免疫原性组合物的制作方法

1.本发明涉及用于提供针对由志贺氏菌属（shigella）菌株的细菌感染造成的疾病的保护的免疫原性组合物，特别是疫苗组合物。
2.发明背景志贺氏菌病是一个重大的全球健康问题，引起超过700万伤残调整寿命年（disability-adjusted life years）和每年100,000例死亡，特别是在发展中国家的5岁以下的儿童中[1,2,3]。志贺氏菌病由志贺氏菌属的革兰氏阴性细菌造成，基于脂多糖（lps）的外多糖抗原（o抗原，oag）的结构和组成，将所述志贺氏菌属分成4个种并进一步分成50个血清型：宋氏志贺氏菌（s. sonnei）（1个血清型）、弗氏志贺氏菌（s. flexneri）（15个血清型）、鲍氏志贺氏菌（s. boydii）（19个血清型）和痢疾志贺氏菌（s. dysenteriae）（15个血清型）[4]。有限数目的血清型促成全球疾病负担，并且这些在区域之间和随时间变化[4,5,6,7]。宋氏志贺氏菌（shigella sonnei）和弗氏志贺氏菌（shigella flexneri）2a是世界上当前占优势的血清型[4,6]。
[0003]
临床志贺氏菌病的标志是与发热、恶心、厌食、脱水、粘液脓性和血性腹泻以及里急后重有关的急性直肠结肠炎。志贺氏菌造成的痢疾是地方性流行的，且在发展中国家中造成数百万的发病。例如，据估计每年有1.25亿例志贺氏菌腹泻，其中99%发生在发展中国家，且其中69%发生在5岁以下的儿童中。由志贺氏菌病引起的发病率和死亡率在发展中国家的儿童中是特别高的。
[0004]
对志贺氏菌疫苗的现有方案(在[8]中综述)已经基于活减毒菌株，其用于口服免疫、与o糖缀合用于注射、用于鼻内使用的蛋白体(具有连接的志贺氏菌属lps的脑膜炎球菌外膜囊泡)、用于鼻内使用的侵染素复合物(invaplex) (包含ipab、ipac和lps的志贺氏菌属的亚细胞提取物)和从具有脱毒lps的δmsbb菌株制备的核蛋白-核糖体复合物。尽管这些疫苗中的两种已经在现场试验中是有效的，但是都没有针对多种志贺氏菌属血清型进行保护。
[0005]
最成功的最近疫苗候选物（胃肠外宋氏志贺氏菌oag缀合物）在一次免疫接种以后在年轻成年人中表现出针对同源宋氏志贺氏菌感染的74%保护[9]，且在两次免疫接种以后在大于3岁的儿童中表现出71%效力[10]。相反，所述疫苗在3岁以下的儿童中表现出低免疫原性和保护的缺乏[10]。保护的水平与oag疫苗-特异性抗体应答的水平平行，所述应答测量为对含有同源oag的宋氏志贺氏菌lps的抗体应答(抗-lps应答) [10]。
[0006]
因而，本发明的一个目的是提供改善的免疫原性组合物，特别是可以用于针对志贺氏菌属的多种血清型进行保护的疫苗组合物。更具体地，一个目的是提供产生对oag的更强应答（特别是在幼儿中）的疫苗组合物。
[0007]
发明概述在第一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含从宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌纯化的膜抗原的泛化模块(gmma)。具体地，所述gmma包含经修饰的脂质a。具体地，所述经修饰的脂质a是脂质a的低毒或脱毒形式，作为非限制性例子，五酰化的脂质a、非天
然存在的六酰化的脂质a（其中所述酰基基团之一被取代）和/或六酰化的脂质a（其中月桂酰基链被棕榈油酰基链替换）。更具体地，至少75%的宋氏志贺氏菌gmma具有在25 nm至40 nm范围内的直径，如通过电子显微术确定的。宋氏志贺氏菌gmma可以具有在32 nm至38nm范围内的平均半径(通过hplc-sec malls确定)，且弗氏志贺氏菌gmma可以具有21 nm至28 nm之间的平均半径(hplc-sec malls)。在一个实施方案中，从至少一种选自2a、3a和6的菌株中纯化所述弗氏志贺氏菌gmma。具体地，所述免疫原性组合物包含从菌株2a、3a和6中的每一种纯化的弗氏志贺氏菌gmma。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含从以下菌株纯化的gmma：(a)宋氏志贺氏菌，(b)弗氏志贺氏菌2a，(c)弗氏志贺氏菌3a和(d)弗氏志贺氏菌6。具体地，所述gmma以1:1:1:1的比率存在。更具体地，所述免疫原性组合物包含小于100
µ
g/ml的浓度的gmma蛋白。具体地，所述免疫原性组合物包含从菌株2a、3a和6中的每一种中纯化的弗氏志贺氏菌gmma和从至少一种选自1b和2b菌株的其它弗氏志贺氏菌菌株纯化的gmma。具体地，所述免疫原性组合物包含从以下菌株纯化的gmma：(a)宋氏志贺氏菌δtolr，δhtrb，virg::nadab，(b)弗氏志贺氏菌2aδtolr，δmsbb，(c)弗氏志贺氏菌3aδtolr，δmsbb和(d)弗氏志贺氏菌6δtolr，δmsbb或δhtrb。更具体地，所述弗氏志贺氏菌菌株是毒性质粒消除的。所述组合物还可以含有其它弗氏志贺氏菌菌株的gmma。
[0008]
具体地，所述免疫原性组合物包含佐剂。更具体地，所述佐剂是吸附剂。更具体地，所述佐剂是不会增强gmma的免疫原性（例如，如通过抗
‑ꢀ
lps抗体应答测得的）的吸附剂。特定佐剂包括，例如，铝佐剂，包括氢氧化铝、alhydrogel
®
、磷酸铝、硫酸铝钾和明矾。
[0009]
在第二方面，本发明提供了一种用于针对志贺氏菌属感染免疫患者的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用本发明的第一方面的免疫原性组合物。
[0010]
在第三方面，本发明提供了用于针对志贺氏菌属感染免疫患者的方法中的本发明的第一方面的组合物。
[0011]
附图简述图1：肌肉内注射含有100 μg蛋白的剂量的1790gahb (圆圈)或等体积的生理盐水(菱形)以后在兔中的平均温度升高(疫苗接种后的平均值
‑ꢀ
疫苗接种前温度)。垂直条表明平均值标准误差。对于1790gahb，n= 12；且对于注射盐水的兔，n= 6。
[0012]
图2(a)：在使用人主体的临床试验中免疫剂量1、2和3后产生的抗-宋氏志贺氏菌lps抗体水平(中位疫苗接种后水平)。
[0013]
图2(b)：在使用人主体的临床试验中在整个研究（包括免疫3后6个月随访）中的抗-宋氏志贺氏菌lps抗体水平(中位疫苗接种后水平)。
[0014]
图3：该框图显示了使用从(a)宋氏志贺氏菌、(b)弗氏志贺氏菌3a和(c)弗氏志贺氏菌2a纯化的lps作为包被抗原通过elisa评估的用1790gahb、弗氏志贺氏菌-2a、弗氏志贺氏菌-3a和4-价组合免疫的组中的抗体分布。在(a)和(b)中，绘制了elisa单元，在(c)中，显示了elisa od。将25%至75%显示为矩形，将最小值和最大值显示为短线，且将中位值显示为矩形中的水平条。测定中的检测限为2.2(a)和1.6 (b) elisa单元。给低于检测限的结果指定检测限的一半的值(在a中的1.1，在b中的0.8)。在(c)中显示的测定的平均背景od为0.056。
[0015]
图4：该散布图显示了每组中抗-宋氏志贺氏菌oag (a)、抗-弗氏志贺氏菌3a (b)或抗-弗氏志贺氏菌2a的elisa od结果(c)抗体分布的对数转化的各个结果相对于对数转
化的剂量的关系。显示了单一制剂和4-价制剂的平行剂量-响应曲线。(a) 1790gahb和4-价组合对来自宋氏志贺氏菌的lps的剂量-响应曲线。(b)弗氏志贺氏菌3a和4-价组合对来自弗氏志贺氏菌3a的lps的剂量-响应曲线。(c)弗氏志贺氏菌2a和4-价组合对来自弗氏志贺氏菌2a的lps的剂量-响应曲线。曲线的y截距不是显著不同的，p = 0.31(a)，p= 0.74(b)，p= 0.75 (c)。
[0016]
发明详述膜抗原或gmma的泛化模块是从具有高水平的lps、脂蛋白、蛋白和活化先天性免疫应答的其它抗原的革兰氏阴性细菌的外膜衍生出的颗粒。gmma由遗传上修饰的细菌菌株产生，所述菌株被突变以增强囊泡生产和除去或修饰抗原(例如脂质a)。可以实现增强的自发囊泡产生，例如，通过在膜完整性的维持中涉及的蛋白的靶向删除(参见下文)。gmma的外表面对应于它们的来源细菌的外表面，从而在膜的背景下保留所有膜抗原(包括例如脂多糖、脂寡糖、脂蛋白、蛋白)。gmma (不同于去污剂提取的omv)将这些外膜组分保留在它们的天然构象和正确取向，从而更好地保留针对它们的来源细菌菌株的免疫原性。因而，gmma是高度免疫原性的，并且先天性免疫的这种强烈活化可以在人主体中导致不可接受的反应，例如发热应答，或在极端情况下，脓毒性休克，特别是如果胃肠外地施用。
[0017]
本发明是基于下述发现：可以使用遗传操作来提供生产（即使在低剂量也是）免疫原性的gmma的志贺氏菌属细菌菌株，其具有降低的例如致热原性的风险。发明人还已经发现，铝佐剂的应用会有利地增加包含gmma的免疫原性组合物的体内耐受性，进一步降低例如致热原性的风险。所以，可以组合从多种志贺氏菌属细菌菌株纯化的gmma的剂量以制备具有每剂至高达100
µ
g/ml或更高的总gmma蛋白浓度的多价免疫原性组合物。该发现是惊人的，因为在文献中，研究已经一般地探究了降低omv含量来避免发热，这可能损害含有去污剂衍生的omv的疫苗在婴儿疫苗接种计划中的可接受性。例如，在4cmenb疫苗bexsero的研究中，观察到大约一半主体会在第一剂疫苗接种以后经历≥38.5℃的温度[11]。相反，在本文实施例中提供的临床试验数据证实，使用包含100
µ
g/ml宋氏志贺氏菌gmma (在4cmenb中的omv的等同含量的4倍)的免疫原性组合物的疫苗接种被良好耐受。在小鼠和兔中产生的免疫原性结果支持了在人类中的数据。
[0018]
