一种无创血糖检测的水凝胶微针贴片及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种无创血糖检测的水凝胶微针贴片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种严重威胁人类健康和生命安全的全球性慢性疾病，其典型特征是高血糖。世界卫生组织报告称，2017年，全球共有糖尿病成年患者约有4.25亿，预计随着人口老龄化和生活方式的改变，患者数量还将继续增加。如果血糖水平控制不佳，会引起糖尿病患者的各类并发症，如截肢、失明、心血管和肾脏疾病等，严重的甚至失去生命。对糖尿病患者进行有规律的血糖监测，可以更好地控制血糖，预防并发症。
3.市面上的血糖监测产品通常采用手指采血的方法，并借助于有源性的血糖测试仪器来检测采集的指尖血的血糖值。手指反复刺破，不仅会导致患者疼痛和依从性降低，而且还会导致皮肤刺激和细菌感染。
4.研究人员已经进行了大量无创血糖监测的研究。其中，光学测量，如红外光谱、光学相干层析成像和荧光很容易受到混杂因素的干扰。使用代谢热、拉曼光谱、阻抗和极化变化的间接测量对葡萄糖缺乏特异性。体液，如汗液、唾液和眼泪，也可以用于测量体内葡萄糖水平。然而，这些液体中的葡萄糖浓度仅为血液中的1-10％，并且受环境温度变化、药物和体液中乳酸等成分的影响，因此，血糖相关性弱，测量精度不确定。
5.与上述方法相比，测定体内间质液(isf)中的葡萄糖更有前景，因为间质液是可溶性生物分析物(包括蛋白质、多肽、代谢物和核酸)特别丰富的来源，与血液密切相关。目前提取间质液的方法有超声、激光技术和反向离子电泳等。虽然反向离子导入是这些方法中最普遍的，但在血糖相关性有待进一步改善，目前它很少被医生认可。此外，高密度电流的使用和长时间的预热往往会引起使用者的皮肤刺激和疼痛。
6.与间质液提取相比，基于生物识别元件的微针可以特异性捕获间质液中的生物标志物，然后发生反应，从而进行简单高效的生物检测。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种无创血糖检测的水凝胶微针贴片及其制备方法和应用。本发明利用可定量检测葡萄糖水平的智能水凝胶，并通过微针技术制备水凝胶微针，对间质液进行原位提取，并对间质液中的葡萄糖进行实时、快速、高效的分析和检测，可用于无创检测血糖。
8.第一方面，本发明提供一种无创血糖检测的水凝胶微针贴片的制备方法，所述水凝胶微针贴片为由尖锐锥形微针水凝胶排列于基底形成的方阵结构，
9.制备方法包括以下步骤：
10.(1)避光条件下，将光敏感性水凝胶溶液、光引发剂、葡萄糖氧化酶和ph响应功能水凝胶溶液混合，浇筑到微针模板中，通过高速离心预成型；再在光照下固化成型形成微针
阵列；所述敏感性水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液；所述ph响应功能水凝胶溶液由羧甲基纤维素和丙烯酸-2-羟乙基酯在过硫酸钾和聚乙二醇二丙烯酸酯的共同作用下制备而成；
11.(2)避光条件下，在微针阵列底面涂覆透明光敏树脂；再经紫外光固化，形成微针阵列的基底；
12.(3)干燥、脱模形成水凝胶微针贴片。
13.本发明设计全部采用具有生物相容性的材料。该体系含有两种水凝胶成分：一种是光敏感性水凝胶甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)，具有光固化成型特性，也可以是其它的光敏感性水凝胶；另一种是ph响应功能水凝胶，其缩写为cmc-phea，具有ph响应性变形特性，也可以是其它类型的ph响应性水凝胶。为了加快cmc-phea水凝胶对ph的响应性，将其超声破碎，形成cmc-phea纳米凝胶。
14.本发明将葡萄糖氧化酶整合到上述ph响应性的水凝胶微针中。当微针与葡萄糖接触时，由于在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖反应产生葡萄糖酸，使水凝胶微针处于不同的酸性微环境(即不同ph)中，从而使得水凝胶微针对不同葡萄糖浓度产生特异性和响应性变化。
15.进一步，所述微针贴片至少含有一根微针，可为单排或阵列结构；锥形微针的高度为100-800μm；单排或阵列中微针的间距为100-800μm。优选的，所述锥形微针的高度为600μm，直径为400μm，针顶到针顶的距离为600μm；所述微针阵列由11
