养基培养后，被抑制增殖的细胞重新恢复增殖能力，继续增殖，scaps培养至第9天时，不含tap的水凝胶组的细胞数量与对照组接近(p》0.05)，其他组仍较对照组低(p《0.05)。
126.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。