志贺氏菌属细菌本发明是基于选自血清群痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌中的一个或多个的志贺氏菌属细菌的应用。具体地，本发明是基于选自血清群弗氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌的至少两种志贺氏菌属菌株的应用，具体地选自宋氏志贺氏菌、弗氏志贺氏菌2a、弗氏志贺氏菌3a和弗氏志贺氏菌6。在某些实施方案中，可以使用宋氏志贺氏菌53g、弗氏志贺氏菌1b stansfield、弗氏志贺氏菌2a 2457t、弗氏志贺氏菌2b 69/50、弗氏志贺氏菌a 3a 6885和/或弗氏志贺氏菌6 10.8537。
[0019]
具体地，用于本发明中的志贺氏菌属菌株是具有被破坏的tol-pal系统的δtolr菌株，所述被破坏的tol-pal系统造成所述细菌在细菌复制过程中将更大量的gmma释放进培养基中。还可以预见到tol-pal复合物中的其它基因(例如，tola)的缺失，例如，如在wo 2011/036564中公开的。
[0020]
用于本发明中的志贺氏菌属菌株包括相对于野生型菌株的一个或多个其它变化。具体地，用于与本发明一起使用的菌株包括一个或多个导致htrb、msbb1和/或msbb2的失活
的突变。作为非限制性例子，合适的突变可以选自δhtrb、δmsbb1和δmsbb2。为简洁起见，msbb1和msbb2的双缺失也可以被称作δdmsbb。htrb或msbbl和msbb2的失活会减少脂质a中的酰化。在某些实施方案中，用于与本发明一起使用的菌株缺少lps中的o抗原，由此避免血清型特异性的应答。在宋氏志贺氏菌中，当毒性质粒被除去时，o抗原不存在。在其它实施方案中，用于与本发明一起使用的菌株产生包含o抗原的lps。o抗原的存在可以是有益的，因为免疫原性组合物会引起血清型特异性的和另外的交叉反应性的免疫应答。六酰化的脂质a在lps中的缺失是优选的。毒性质粒的缺失会导致msbb2基因的缺失，并且染色体msbbl基因可以被失活，由此除去肉豆蔻酰基转移酶活性和提供lps中的五酰化的脂质a。对于弗氏志贺氏菌msbb突变体，含有msb2基因的毒性质粒的缺失是优选的。用于本发明中的优选的志贺氏菌属菌株具有五酰化的lps。可替换地，htrb的失活导致月桂酰基链的缺失，且因而可以在某些菌株中产生五酰化的lps和/或比野生型脂质a更低毒的脂质a形式。例如，在弗氏志贺氏菌中，htrb的失活可以通过另一种酶lpxp（其产生六酰化的脂质a）的活性来补偿，其中月桂酰基链被棕榈油酰基链替换。包含棕榈油酰基链的六酰化的脂质a具有比野生型脂质a更低的毒性。因而，在某些实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含从宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌纯化的gmma，其中所述gmma包含五酰化的脂质a和/或六酰化的脂质a，其中月桂酰基链被棕榈油酰基链替换。具体地，用于本发明中的合适菌株包括以下突变：(a)宋氏志贺氏菌: δ tolr, δhtrb, virg::nadab, (b)弗氏志贺氏菌2a: δtolr, δmsbb, (c)弗氏志贺氏菌3a: δtolr, δmsbb和(d)弗氏志贺氏菌6: δtolr, δmsbb或δhtrb。合适的菌株公开在实施例中。其它合适的菌株是本领域已知的，例如在wo2011/036564中。用于培养志贺氏菌属的培养条件是本领域众所周知的，例如参见参考文献[12]至[14]。例如，可以使用有机氮源(诸如氨基酸混合物，例如含有ala、arg、asn、asp；可以使用酪蛋白氨基酸)、甘油作为碳源等培养它们。l-天冬氨酸在培养基中的包含是特别有用的，且可以作为氮和碳源起作用。
[0021]
对于宋氏志贺氏菌，o-抗原基因是在毒性质粒上，且oag组分对于从其纯化或分离的gmma而言是合乎需要的。因而，在某些实施方案中，将所述宋氏志贺氏菌菌株突变以用来自大肠杆菌的nada和nadb替换virg，由此在保留毒性质粒的同时除去志贺氏菌属的烟酸营养缺陷体；通过在不含烟酸的培养基中的生长，确保质粒编码的oag的生产。一种示例性的突变体宋氏志贺氏菌菌株可以包括以下修饰：δtolr::kanδvirg::nadabδhtrb::cat。
[0022]
示例性的突变体弗氏志贺氏菌菌株可以包括以下修饰：δtolr::kanδhtrb::cat或δtolr::kanδmsbb1::cat。仅将msbb1突变引入质粒消除的菌株中，因为质粒的除去会除去msbb的第二个拷贝(msbb2)。
[0023]
膜抗原的泛化模块(gmma)在本发明中使用的志贺氏菌属细菌相对于它们的对应野生型菌株而言是高起泡的（hyperblebbing），即它们相比野生型菌株向它们的培养基中释放更大量的gmma。这些gmma可用作本发明的志贺氏菌疫苗的组分。术语gmma用于提供与常规去污剂提取的外膜囊泡(domv)和从革兰氏阴性细菌自发地释放的天然外膜囊泡(nomv)的明显区别。gmma在两个关键方面不同于nomv。首先，为了诱导gmma形成，已经通过删除编码关键结构组分的基因（具体地tolr）修饰了膜结构。其次，由于遗传修饰，大量外膜“出芽”(芽的意大利语单词是
‘
胞芽（gemma）’)以提供用于疫苗生产的膜材料的实际来源，从而导致增加的制造容易和潜
在成本降低。尽管nomv已经用于免疫原性研究，但是收率对于实际疫苗而言过低。
[0024]
通过电子显微术，在本发明中使用的宋氏志贺氏菌gmma通常具有25 nm至140 nm的直径，例如25nm至40nm。gmma也可以具有双峰尺寸分布。例如，大部分gmma具有25 nm至40 nm直径的平均尺寸(通过em)，且一部分颗粒具有65 nm至140 nm的平均尺寸。具体地，至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%的gmma将具有25 nm至140 nm的直径。
[0025]
gmma在细菌生长过程中自发地释放，且可以从培养基中纯化。所述纯化理想地包含将gmma与活的和/或完整的志贺氏菌属细菌分离，例如，通过使用过滤器（诸如0.2 μm过滤器）的基于尺寸的过滤，所述过滤器允许gmma穿过，但是不会允许完整细菌穿过，或通过使用低速离心以沉淀细胞，同时将gmma留在悬浮液中。合适的纯化方法是本领域已知的。一种优选的两步过滤纯化方法描述在wo2011/036562中，其通过引用并入本文。具体地，使用两步过滤方法在不使用离心的情况下使gmma与细胞培养生物质分离。
[0026]
本发明的含有gmma的组合物通常基本上不含有完整细菌，无论活的还是死的。gmma的尺寸是指，它们可以容易地通过过滤（例如如通常用于过滤灭菌的）与完整细菌分离。尽管gmma将穿过标准的0.22 μm过滤器，这些可以迅速地被其它物质阻塞，所以可能有用的是，在使用0.22 μm过滤器之前通过一系列递减孔径的过滤器执行相继的过滤灭菌步骤。在前的过滤器的例子可以是具有0.8 μm、0.45 μm等孔径的那些。gmma自发地从细菌释放，并且与培养基的分离（例如，使用过滤）是方便的。本发明的范围不包括通过某些方法形成的外膜囊泡，所述某些方法包含故意破坏外膜(例如通过去污剂处理，诸如脱氧胆酸盐提取或声处理)以造成外膜囊泡形成。在本发明中使用的gmma基本上不含有内膜和细胞质污染且含有脂质和蛋白。
[0027]
免疫原性组合物本发明的免疫原性组合物可以包含从至少2、3、4、5或6种不同的志贺氏菌属菌株纯化的gmma。具体地，免疫原性组合物包含从宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌纯化的gmma。所述弗氏志贺氏菌gmma可以从至少一种选自2a、3a和6的菌株纯化。具体地，所述免疫原性组合物包含从菌株2a、3a和6中的每一种纯化的弗氏志贺氏菌gmma。所述免疫原性组合物可以进一步包含从至少一种选自1b和2b的菌株纯化的弗氏志贺氏菌gmma。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含从以下菌株纯化的gmma：(a)宋氏志贺氏菌、(b)弗氏志贺氏菌2a、(c)弗氏志贺氏菌3a和(d)弗氏志贺氏菌6。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物包含从宋氏志贺氏菌53g、弗氏志贺氏菌2a 2457t、弗氏志贺氏菌3a 6885和弗氏志贺氏菌6 10.8537和任选的弗氏志贺氏菌1b stansfield和/或弗氏志贺氏菌2b 69/50纯化的gmma。
[0028]
在使用至少两种不同类型的gmma的情况下，它们可以以1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1或4:1、优选约1:1的比率存在。具体地，所述免疫原性组合物中的四种不同gmma中的至少两种以1:4至4:1的比率存在。在使用来自至少四种不同血清型的gmma的情况下，它们可以以选自下表提供的选项的比率存在，例如，1:1:1:1的比率(比率选项1)。当提及这样的比率时，显而易见，通常难以配制具有准确比率的免疫原性组合物，某种变化性将存在。
[0029]
所述免疫原性组合物可以在每单位剂量中包含任意合适量的gmma。术语“单位剂量”表示根据合理的医学实践适合用于在一个单次剂量中施用的药物活性剂的量，例如gmma蛋白的量。gmma蛋白的合适量可以是0.1-200 μg/单位剂量，具体地10 μg、20 μg、25 μg、50 μg或100 μg。每个单位剂量，本发明的水性免疫原性组合物可以包含小于200
µ
g/ml、小于100
µ
g/ml或更低、80
µ
g/ml或更低、50
µ
g/ml或更低、25
µ
g/ml或更低、20
µ
g/ml或更低、15
µ
g/ml或更低、10
µ