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11个针组成，尺寸为6.3
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6.3mm；所述方阵结构的尺寸为1
×
1cm。在实际应用中，由于微针极小，对组织作用也很小，并不会到达血管和末梢神经，因此患者很少或不感到疼痛，也不出血。用户可以将微针刺入身体的任意部位，如手臂、腹部等，微针通过表面张力提取间质液，根据血糖浓度发生溶胀反应。
16.进一步，所述光引发剂为i2959紫外光引发剂或lap蓝光引发剂，所述光引发剂的质量百分数为水凝胶重质量的0.05％-0.1％。
17.进一步，所述水凝胶中葡萄糖氧化酶的浓度为0.02-0.05g/m1。
18.进一步，所述甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶由甲基丙烯酸酐化明胶以质量百分比为8％-12％溶解在水中，得到甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液。
19.进一步，所述ph响应功能水凝胶溶液的制备方法如下：
20.(a)在50-100℃和搅拌速度为300-500r/min下，将羧甲基纤维素溶于水中：
21.(b)惰性气体存在下，将过硫酸钾加入所述步骤(a)得到的溶液中混合并反应：
22.(c)向所述步骤(b)的溶液中加入丙烯酸-2-羟乙基酯，继续反应至溶液成乳白色：
23.(d)向所述步骤(c)的溶液总加入聚乙二醇二丙烯酸酯，继续反应至结束：
24.(e)将所述步骤(d)得到的反应产物透析，去除未反应的反应物，得到所述ph响应水凝胶；
25.所述羧甲基纤维素、丙烯酸-2-羟乙基酯、引发剂和交联剂的摩比为：1：((5.48-8.62)
×
103)：(2.65-3.60)：(28.77-86.33)。
26.进一步，所述光敏树脂为美国formlab公司生产的clear v4透明光敏树脂。
27.进一步，所述步骤(1)中光照参数为蓝光、紫光或紫外光，光照时间3-60s；所述步骤(2)中紫外固化时间为1-2h。优选的，405nm蓝紫光，光照时间约3s；所述步骤(2)中紫外固
化时间约为2h。
28.第二方面，本发明提供利用第一方面所述方法制备得到的无创水凝胶微针贴片。
29.第三方面，本发明提供利用第二方面所述的无创水凝胶微针贴片作为制备无创血糖检测的微针贴片的应用。
30.由于所述微针具有无创性或微创性，将水凝胶制备成微针的形式，利用微针的尖锐的倒三角形状，有利于刺透皮肤，快速提取体内间质液，进一步，水凝胶微针对间质液中的葡萄糖产生特异性及响应性变化，拔出微针后，观察微针的高度变化和膨胀率变化，来实时、定量检测体内的葡萄糖水平(图1)。
31.本发明有益效果如下：
32.该无创血糖检测的水凝胶微针贴片的微针阵列设计，并结合水凝胶的葡萄糖响应的特性，可用于血糖检测，并可实现无创或微创的、可视化的体内血糖快速检测。
33.本发明将具有ph响应性水凝胶材料以微针形式制备，双层微针贴片保障了微针部分的单独响应，可以通过微针高度变化进行定量ph和血糖检测。微针通过挤压出的间质液进行血糖检测，反应十分迅速，仅需5s，具有无创性和无痛性，不会产生感染的问题，更易提高病人的依从性。正常血糖和高血糖对应的微针高度的变化是肉眼可观查的，可快速定性。
34.本发明提供的制备方法，制备步骤简单，工艺条件易达到，结合微针模板，利用光固化成型，以制备出本发明所述的水凝胶微针贴片。
附图说明
35.图1为用于无创血糖检测的微针贴片及其工作原理示意图；
36.图2为不同葡萄糖浓度时产生的酸性微环境表征。(a)葡萄糖反应产生酸性微环境的作用机理；(b)不同浓度葡萄糖溶液随时间的酸性变化；
37.图3为智能水凝胶双层微针的制备流程示意图；
38.图4为微针的表观形态及微观结构图；
39.图5为微针在类皮肤中的葡萄糖响应性。(a)微针阵列在穿刺含不同浓度葡萄糖的类皮肤(琼脂糖凝胶)后的图片；(b)单根微针的放大图片；(c)不同葡萄糖浓度下微针的高度；(d)不同葡萄糖浓度下微针的膨胀比；
40.图6为微针贴片在小动物皮肤上的无创作用效果。(a)微针贴片应用于小鼠皮肤表面的示意图；(b)微针贴片应用于小鼠皮肤表面的照片；(c)移走微针后，小鼠皮肤上留下的针孔的图片；(d)小鼠皮肤在针孔处切片的h&e染色图片；(e)移走微针不同时间后皮肤的恢复效果图片；