g/ml或更低的gmma蛋白的总浓度。每个单位剂量，本发明的水性免疫原性组合物可以包含5
µ
g/ml至200
µ
g/ml、5
µ
g/ml至100
µ
g/ml、10
µ
g/ml至100
µ
g/ml、10
µ
g/ml至80
µ
g/ml、10
µ
g/ml至50
µ
g/ml、25
µ
g/ml至50
µ
g/ml的gmma蛋白的总浓度。每个单位剂量，本发明的免疫原性组合物可以包含超过100
µ
g/ml、超过80
µ
g/ml、超过50
µ
g/ml、超过25
µ
g/ml、超过20
µ
g/ml、超过15
µ
g/ml或超过10
µ
g/ml的gmma蛋白的总浓度。通过测量oag多糖，也可以定量gmma的量。例如，oag多糖与蛋白比率(oag:蛋白，以w/w的方式表达)可以是在0.06-1.1
µ
g oag/
µ
g蛋白、0.65-1.1
µ
g oag/
µ
g蛋白、0.75-1.1
µ
g oag/
µ
g蛋白或0.85-1.0
µ
g oag/
µ
g蛋白的范围内。具体地，对于弗氏志贺氏菌2a，oag:蛋白比率可以是0.85-1.0
µ
g oag/
µ
g蛋白，对于弗氏志贺氏菌3a，oag:蛋白比率可以是0.75-1.1
µ
g oag/
µ
g蛋白，对于宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌6，oag:蛋白比率可以是0.06-1.0
µ
g oag/
µ
g蛋白，具体地约0.06
µ
g oag/
µ
g蛋白。因而，基于0.75
µ
g oag/
µ
g蛋白的oag:蛋白比率，每单位剂量的gmma的特定量可以如上在150-200
µ
g/ml的范围内，且基于0.8-1.0
µ
g oag/
µ
g蛋白的oag:蛋白比率，每单位剂量的gmma的特定量可以如上具体地在160-200
µ
g/ml的范围内。
[0030]
来自每种不同血清型的gmma蛋白可以以0.1-200
µ
g的量存在，例如0.1-80 μg、
0.1-100 μg和具体地5-25 μg。来自每种不同血清型的gmma的合适量可以包括0.1、1、5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90和100 μg/单位剂量。本发明的免疫原性组合物包括从超过一种志贺氏菌属菌株纯化或分离的gmma，且所述gmma通常在与药学上可接受的赋形剂（诸如缓冲液）混合之前单独制备。来自每种菌株的gmma可以用佐剂（诸如alhydrogel
®
）单独配制，然后与从另一种菌株纯化或分离的gmma组合并且与药学上可接受的赋形剂混合。可替换地，可以将来自每种菌株的gmma纯化/分离，与从其它菌株纯化或分离的gmma组合，与佐剂一起配制，并然后与药学上可接受的赋形剂混合。其它方法将是本领域技术人员会明白的。
[0031]
术语“纯化”和“分离”通常具有本领域的含义。优选地纯化的或分离的gmma是无细胞制品，更优选地所述gmma具有低水平的细胞质蛋白污染，例如，小于10%、小于9%、小于8%、小于7%、小于6%、小于5%或小于4%。例如，用无标记的基于强度的绝对定量指数(intensity-based absolute quantification index，ibaq)（相对于生产gmma的菌株的溶解细胞的组合物）使用高灵敏度质谱法测得，具体地gmma中的几乎所有蛋白质内容物源自外膜或周质定位的蛋白，具体地大于90%，更具体地大于95%、大于96%、大于97%、大于98%或大于99%。因而，gmma中的大于95%的蛋白质内容物包含周质或外膜定位的蛋白。具体地，纯化的/分离的gmma包含gmma中的周质和外膜蛋白相对于生产gmma的菌株的总细胞蛋白的大约10倍富集。
[0032]
简而言之，本发明的免疫原性组合物可以在单次或多次剂量中施用。本发明的免疫原性组合物的单次剂量可以是有效的。可替换地，一个单位剂量、继之以第二个单位剂量可以是有效的。通常，第二个(或第三个、第四个、第五个等)单位剂量与第一个单位剂量相同。第二个单位剂量可以在第一个单位剂量以后的任意合适时间施用，特别是1、2或3个月以后。通常，将本发明的免疫原性组合物肌内地（例如通过肌肉内施用）施用至如下所述的大腿或上臂，但是也可以真皮内地或鼻内地施用。
[0033]
本发明的免疫原性组合物可以包括一种或多种佐剂。具体佐剂包括铝佐剂，例如，氢氧化铝、alhydrogel
®
、磷酸铝、硫酸铝钾和明矾。铝佐剂的应用是有利的，因为gmma向佐剂的吸附会减轻热原应答，从而允许在兔中施用比单独gmma高100倍的剂量的gmma。还预见到也会减轻热原应答的其它佐剂的应用，且可以由技术人员使用下面举例说明的试验来鉴别。尽管术语“佐剂”通常表示增加对抗原的免疫应答的任何物质，在本发明的情况下，且不希望受假设约束，佐剂，诸如alhydrogel
®
，也是减轻对gmma的免疫应答的吸附剂。因而，术语“吸附剂”表示这样的固体底物或物质：gmma可以与其结合、附着或吸附(例如，通过范德华相互作用或氢键合)，使得对gmma的热原应答与没有如此结合、附着或吸附的gmma相比减轻。作为非限制性例子，通过对比抗-lps抗体应答，可以测量gmma的免疫原性。
[0034]
药物方法和用途本发明的免疫原性组合物还可以包含药学上可接受的载体。典型的
‘
药学上可接受的载体’包括其本身不会诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢地代谢的大分子诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(诸如油微滴或脂质体)。这样的载体是本领域普通技术人员众所周知的。本发明的免疫原性组合物还可以含有稀释剂，诸如水、盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。具体地当使用铝佐剂时，无菌的无热原的、tris缓冲的生理盐水是一种优选的载体，因为磷酸盐缓冲盐水
中的磷酸盐可以干扰gmma与铝的结合。
[0035]
可以将组合物制备为注射剂，无论是作为液体溶液还是混悬液。也可以制备适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如低压冻干的组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可以制备所述组合物用于局部给药，例如作为软膏剂、乳膏剂或粉末。可以制备所述组合物用于口服给药，例如作为片剂或胶囊剂、作为喷雾剂或作为糖浆剂(任选地经过调味)。可以制备所述组合物用于采用细粉或喷雾进行肺给药，例如作为吸入剂。可以将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可以制备所述组合物用于鼻、耳或眼给药，例如作为滴剂。所述组合物可以呈试剂盒形式，设计成在即将施用给哺乳动物之前重构合并的组合物。这样的试剂盒可以包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种低压冻干的抗原。组合物可以存在于小瓶中，或它们可以存在于填充好的注射器中。所述注射器可以具有或没有针头。注射器将包括单次剂量的所述组合物，而瓶可以包括单次剂量或多次剂量。
[0036]
本发明的水性组合物也适合用于重构来自低压冻干形式的其它疫苗。在将本发明的组合物用于这样的即时重构的情况下，本发明提供了一种试剂盒，其可以包含两个小瓶，或者可以包含一个填充好的注射器和一个小瓶，所述注射器的内容物用于在注射前再次激活所述小瓶的内容物。
[0037]
本发明的组合物可以以单位剂量形式或以多剂量形式包装。对多剂量形式，小瓶优于预填充的注射器。可以常规地确立有效剂量体积，但是所述组合物的典型人剂量具有0.5ml的体积，例如对于肌肉内注射。
[0038]
所述组合物的ph优选地是6-8，优选约7。对于包含乙酰化的o-抗原的组合物，具体地，所述组合物的ph小于7，优选约6 (以减慢去酯化的速率)。通过使用缓冲液，可以维持稳定的ph。本发明的免疫原性组合物可以包含tris [三(羟基甲基)氨基甲烷]缓冲液。所述tris缓冲液可以包含约1-20mm [三(羟基甲基)氨基甲烷]，例如1.25 mm、2.5 mm、5.0 mm或10.0 mm。对于包含乙酰化的o-抗原的组合物，具体地所述缓冲液不是tris缓冲液。本发明的免疫原性组合物可以包含5-20mm琥珀酸盐缓冲液，例如5 mm、7.5 mm、10 mm、12.5 mm、15 mm、17.5 mm或20 mm。本发明的免疫原性组合物可以包含5-20mm组氨酸缓冲液，例如5 mm、7.5 mm、10 mm、12.5 mm、15 mm、17.5 mm或20 mm。所述组合物将是无菌的。本发明的组合物可以就人类而言是等渗的。
[0039]
因而，本发明的组合物可以用作疫苗。根据本发明的疫苗可以是预防性的(即用于预防感染)或治疗性的(即用于治疗感染)，但是通常是预防性的。术语“保护免于感染”是指，主体的免疫系统已经被激发(例如通过疫苗接种)以触发免疫应答和排斥所述感染。本领域技术人员将显而易见，接种疫苗的主体因而可能受到感染，但是能够比对照主体更好地排斥感染。术语“治疗”包括治疗性处理和预防性的或防止性的处理，其中目的是阻止或减少感染。例如，治疗可以包括直接地影响或治愈、遏制、抑制、阻止例如感染，减轻例如感染的严重程度，延迟例如感染的发作，减轻与例如感染有关的征状，或它们的组合。“预防”可以尤其指延缓征状的发作，阻止疾病的复发，等。治疗还可以包括“遏制”或“抑制”感染或疾病，例如减轻征状的严重程度、数目、发生率或潜伏期，改善征状，减少继发性征状，减少继发性感染，延长患者存活期，或它们的组合。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学上有效量的抗原以及需要的任意其它组分。
‘
免疫学上有效量’是指，在单次剂量中或作为一系列剂量的一部分施用给个体的对治疗或预防而言有效的量。该量随以下因素而变化：待治
疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群（例如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预见到，所述量将落入通过常规试验可以确定的相对宽范围内。
[0040]
本发明的组合物可以包括抗微生物剂，具体地当以多剂量形式包装时。本发明的组合物可以包括钠盐(例如氯化钠)以提供张度。10
±
2mg/ml nacl的浓度是典型的。在某些实施方案中，可以使用4-10mg/ml nacl的浓度，例如9.0、7.0、6.75或4.5 mg/ml。本发明的组合物通常将包括缓冲液。
[0041]
治疗方法本发明还提供了一种用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用本发明的药物组合物。所述免疫应答优选地是保护性的，且优选地涉及抗体。所述方法可以引起加强应答。
[0042]
所述哺乳动物优选地是人。在将所述疫苗用于预防性应用的情况下，所述人可以是成年人、儿童（例如幼儿或婴儿）或青少年；在将所述疫苗用于治疗性应用的情况下，所述人优选地是儿童。意图用于儿童的疫苗还可以施用给成年人，例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。用于治疗的人类的一个优选类别是育龄女性(例如青少年和以上)。另一个优选类别是怀孕的女性。
[0043]
本发明还提供了用于用作药物的本发明的组合物。所述药物优选地能够在哺乳动物中产生免疫应答(即它是免疫原性组合物)，且更优选地是疫苗。
[0044]
本发明还提供了本发明的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于在哺乳动物中产生免疫应答。
[0045]
这些应用和方法优选地用于预防和/或治疗由志贺氏菌属造成的疾病，例如志贺氏菌病、痢疾和有关的征状，包括腹泻、发热、腹部疼痛、里急后重等。这些应用和方法优选地用于预防和/或治疗由宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌造成的疾病。
[0046]
本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间质间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用，可以实现直接递送。肌肉内施用至大腿或上臂是优选的。注射可以是经由针头(例如皮下针头)，但是可以可替换地使用无针注射。一种典型的肌肉内剂量是0.5 ml。对于人施用，所述剂量可以是约100
µ
g（通过蛋白测量），例如，在200
µ
g蛋白/ml的浓度在0.5 ml剂量递送。本发明可以用于引起全身和/或粘膜免疫。剂量治疗可以是单次剂量方案或多次剂量方案。多次剂量可以用在初次免疫方案中和/或加强免疫方案中。初次剂量方案可以继之以加强剂量方案。可以常规地确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强之间的合适时间。
[0047]
一般方面术语“包含”包括“包括”以及“由...组成”，例如，“包含”x的组合物可以排它地由x组成，或者可以包含其它物质，例如x y。
[0048]
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含有”y的组合物可以完全地不含有y。在必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
[0049]
除非特别说明，否则包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定混合次序。因而，可以以任何次序混合组分。在存在三种组分的情况下，那么可以将两种组分
彼此组合，然后将所述组合用第三种组分组合，等。
[0050]
除非另有说明，否则多肽序列之间的同一性优选地通过smith-waterman同源性检索算法来确定，如在mpsrch程序(oxford molecular)中实现的，其中使用具有参数缺口开放罚分=12和缺口延伸罚分=1的仿射（affine）缺口检索。
[0051]
除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这样的技术在文献中进行了充分解释。
[0052]
在某些实现中，术语“包含”表示包括指定的活性剂，诸如列举的多肽或gmma，以及包括其它活性剂和药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等，正如制药工业中已知的。在某些实现中，术语“基本上由
……
组成”表示这样的组合物：其唯一活性成分是指定的活性成分，但是，可以包括用于使制剂稳定、防腐等、却不直接涉入指定的活性成分的治疗效果的其它化合物。过渡短语“基本上由
……
组成”的应用是指，权利要求的范围应当解释为包括详细说明的物质或在权利要求中列举的步骤，和不会实质上影响要求保护的发明的基本和新特征的那些。参见，in re herz, 537 f.2d 549, 551-52, 190 uspq 461, 463 (ccpa 1976) (重点在原始文献中)；也参见mpep
§
2111.03。因而，术语“基本上由
……
组成”当用在本发明的权利要求中时不意图解释为等同于“包含”。术语“由
……
组成”及其变体包括“包括且限于”，除非明确地另外详细说明。关于数值x的术语“约”是指，例如，x 10%、x 5%、x 4%、x 3%、x 2%、x 1%。
[0053]
用于实现本发明的方式宋氏志贺氏菌菌株制备选择宋氏志贺氏菌53g [15]作为亲本菌株。通过用来自大肠杆菌的基因nada和nadb [18]替换宋氏志贺氏菌53gδtolr::kan [17]中的质粒编码的virg基因[16]，得到宋氏志贺氏菌菌株nvgh1859 (宋氏志贺氏菌53gδtolr::kanδvirg::nadab)。使用引物对virgup-5/virgup-3 (上游)和virgdown-5/virgdown-3 (下游) (表1)扩增virg的上游和下游区域。通过使用引物nada-5/nada-3和nadb-5/nadb-3 (表1)扩增来自大肠杆菌的nada和nadb，制备“nadab”盒。将所述片段插入pbluescript (stratagene)中，使得nada和nadb连接并插入virg的侧接区域中。使用引物virgup-5/virgdown-3扩增替换构建体(virgup-nadab-virgdown)，并用于转化如以前描述的易于重组的宋氏志贺氏菌δtolr::kan [17]。
[0054]
通过用如rossi等人[20]所述的氯霉素抗性基因cat替换htrb基因[19]，从nvgh1859制备宋氏志贺氏菌菌株nvgh1790 (宋氏志贺氏菌53gδtolr::kanδvirg::nadabδhtrb::cat)。
[0055]
表1：在该研究中用于制备宋氏志贺氏菌gmma生产菌株的引物引物seqidno:序列5
’‑→3’
virgup-51actcgagctctgtagttgatttgacagttgacatccvirgup-32ctaacccgggcactatattatcagtaagtggttgataaaccvirgdown-53ctaacccgggcgtgttgatgtcctgcvirgdown-34acgcgtcgacagttcagttcaggctgtacgcnada-5*5ctaacccgggcaagcaactctatgtcggtggaatnada-3*6tatcaagcttggcaaggccaatacacagcnadb-5*7tatcaagcttagggttagagtgtctcgtttttgta
nadb-3*8ctaacccgggccagaccagaactattcc*如prunier等人[18]描述的nada和nad b引物，经过小修改。
[0056]
弗氏志贺氏菌2a菌株制备如以前在j biol chem. 2014 sep 5; 289(36): 24922-24935中描述的，制备弗氏志贺氏菌突变体。选择弗氏志贺氏菌2a 2457t作为亲本菌株。为了从没有毒性质粒的弗氏志贺氏菌2a制备突变体，在遗传修饰开始之前通过在刚果红琼脂上的白色外观来选择白色菌落。使用pcr，通过复制起点(ori)和质粒编码的基因virg和ospd3的缺失来证实毒性质粒(pinv)的消除（cured）。引物列出在表2中。为了产生弗氏志贺氏菌2a和质粒消除的弗氏志贺氏菌2a-pinv中的tolr缺失，使用与前面关于宋氏志贺氏菌δtolr突变体的制备描述的相同的策略和引物(2)。
[0057]
使用下述策略，通过用抗生素抗性盒替换目标基因，得到msbb1或htrb的无效突变。使用引物对基因-u和基因-d，扩增上游和下游区域。使用引物对ecorv.ery.f/ecorv.ery.r或ecorv.cm.f/ecorv.cm.r，扩增用于替换所述基因的抗性盒。将所述片段插入pbluescript (stratagene)中，使得抗生素抗性基因插入在基因的侧接区域中。使用结合基因的上游侧接区域的5
′
末端和下游侧接区域的3
′
末端的引物(参见表2)扩增替换构建体(上游区域-抗性盒-下游区域)，并用于转化弗氏志贺氏菌。在弗氏志贺氏菌2a中，用cat替换msbb1和htrb。仅需要将msbb1突变引入质粒消除的菌株中，因为所述质粒携带msbb的第二个拷贝(msbb2)，并且这是在质粒消除的菌株中不存在的。为简洁起见，所述突变体被称作δmsbb。制备了弗氏志贺氏菌2a菌株nvgh2404 (弗氏志贺氏菌2457tδtolr::kan, δmsbb::cat)。