41.图7为微针贴片对小鼠血糖的检测效果。(a)商用血糖仪检测的小鼠体内血糖值；(b)微针应用在不同小鼠的皮肤后的对应图片；(c)小鼠在不同血糖浓度时对应的微针高度；(d)小鼠在不同血糖浓度时对应的微针膨胀比。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明，本发明的内容完全不限于此。
43.实施例1
44.1.ph响应水凝胶cmc-phea的制备
45.首先，将50ml蒸馏水和羧甲基纤维素(carboxymethy1 cellulose，cmc)(5.56
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10mo1)放入250m1三颈圆底烧瓶中，以75℃(50-100℃，优选75℃)和400rpm(300-500rpm，优选400rpm)的速度在水浴中搅拌至cmc充分溶解。然后将氮气注入装有cmc溶液的分压瓶中持续20分钟，使溶液中氧的含量充分降低，然后将添加过疏酸钾(kps，1.85
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105mo1)作为引发剂加到溶液中混合反应20分钟。接下来，添加3.92
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10mo1的丙烯酸-2-羟乙基酯(2-hydroxyethy1 acrylate，2-hea)。当反应混合物变成了乳白色，加入0.32
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10mo1交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯pegda，继续反应3h，反应结束后，室温下充分冷却。在合成过程中调整搅拌速度以诱导均相合成。用5l蒸馏水对该化合物进行3天以上的透析，去除未反应的交联剂和单体形成ph响应水凝胶cmc-phea。然后利用超声破碎仪将水凝胶破碎即得。
46.2.甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶(gelma)光响应水凝胶的制备
47.将gelma原料以质量百分比10％(8％-12％，优选10％)溶解在去离子水中。lap蓝光引发剂以质量百分比0.05％-0.1％的比例溶解在10％的gelma溶液中。在避光条件下操作，防止gelma在自然光下交联。并且在避光条件下，在37℃(28-45℃，优选37℃)超声5分钟，使之充分混合：然后在37℃热水中浸泡半小时，使之充分溶解。在405m光源下照射混合溶液，瞬间(大约1-2s)固化，即得光固化的gelma光敏感性水凝胶。
48.3.双重响应水凝胶体系的制备
49.利用cmc-phea纳米凝胶的ph响应性和gelma水凝胶的光固化成型特性，将上述两种水凝胶按照1:3的体积比例混合，并在其中添加葡萄糖氧化酶(gox)，使其在水凝胶溶液中溶解得到34mg/ml的酶溶液。放置在50℃烘箱中保温，直至气泡消失，溶液变得澄清。然后采用405nm的紫外光照射，进行光固化，得到ph和葡萄糖双重响应的水凝胶。
50.制备的水凝胶由于含有的cmc-phea纳米凝胶成分，该水凝胶对ph具有响应性，在酸性环境中，水凝胶的溶胀较小；在中性环境中，水凝胶的溶胀较大。
51.由于葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖转化为葡萄糖酸(图2a)，使环境中ph降低(图2b)。我们证实了不同葡萄糖溶液的ph值变化，ph值随着孵育时间的延长而降低，并且葡萄糖浓度越高，溶液ph值下降越快(图2b)。
52.由于不同葡萄糖浓度下产生的不同酸度微环境，因此该水凝胶对葡萄糖也具有响应性，即：在正常葡萄糖浓度时，水凝胶周围中性或弱酸性，该水凝胶的溶胀较大；在高浓度葡萄糖中，水凝胶周围酸性强，水凝胶的溶胀程度较小。
53.由于该水凝胶具有ph和葡萄糖双重响应，据此可用于葡萄糖的检测。
54.4.双重水凝胶微针的制备
55.如图3所示，将上述双重响应水凝胶溶液，在50℃保温，随后滴加到微针模具表面，通过高速离心机(40℃，3800rpm，10min)离心三次，使水凝胶填充进模具空腔中。用小刀刮掉表面多余的水凝胶，利用波长为405nm的蓝紫光对其进行固化，光强为20％，照射时间约3s。再在模具表面滴加一定量的透明光敏树脂(美国formlab公司，clear v4)，待树脂表面变平整后，再次照射紫外光进行固化，光强为20％，照射时间约2h。经过干燥、脱模，得到基底为坚硬的透明树脂，针尖为具有ph和葡萄糖双重响应水凝胶的微针阵列。