[0058]
表2：在该研究中用于制备弗氏志贺氏菌2a gmma生产菌株的引物
引物名称seqidno:序列5
′→3′
htrb-u1xbasma9ctagtctagaaacccgggcaattgtatgtattgtcghtrb-sou2saci10actcgagctcccgtcatcatccaacgchtrb-flexu2saci11actcgagctcatccgatatacgttcgccchtrb-sod1sali12acgcgtcgacctcagtaatcagggttctttghtrb-sod2smai13ctaacccgggtaaatctcccctgccggatghtrb-flexd1sali14acgcgtcgaccctgtaatctcaggtcaaatghtrb-flexd2smai15ctaacccgggtaaatctcccatgccggatgmsbb-flexu5sma16ctagtctagaaacccgggtgatagtgtagcggcacamsbb-flexu3sac17actcgagctcgtgagcaaagccagctgmsbb-flexd5sali18acgcgtcgacctcggtgtggaaattggmsbb-flexd3xbasma19ctaacccgggcaacgtacttactctaccgp1.htrbcompl-ecori20accggaattcgtgtaacactggcatggtgtap2.htrbcompl-ncoi21catgccattgtagcaatccgctgttggtgcgecorv.ery.f22agcttgatatcagagtgtgttgatagtgcagtatcecorv.ery.r23agcttgatatcacctctttagcttcttggaagctecorv.cm.f24agcttgatatctgtgacggaagatcacttcgecorv.cm.r25agcttgatatcgggcaccaataactgcctta
ori-126cggcatcagaataatacaagcagcori-227aggtgtaccgtgctctgggvirg-128gtcacaggtaacatgactctggagvirg-229ccatgtgtgaatactaccttcacccospd3-130gttttgcctcattcaagatatcaccospd3-231tgacgatggtttgtcaggattgcmsbb.f32cgccaaagttccgtgatcccattmsbb.r33ctcttcgatgatctccagccctt
[0059]
弗氏志贺氏菌1b、2b、3a和6制备通过改造在[32]中描述的方法，制备弗氏志贺氏菌1b、2b、3a和6突变体。
[0060]
菌株选择弗氏志贺氏菌1b stansfield、弗氏志贺氏菌2b 69/50、弗氏志贺氏菌3a 6885和弗氏志贺氏菌6 10.8537作为亲本菌株。为了制备没有毒性质粒的突变体，在遗传修饰开始之前通过在刚果红琼脂上的白色外观来选择白色菌落。使用pcr，通过质粒编码的毒力基因、具体地virg (引物88/89)和mxia (引物53/54)的缺失来证实毒性质粒(pinv)的消除。引物列出在表3中。
[0061]
为了产生弗氏志贺氏菌1b、2b、3a和6中的tolr缺失，使用引物45/46 (表3)从质粒pkd4 [32]扩增卡那霉素盒。通过pcr (引物39/40)证实携带质粒pkd46或pajd434的菌株中tolr基因的替换。使用质粒pcp20如在[32]中所述执行抗生素选择性标志物的除去。将相同策略用于这些菌株中htrb和msbb基因的缺失，分别使用引物49/50和51/52扩增通过pcr从质粒pkd3得到的氯霉素盒(引物45/46)。可替换地，使用分别通过引物78-81和74-77 (表3)扩增氯霉素盒得到的片段执行htrb和msbb的替换。通过分别使用引物82/83和55/56的pcr验证htrb和msbb基因的替换。将氯霉素选择性标志物(cat)如所述除去[32]。制备了弗氏志贺氏菌3a菌株nvgh2766 (弗氏志贺氏菌6885δtolr::kan, δmsbb::cat)。
[0062]
表3：用于制备弗氏志贺氏菌1b、2b、3a和6突变体的引物
引物名称seqidno:序列5
’‑3’
45-pkdf34cacgtcttgagcgattgtgtagg46-pkdr35gacatgggaattagccatggtcc39-tolrsf36caattggtctgttcgccgc40-tolrsr37ctaccgcacctgaatcaacca47-tolrkof38accgccaggcgtttaccgttagcgagagcaacaaggggtaagccatggccgtgtaggctggagctgcttc48-tolrkor39acccgctctctttcaagcaagggaaacgcagatgtttagataggctgcgtcatatgaatatcctccttag49-htrbkof40acaatacatacaattgcccgtataggttgaaaaacaggattgatatgacggtgtaggctggagctgcttc50-htrbkor41atgccggatgccattctgaagcatccggcatgggagatttaatagcgtgacatatgaatatcctccttag51-msbbkof42actatcaccagattgatttttgccttatccgaaactggaaaagcatggaagtgtaggctggagctgcttc52-msbbkor43ttttatttgatgggataaagatctttgcgcttatacggctggatttcgcccatatgaatatcctccttag53-mxiaf44cgatagggatgttgccaggtt54-mxiar45ctatcggcacgcacctcattta55-msbb2f46ctttcccctgtttactggtttaca56-msbb2r47tgtccgcgctggcaatg74-msbbkouf48aacccgcgtcgaactaatcc75-msbbkour49cctacacaatcgctcaagacgtgcgtttccatgcttttccagttt76-msbbkodf50ggaccatggctaattcccatgtccccatcaaataaaaaagcctctcg
77-msbbkodr51atcccgagcatcaacgtttc78-htrbkouf52gcgcagtacccagaaggat79-htrbkour53cctacacaatcgctcaagacgtgggtggagaacttgggtagattcg80-htrbkodf54ggaccatggctaattcccatgtcccttcacgctattaaatctccca81-htrbkodr55tgactacatctacaccagccct82-htrbf56gcgtactttggttggtcgtg83-htrbr57aacgaagggcaccagaca88-virgf58ggttatgatggctacggtggta89-virgr59gtttatagtccttctgcgccca74-msbbkouf60aacccgcgtcgaactaatcc75-msbbkour61cctacacaatcgctcaagacgtgcgtttccatgcttttccagttt76-msbbkodf62ggaccatggctaattcccatgtccccatcaaataaaaaagcctctcg77-msbbkodr63atcccgagcatcaacgtttc78-htrbkouf64gcgcagtacccagaaggat79-htrbkour65cctacacaatcgctcaagacgtgggtggagaacttgggtagattcg80-htrbkodf66ggaccatggctaattcccatgtcccttcacgctattaaatctccca81-htrbkodr67tgactacatctacaccagccct
[0063]
志贺氏菌属生长条件常规地在含有葡萄糖作为碳源的宋氏志贺氏菌确定成分培养基(ssdm, [17])中培养宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌gmma生产菌株。如下制备ssdm：13.3 g/kg kh2po4, 4 g/kg (nh4)2hpo4, 1.7 g/kg柠檬酸一水合物, 2.5 g/kg l-天冬氨酸, 493 mg/kg mgso4*h2o, 2.7 mg/kg co(nh3)6cl3, 15 mg/kg mncl2*4h2o, 1.5 mg/kg cucl2*h2o, 3 mg/kg h3bo3, 2.5 mg/kg na2moo4*2h2o, 2.5 mg/kg乙酸锌一水合物, 0.49 mg/kg柠檬酸铁, 50 mg/kg硫胺素。对于固体培养基和摇瓶培养，以5 g/kg的浓度加入葡萄糖。对于在发酵罐中的生长，加入27.3 g/kg葡萄糖和0.25 g/kg聚丙二醇(ppg)。固体ssdm含有18 g/l琼脂。给弗氏志贺氏菌培养基进一步补充氨基酸、维生素和较高浓度的铁。
[0064]
细胞储存（banking）为了使传播性海绵状脑炎(tse)污染或其它偶发因素的风险最小化，将宋氏志贺氏菌细胞系和弗氏志贺氏菌细胞系通过在用ssdm制备的琼脂平板上传代3次在gmp下净化。制备gmp主要和/或工作细胞库小瓶。
[0065]
细菌或gmma的流式细胞计量术通过在0.5%甲醛中固定，将来自发酵罐或烧瓶规模培养的志贺氏菌属细菌保留用于流式细胞计量术分析。将9x104至9x105个细胞用单价兔抗血清(denka seiken co., ltd.)染色，与o抗原(oag)或多克隆小鼠抗血清（针对alhydrogel
®
配制的志贺氏菌属血清型的gmma产生）反应。使用荧光素缀合的f(ab’)2片段山羊抗-兔或抗-小鼠igg、igm或iga (jackson immunoresearch europe ltd.)检测结合的抗体。将样品用4%甲醛固定，并使用facscanto
™
ii流式细胞计(bd biosciences)分析。使用flowjo软件(tree star inc.)处理数据。
[0066]
gmma生产下面的描述是基于宋氏志贺氏菌1790-gmma的生产。在来自弗氏志贺氏菌的gmma的生产方法不同的情况下，给出另外的指示。
[0067]
发酵
对于每个生产批次，在搅拌(200 rpm)下在30℃在ssdm中在来自research或gmp细胞库的摇瓶中培养志贺氏菌属菌株，从0.02的在600 nm测得的光密度(od600)开始，直到培养物达到等于1.5
±
0.5的od600，经常在9
±
2小时。在生物反应器(在sartorius、biostat d75生物反应器中30 l规模，或在lp35生物工程生物反应器中25l规模)中，以受控的培养条件从2%接种物大小开始以分批（batch）模式培养菌株：通过加入28%nh4oh保持ph 6.7，30℃，通过1空气体积/培养物体积/分钟(vvm)气流将溶解氧保持在30%饱和度，级联搅拌和压强(200-800 rpm，50-1250毫巴g)直到35的最终od600。
[0068]
纯化使用两个连续切向流过滤(tangential flow filtration，tff)步骤纯化释放进发酵液中的gmma：微滤，其中使含有gmma的培养物上清液与细菌分离；和超滤，其中使所述gmma与可溶性蛋白分离。对于微滤步骤(1.2 m2的0.2
µ
m孔径纤维素膜)，将生物反应器与tff系统连接，以便使用发酵容器作为再循环罐。最初将培养物上清液浓缩3倍以达到“1体积”的浓缩上清液，随后是在生长培养基(13.3 g/kg kh2po4; 4 g/kg nh4hpo4; 1.7 g/kg柠檬酸；4 ml/l的nh4oh; ph 6.7)中相对于5体积的缓冲液的不连续渗滤。还可以使用生理盐水。然后将经微滤的含有gmma的物质穿过具有0.45 μm、然后0.2 μm过滤器(sartorius)的过滤胶囊过滤，以确保在进一步加工之前任何活的志贺氏菌属细菌的不存在。超滤步骤(1.4 m2的300 kda孔径pes膜)包括浓缩和随后经微滤的gmma溶液相对于10体积的tris-缓冲盐水(tbs)、0.9%nacl、10 mm tris/tris hcl ph 7.4或0.9%w/v的氯化钠的连续渗滤，并允许核酸和可溶性蛋白的大量除去。执行经纯化的gmma的最后浓缩以得到配制过程的所需浓度，并穿过sartorius醋酸纤维素消毒过滤器（其针对gmma主体的可提取物、可滤除物和细菌截留能力经过验证）过滤。从30 l的发酵体积制备宋氏志贺氏菌gmma的3个非-gmp一致性批次。另外，生产并释放2个gmp批次以支持毒理学和临床疫苗的进一步生产。针对外观、同一性、总的和可溶性蛋白质含量、o抗原含量、lps含量、ph渗透压、纯度和大小试验了主体宋氏志贺氏菌gmma。
[0069]
制剂通过将gmma混悬液加入alhydrogel
®
中在室温恒定搅拌2 h，将gmma吸附至氢氧化铝(alhydrogel
®
2%, brenntag biosector, 丹麦)，随后装瓶。gmma alhydrogel
®
制剂含有12.7 μg/ml宋氏志贺氏菌o抗原、200 μg/ml gmma蛋白和0.7 mg/ml铝-iii-离子(al
3
)作为在tbs中的alhydrogel
®
。还可以使用组氨酸缓冲液。以每个3 ml单次剂量瓶0.7 ml分配所述制剂。针对同一性、总蛋白质含量、铝含量、可提取体积、未吸附的蛋白、目检外观、ph、渗透压、无菌度、免疫原性和致热原性，试验所述制剂。
[0070]
制备并释放宋氏志贺氏菌1790gahb的3个gmp批次、1个毒理学批次和2个临床批次。还制备了更小的(140 ml)非-gmp稳定性批次。生产了新鲜配制的小规模实验室批次用于最初的致热原性和免疫原性研究。
[0071]
gahb-安慰剂的gmp制剂制备了含有0.7 mg/ml al
3 作为在tbs中的alhydrogel
®
的安慰剂（也用作稀释剂），并以每个3 ml小瓶0.7 ml分配。还可以使用组氨酸缓冲液。针对同一性、铝含量、可提取体积、目检外观、ph、渗透压、无菌度和致热原性试验了gahb-安慰剂。已经生产和释放了gahb-安慰剂的2个gmp批次。
[0072]
物理化学分析方法gmma的蛋白定量从菌株nvgh1790生产的gmma被称作1790-gmma。蛋白定量常规地通过lowry测定来执行。为了确定gmma的蛋白浓度，测定使用如以前所述[28]相对于第一1790-gmma标准品（具有通过定量氨基酸分析确定的蛋白质含量）校准过的第二bsa标准品。因而，将所有gmma蛋白浓度间接地称作通过氨基酸分析确定的蛋白浓度。将含有tris的样品稀释至等于或小于1 mm的最终tris浓度，以避免在lowry测定中的干扰。还可以将microbca测定用于gmma蛋白定量。
[0073]
alhydrogel
®
配制的gmma的蛋白定量对于吸附至alhydrogel
®
的gmma (例如1790gahb)的蛋白定量，还使用lowry或microbca测定，且将第二bsa标准品吸附至alhydrogel
®
。显色以后，将样品离心并确定上清液的吸光度。在186,000 g在4℃超速离心2 h以后，使用相对于第一可溶性蛋白标准品（通过定量氨基酸分析定量）校准过的第二bsa标准品，在alhydrogel
®
制剂的上清液中确定未吸附至gmma制品的可溶性蛋白。
[0074]
吸附至alhydrogel
®
的gmma中的未结合的蛋白质含量过低难以通过lowry或microbca测量，并通过样品离心以后收集的上清液的sds-page (10%双丙烯酰胺凝胶)评估为限度试验，并与在平行泳道中运行的参照物1790-gmma对比。将蛋白带通过银染色显影，通过密度测定法定量，并使用imagescanner iii软件分析数据。将上清液样品中的可检测带的强度与1790-gmma样品中的对应带的强度进行对比(作为限度试验)。所述限度对应于5
µ
g/ml未吸附的蛋白(1790gahb制剂的总蛋白的2.5%)。
[0075]
gmma蛋白概况将1790-gmma在含有sds (invitrogen, lds nupage样品缓冲液)和50 mm二硫苏糖醇(dtt)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)样品缓冲液中在100℃变性10 min。将3
µ
g蛋白加载到10%(wt/vol)聚丙烯酰胺凝胶(invitrogen, novex 10%)上。在40 ma在3-(n-吗啉代)-丙烷磺酸(mops)缓冲液(invitrogen)中进行电泳75 min。将分离的蛋白用亮蓝g-胶体考马斯(sigma-aldrich)染色，使用密度测定法定量，并使用imagescanner iii软件分析。将试验样品的蛋白概况与在相同凝胶上电泳的参照gmma的概况进行对比。
[0076]
gmma中的o抗原定量对于详细的表征和批释放测定，通过hpaec-pad分析来测量o抗原(oag)浓度。所述定量确定存在于样品中的总oag的重量（mg）。
[0077]
o抗原参照标准：将来自宋氏志贺氏菌nvgh1859的gmma (1859-gmma)在1%乙酸中在100℃水解2 h。将经切割的脂质a和沉淀的蛋白通过离心除去[21]。通过尺寸排阻色谱法(sec, ge sephacryl s-100hr柱)回收oag的主要级分(中间分子量, mmw)。通过1h-nmr测量重复单元的数目[22]，确定oag大小。平均值为33。从重复单元的平均数目和lps核心的摩尔浓度（通过半乳糖，通过如上所述的hpaec-pad分析和在下面的lps定量中测量）确定o抗原量。作为一个替代方案，使用马来酸作为内部标准品通过定量1h-nmr (qnmr)可以完成oag的定量。
[0078]
在gmma中的o抗原定量：如下通过热苯酚-水萃取[23]来纯化lps：将400
µ
l样品加入等体积的90%苯酚ph 8溶液(sigma-aldrich)中并在80℃温育2 h。冷却至4℃以后，将样
品在18000 g在4℃离心15 min，并回收含有lps的上层水相。将苯酚相再次用400
µ
l水(1 h 80℃)萃取，并在离心(18000 g、4℃15 min)以后将水相回收，与第一水萃取物组合，并在离心蒸发器中干燥过夜。将样品在水(400
µ
l)中重构，并最后用水稀释以产生2.5至30
µ
g/ml之间的o抗原浓度。如通过lps核心的回收率（如上所述使用半乳糖测量）所判断的，lps收率》90%。对lps进行碱水解，并通过关于vi多糖报道的hpaec-pad分析[40]测量糖和与o抗原参照标准品进行对比。
[0079]
在gmma中的lps定量基于每个核心两个半乳糖[22]，使用通过hpaec-pad分析[21]对核心糖半乳糖的定量确定来量化1790-gmma中的lps的量。所述定量确定lps分子的摩尔数目。在每个分析中运行半乳糖的标准稀释系列。将1790-gmma和半乳糖标准品在100℃用2m三氟乙酸平行地处理4 h。将样品在2-8℃冷却，干燥过夜，再溶解在水中，过滤并分析。使用carbopac pa10柱和pa10保护柱在dionex ics3000上执行hpaec-pad。使用用18 mm naoh洗脱的等度条件，执行分离。对于弗氏志贺氏菌gmma，作为lps定量的一般方法，使用作为酯存在于脂质结构中的3-羟基脂肪酸的定量。通过样品的碱水解，继之以hplc-rp-qqq (srm)，使用3oh-脂肪酸标准品执行定量以构建校正曲线。