56.如图4所示，制备得到的微针贴片外形完整，含有11x 11根微针，每根微针呈现出尖锐的圆锥形结构。
57.5.含不同葡萄糖浓度的类皮肤凝胶的制备
58.为了模拟微针在皮肤上的应用，我们先采用琼脂糖制备一种类皮肤凝胶。
59.取0.5g琼脂糖溶于10ml水中，重复9次，制得9组样品。在不断搅拌下加热至70℃，直到琼脂糖完全溶解。在琼脂糖溶液中分别加入0mg、5.4mg、10.8mg、16.2mg、21.6mg、27mg、32.4mg、36mg、39.6mg d-葡萄糖，混合均匀，制得葡萄糖浓度分别为0、3、6、9、12、15、18、20、22mm的琼脂糖溶液。将溶液倒入小号的细胞培养皿中，冷却至室温并加盖保持30min，得到含不同葡萄糖浓度的类皮肤琼脂糖凝胶，高度为3mm，用于接下来的微针穿刺实验。
60.6.类皮肤中葡萄糖浓度的可视化检测
61.利用接触角测试仪及其自带的ccd相机来测量微针的高度变化。
62.将微针贴片固定在接触角样品平台上，调整接触角针的位置，使其针尖靠近微针针尖，并且与微针阵列最前排的微针处于一个水平面，调焦使两种针尖同时对焦。用接触角测试仪自带的ccd相机，记录此时接触角针的直径和微针阵列单根针的高度(图5a)。
63.取下微针贴片，并用手指将微针阵列按压至类皮肤凝胶中，保持3s后拔出。利用接触角仪，再次测量微针针尖的高度(图5a)。更换微针和凝胶，并重复试验，记录微针刺过含不同葡萄糖浓度的类皮肤凝胶后的高度变化。
64.结果及分析：
65.微针刺入类皮肤时，微针与类皮肤凝胶中的葡萄糖发生反应，并产生不同程度的响应。通过测试不同类皮肤中微针的大小变化，进而对类皮肤中葡萄糖浓度进行分析。若置于正常浓度葡萄糖的类皮肤中，微针周围呈弱酸性，微针膨胀程度大；若置于高浓度葡萄糖的类皮肤中，微针周围呈强酸性，微针膨胀程度小。
66.结果证实：微针在穿刺含6mm葡萄糖的类皮肤后，膨胀较大；在穿刺含12mm葡萄糖的类皮肤后，膨胀较小(图5b)。因而，可通过观察微针的形态对血糖的高低进行定性判断。
67.统计结果表明，在穿刺含不同浓度葡萄糖的类皮肤后，微针的大小随着葡萄糖浓度的变化呈现出梯度、线性变化(图5c-d)。随着葡萄糖溶液浓度的增加，微针的高度和膨胀比逐步减小(图5c-d)。基于类皮肤凝胶中的结果，根据微针的溶胀比，可以推测未知类皮肤中葡萄糖的浓度。
68.7.体内血糖浓度的可视化检测
69.采用c57小黑鼠，在小鼠体内腹腔注射链脲佐菌素(stz)制备糖尿病模型小鼠。通过stz注射次数和注射剂量的调控，可以得到体内不同血糖浓度的小鼠(体内低糖、中糖和高糖的小鼠)。
70.将小黑鼠背部区域脱毛，用酒精棉片消毒后，用大拇指将微针贴片按压入小鼠皮肤中(图6a-b)，保持3秒后，移出贴片。利用接触角仪器的ccd相机，对水凝胶微针的高度进行测量。
71.移除微针贴片后不同时间点，利用相机对小鼠的皮肤进行拍照记录，观察皮肤的恢复情况。
72.另外的，移除微针贴片后，立即将小鼠的皮肤放入组织固定液中固定，经过石蜡包埋、切片、h&e染色后，利用显微镜观察微针和皮肤的相互作用。
73.结果分析：
74.对于小鼠而言，微针能很好的穿刺小鼠的皮肤，并在皮肤上留下空洞状的小孔(图6c-d)。移除微针后，随着时间的推移，小鼠皮肤能恢复至原来的形貌(图6e)，验证了微针对
皮肤作用的无创性。
75.对于微针而言，当微针刺入皮肤后，皮下的间质液渗出并与微针相接触，间质液中葡萄糖与微针中的葡萄糖氧化酶发生反应，生成葡萄糖酸，不同的酸度微环境进而使水凝胶微针产生不同的溶胀程度。
76.在正常血糖小鼠(8.3mm)的皮肤上进行穿刺后，微针的高度变化最大，其膨胀率最大；在高血糖小鼠(25.7mm)的皮肤上穿刺后，微针的高度变化最小(图7a-b)。我们分析了穿刺不同小鼠的皮肤后微针的高度(图7c)和膨胀率(7d)，结果表明，在血糖浓度低(8.3mm)的小鼠中，微针高度的变化最大，膨胀率高达21.8％；随着小鼠体内血糖浓度的升高，微针高度逐渐降低，当小鼠体内血糖很高时(25.7mm，模拟糖尿病的高血糖)，微针的膨胀率仅有1.8％。
77.小鼠体内实验和类皮肤凝胶中的实验趋势相吻合。同样的，我们也可以根据穿刺小鼠皮肤后的微针高度变化来推导未知小鼠体内的血糖浓度。
78.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。