[0080]
在gmma中的lps尺寸分布为了筛选目的，可以使用sds-page分析。使用经过修改的苯酚-水方法(参见上面)纯化lps。将gmma (1 mg/ml)煮沸3 min，与0.5
µ
g/
µ
l蛋白水解酶k (sigma aldrich)一起在60℃温育过夜，与饱和的苯酚ph 8.0 (sigma aldrich) 1:1 (vol/vol)混合，在70℃温育30 min，并在10,000 g在室温离心1 h。将上相回收，与100%乙醇2:1 (vol/vol)混合，将lps在-80℃沉淀1 h，并通过在室温在12,000 g离心30 min沉淀。将沉淀物使用speedvac干燥并溶解于水中。将lps在12%二-三聚丙烯酰胺凝胶(life technologies)上电泳，并使用silver quest
™
silver staining kit (life technologies)染色。为了更精确的表征，可以使用hplc-sec。将脂质-a和蛋白通过1%乙酸水解(2h 100℃)/低速离心(14000 rcf 5 min)从试验样品除去；使用具有折射率检测器的tsk-gel
®
3000 pw柱，将干燥的(或脱盐的)上清液注射进hplc。使用分子量标准葡聚糖通过gpc软件确定分子大小。如果样品用semicarbozide衍生化，可以使用得到的峰证实oag的量。
[0081]
细菌或gmma中的脂质a的maldi-tof分析通过基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，maldi_tof)方法进行的脂质a身份测定会确定lps中的脂质a的类型。如以前所述[20]使用弱酸水解（在100℃用1%乙酸2 h）从gmma或细菌细胞库沉淀脂质a。将样品在14,000 g离心15 min，将沉淀物再悬浮于水中，并用水洗涤2次。将沉淀物使用speedvac干燥过夜并再悬浮于氯仿-甲醇4:1中，并与等体积的super dhb (sigma-aldrich)在水/乙腈1:1 (vol/vol)中的溶液混合。将2
µ
l所述混合物加载至靶平板(mtp 384靶平板接地的钢bc（ground steel bc），bruker daltonics)，并通过处于反射型离子阴性模式的ultraflex maldi-tof (bruker daltonics)分析。在每个分析中包括与super dhb溶液混合的肽校准标准品(bruker daltonics)。相对于肽标准品通过flex analysis软件确定m/z比率。通过分子峰质量m/z与样品的预期值的对比，鉴别脂质a的种类。
[0082]
gmma粒度动态光散射使用malvern zetasizer nano zs
™
确定gmma的尺寸分布。使用173
°
背散射光的3次不同测量的z-平均值得到粒度分布作为散射光的强度，其中使用“蛋白”作为物质设置和“一般目的(正常分辨率)”。通过该技术得到的直径是球体的直径，所述球体具有与正在测量的颗粒相同的平动扩散系数。预见到所述大小不同于通过电子显微术测量的值，将是粒度范围和生产一致性的有效量度。
[0083]
还已经使用阴性染色透射电子显微术（negative staining transmission electron microscopy）来评估gmma的粒度。制备gmma并如以前所述[20]通过电子显微术观察。在105,000 x的标称放大率记录电子显微照片。在电子显微照片的印刷复制件上相对于比例条手工地测量gmma直径。用于分筛（sizing）更好地匹配通过电子显微术得到的数据的另一种技术是使用串联的tskgel
®
6000pw和4000pw柱的、与malls (多角度激光散射)偶联的hplc-sec。
[0084]
alhydrogel
®
配制的gmma的身份和o抗原定量通过基于免疫学的技术可以确定alhydrogel(r)配制的gmma的身份。
[0085]
已经采用经过修改的直接alhydrogel
®
制剂免疫测定（direct alhydrogel
®
formulation immunoassay）[31]。使用市售的分型抗血清（在兔中生产）或分型单克隆抗体（在小鼠中生产），通过存在于制剂中的o抗原的检测来证实gmma的身份。将gmma-alhydrogel
®
混悬液的一个等分试样用bsa封闭，并与oag-特异性抗体一起温育。然后使用酶-标记的抗-兔抗体或抗-小鼠抗体检测分型抗体的结合。通过底物溶液的添加和通过吸光度可检测的颜色的形成，检测免疫反应性的o抗原的存在。通过试验样品的吸光度与在相同测定中包括的参照物的吸光度的对比来证实身份。
[0086]
还可以通过竞争性elisa进行鉴别和o抗原定量。工作原理是基于志贺氏菌属特异性的o抗原或lps与alhydrogel
®
配制的gmma之间对血清群特异性的单克隆抗体或多克隆抗血清的结合的竞争。在混悬液中存在的配制的gmma越多，可以结合抗原包被的平板的单克隆抗体或多克隆抗体越少，且通过标准elisa方法可以检测的信号越少。相对于用标准曲线得到的信号来定量存在于试验制剂中的o抗原，所述标准曲线通过给单克隆抗体掺入已知量的alhydrogel
®
配制的gmma来构建。
[0087]
生物学测定pbmc分离和mat在用gmma刺激以后pbmc的体外白介素6 (il-6)生产用作体外替代物以使用rossi等人[20]描述的程序评估反应原性潜力。简而言之，使用报道的ficoll密度离心[24]，使用来自不同供体的血沉棕黄层分离pmbc。在96-孔圆底平板中用180
µ
l补充了25 mm hepes、2 mm谷氨酰胺、10�s、1%pen-strep (invitrogen)的rpmi-1640在2 x 105个细胞/孔的密度接种pbmc。加入20
µ
l的gmma在tbs中的10倍系列稀释物(在测定中0.0001-1,000 ng/ml终浓度)，将细胞在37℃温育4 h，并将上清液在离心(5 min, 400 g)以后回收和在-80℃储存直到分析il-6浓度。
[0088]
在小鼠中的免疫原性/效能研究每组8只balb/c小鼠或cd-1小鼠(雌性，4-6周龄)在第0和21天以0.5 ml的体积接受不同剂量的alhydrogel配制的gmma的1或2次腹膜内注射。对照小鼠接受0.5 ml gahb-安
慰剂。在第7、14、21、28、35天，或在某些研究中，仅在第21天，收集血液样品。在效能测定中，将小鼠组用4种不同剂量的疫苗或效能标准品(参照gmma，在-80℃储存，并用alhydrogel新鲜配制)免疫。
[0089]
酶联免疫吸附测定(elisa)使用宋氏志贺氏菌lps或弗氏志贺氏菌血清群o抗原作为平板包被抗原，通过elisa评估针对宋氏志贺氏菌或弗氏志贺氏菌gmma产生的抗体。将nunc
™
maxisorp
™
96-孔平板用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的0.5
µ
g/ml lps或《 5
µ
g/ml oag在2-8℃包被过夜。将平板用5%乳在pbs中的溶液封闭1 h，并随后用含有0.05%tween
®
20的pbs (pbst)洗涤3次。将小鼠血清在含有0.1%bsa的pbst中1:100和1:4000稀释，并将兔血清在5%乳在pbs中的溶液中稀释。将经稀释的血清在elisa平板中一式三份地温育2 h。相对于以前建立的和校准的抗-宋氏志贺氏菌lps或抗-弗氏志贺氏菌血清型o抗原标准血清（被包括在每个平板上的双份稀释物系列中），试验样品。与样品和参照血清一起温育以后，将平板如上洗涤3次。将结合的抗体使用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠igg或山羊抗-兔igg检测，在pbst中稀释，并继之以3个洗涤步骤和使用对硝基苯基磷酸酯底物的显色反应。1 h以后，在405 nm和490 nm波长测量吸光度(光密度，od)，并计算od405nm-490nm。以相对于标准血清确定的elisa单元表达结果。1 elisa单元等于标准血清的稀释度的倒数，从而在标准测定中给出1的od405nm-490nm。
[0090]
作为抗体功能性的量度的血清杀细菌测定将宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌细菌培养至对数期(od: 0.2)，在pbs中1:15,000稀释，并分配进无菌的聚苯乙烯u底96-孔微孔滴定板中。向每个孔中，加入系列稀释8-12倍的血清样品(孔稀释度从1:100开始)。在使用之前，将血清在56℃加热30 min以失活内源性补体。向每个孔中加入在终体积的7-20%使用的活性小兔补体(baby rabbit complement，brc，cederlane cl3441 lot6288)。针对对每种具体细菌的低毒性，预先选择在sba反应混合物中使用的brc来源、批次和百分比。为了评价brc或小鼠血清的可能的非特异性抑制作用，还将细菌与以下物质一起温育：相同的试验的血清 热失活的brc；单独的血清(无brc)；sba缓冲液和活性brc。在sba混合物中温育3h以后，测量细菌生长抑制。以血清滴度（将其定义为得到50%细菌生长所需的血清稀释度）的方式测量杀细菌活性。当没有检测到杀细菌活性时，给出等于10的血清滴度。
[0091]
致热原性我们使用肌内递送的全人剂量的施用，建立了欧洲药典（european pharmacopeia）静脉内致热原性试验方法(ph.eur. 2.6.8热原, [25])的修改。进行两组实验来建立测定。在第一个实验中(在非-gmp条件下，但是在gmp设备中)，将各3只兔（根据ph.eur. 2.6.8热原预选择）的三组放在维持盒中，并使用直肠探头记录体温，并确定最初温度。将疫苗的毒理学批次(0.5 ml)肌肉内地注射至两个疫苗组中的3只兔的每一只，并将0.5 ml无菌生理盐水注射至对照组的3只兔。从注射前90 min直到施用后3 h，通过自动化系统连续地记录温度，以确定最初温度和施用以后可能的温度升高。在3.5、4、5、5.5、6、6.5和7 h，手工地记录温度。次日，将兔放回维持盒，允许适应并在24 h做出另一次读出。
[0092]
基于数据(参见结果)，选择下述试验用于1790gahb的肌肉内致热原性试验。根据ph.eur. 2.6.8选择各3只兔的两组(一个疫苗试验组和一个对照组)，放在维持盒中，并使
用直肠探头确定最初温度。将疫苗(0.5 ml)肌肉内地注射至疫苗组中的兔，并将0.5 ml无菌生理盐水注射至对照组的兔。通过自动化系统连续地记录温度3 h，并在3.5和4 h手工地做出另外读出。确定每只兔的最大温度升高(在施用后4 h时间段中测量的最高温度和最初温度之间的差异)。为了使试验是有效的，三个对照的最大温度升高的平均值必须≤0.3℃。如果三只疫苗试验兔的平均最大温度升高《0.8℃，那么试验通过；如果平均最大温度升高≥1.2℃，那么失败。如果三只兔的平均最大温度升高》0.8、但是《1.2℃，将所述试验重复。对于在另外3只兔中的重复试验，如果三只兔的平均最大温度升高≤0.8℃，那么试验通过，否则失败。使用以上标准在gmp条件下在gmp设备中进行第二个研究以评估毒理学和临床疫苗批次的致热原性。将所述研究中的温度记录延伸至24 h时间段以提供关于测定的稳健性的进一步数据，并选择4 h作为确定时间段以评估温度升高。已经使用im致热原性试验方法来释放宋氏志贺氏菌1790gahb的三个gmp批次。
[0093]
重复剂量毒理学研究为了支持宋氏志贺氏菌1790gahb疫苗的多达3次免疫接种的临床施用，根据良好实验室实践(good laboratory practice，glp)标准(wil research europe, 里昂, 法国)用新西兰白兔进行毒理学研究。通过肌肉内(im)、鼻内(in)或真皮内(id)临床途径将疫苗间隔2周地施用4次，继之以2周观察期。基于表现出产生免疫应答的能力的初步调查研究，选择兔作为动物模型。研究设计呈现在表3中。在研究过程中针对发病率/死亡率、临床观察/检查、draize注射部位、眼科学、体重、食物消耗观察所有动物。还在所有组中执行临床病理学，包括凝固参数和c-反应蛋白(试验前、在第2天和在两次尸检时)、抗体分析(试验前、给药前和在两次尸检时)、在尸检时肉眼观察、器官重量和组织病理学(完整who组织列表)。在给药前1.5 h、0.5 h和2 min (0 h)和在注射后0.5、2、6和24 h，测量在第一次免疫接种时第2和5组(im)的体温。在-0.5 h和0 h时温度的平均值视作兔的最初温度。在第2和5组的第2次、第3次和第4次免疫接种时和在第1、3、4、6和7组的所有免疫接种时，在给药前(0 h)和给药后2、6和24 h记录体温。
[0094]
表3：毒理学研究的实验设计给药天：0、14、28和42。aim：肌肉内；in：鼻内；id：真皮内。b在第1组(对照)中的每只动物通过所有三种途径接受无菌盐水(0.9%nacl)。c间隔2 h的每个鼻孔100 μl的4次施用，即400 μl/天。在疫苗接种之间交替鼻孔。
[0095]
使用in疫苗接种的大鼠中的irwin研究为了进一步支持1790gahb的in施用，进行glp irwin试验以鉴别1790gahb对中枢
和周围神经系统的潜在不希望作用，如通过神经行为观察组所判断的[26]。使用了3组各6只雄性大约0.3 kg的han wistar大鼠。第一组接受盐水对照，第二组接受gahb-安慰剂，且第三组接受1790gahb。每只大鼠在每个鼻孔中接受15
µ
l的单次剂量(共30
µ
l)。施用的该体积是最大实际剂量。试验组接受共6
µ
g的1790gahb蛋白。基于体重，在0.3 kg大鼠中的6
µ
g蛋白剂量是将在1期试验中in施用给60 kg主体的最高预期剂量的大约15倍。在施用前、在施用时和在施用后0.5、1、2、5和24小时，监测大鼠。
[0096]
所有动物研究符合关于用于科学目的的动物的保护的eu directive 2010/63和它分别在意大利和法国的有关当地法律中的实现。经修改的gmp致热原性试验经过charles river france ethics committee批准(研究编号t 13.1446-48、t 13.1678-80、t 13.1702)。
[0097]
结果宋氏志贺氏菌nvgh1790细胞系的o抗原表达.通过将大肠杆菌nada和nadb基因整合进毒性质粒中以除去志贺氏菌属的烟酸营养缺陷体[18]来遗传修饰菌株nvgh1790。因而，通过在不含烟酸的培养基中培养，确保毒性质粒的保留和因此在所述质粒上编码的oag的产生[27]。在烧瓶中25代以后和30 l发酵以后宋氏志贺氏菌nvgh1790的facs分析表明，》95%的细菌是oag阳性的，因而表明该质粒的保留。
[0098]
在中试规模的生产和1790-gmma的表征执行三个30 l一致性运行。对于每批，当od600是大约35时，在从生物反应器接种20
±
4小时内，当溶解的po2波峰出现且ph开始增加时，停止在30 l优化的发酵方法。在发酵结束时，将培养物通过微滤收获。随后，将gmma通过超滤纯化。将所述方法转移至外部合同生产组织（contract manufacturing organization）用于生产1790-gmma的两个gmp批次。在25 l规模生产gmp批次。对于在nvgh生产的一致性批次之一1790-gmma批次nvgh1883 (参照批次)和对于两种gmp药用物质1790-gmma批次1112和批次1014，呈现数据。
[0099]
gmma的收率和表征大小和完整性通过电子显微术，来自参照和gmp批次的经纯化的gmma表现出具有双峰尺寸分布的颗粒。大部分颗粒是小的，具有大约25-40 nm直径的平均尺寸。小部分颗粒是更大的，具有65-140 nm之间的大小(16%的颗粒)。
[0100]
使用malvern zetasizer nano通过动态光散射(dls)进行的尺寸分析分别给出了参照和两个gmp批次的z-平均值117 nm、113 nm和116 nm。分别关于参照和两个gmp批次，得到了多分散性指数0.19、0.21和0.20的结果。重要的是，dls结果未被多个冷冻-融化循环或在-80℃的贮存改变，从而指示gmma保持完整且在这些条件下没有聚集。因而，在配制之前常规地在-80℃储存1790-gmma。
[0101]
收率参照和两个gmp批次分别给出在纯化的gmma中2.4 g蛋白(来自30 l)、1.7 g蛋白(来自25 l)和0.42 g蛋白(来自25 l)的最终收率。这些批次分别含有145 mg、106 mg和25 mg oag，具有几乎相等的oag与蛋白比率(60.3
µ
g/mg、63.6
µ
g/mg和59.0
µ
g/mg)。其它两个一致性批次(来自30 l)是类似的：收率分别是2.0 g和3.2 g；oag与蛋白比率分别是61.6
µ
g/
mg和50.3
µ
g/mg。
[0102]
蛋白概况1790-gmma蛋白的sds-page概况类似于在以前的研究中看到的结果[22,36]。通过质谱法分析将在大约39 kda大小的优势带鉴别为ompa和ompc。
[0103]
lps和o抗原概况从参照和gmp批次提取的lps的银染色的sds-page表明具有双峰分布的lps梯子(数据未显示)。优势带是具有至多5个oag重复的低分子量lps；中间分子量lps可视作次要级分。这些数据与使用折射率检测对提取的oag/核心的分析型尺寸排阻色谱法相一致(数据未显示)。优势峰是低分子量多糖。在1790-gmma中的优势低分子量lps的该尺寸分布显著不同于从没有lps修饰的亲本菌株(1859-gmma)衍生出的参照lps中的大小，后者具有通过nmr测量的33个重复的平均值。
[0104]
通过hpaec-pad分析确定lps核心的组成。该方法证实，在存在于1790-gmma中的lps内的半乳糖与葡萄糖的摩尔比是2:4，而在来自没有lps修饰的亲本菌株(1859-gmma)的gmma中，所述比率是2:3且类似于宋氏志贺氏菌野生型菌株[22]。通过第三个lps核心糖（末端kdo）的分析，证实1790-gmma的lps核心中的葡萄糖含量的变化。在1790-gmma和1859-gmma中，半乳糖与kdo的比率是相同的。葡萄糖与kdo的比率是不同的，从而证实了在1790-gmma的lps核心中更高的葡萄糖含量。
[0105]
脂质a结构使用maldi-tof通过质谱法确定从参照批次纯化的脂质a的结构(数据未显示)。记录的波谱表明与最高峰和由于它的片段化(即一个或多个脂肪酸链的丢失)引起的几个其它峰对应的五酰化的脂质a，具有钠( 23 m/z)和去磷酸化(-80 m/z)的聚集体形成。通过maldi-tof没有检测到六-或七-酰化的脂质a。
[0106]
在mat中的il-6生产含有未修饰的lps的1859-gmma诱导高水平的来自pbmc的il-6释放，从而在0.004 ng蛋白/ml的浓度造成相对于背景而言il-6释放的10倍增加，而含有五酰化的lps的1790-gmma需要高600倍的浓度(2.37ng蛋白/ml)才能造成相同的il-6释放。
[0107]
肌肉内致热原性试验在至多7 h的不同间隔和在疫苗接种以后24 h在所有12只接受gmma疫苗的兔中观察到的平均温度升高(第一个研究中的6只接受毒理学批次，第二个研究中的3只接受毒理学批次，和3只接受临床批次)显示在图1中，与6只接受盐水的动物的平均温度升高进行对比。对于静脉内致热原性试验，所述疫苗组中的平均温度升高在正常3小时终点时仍然在增加。5 h以后，对照动物中的平均温度升高表现出显著增加，且疫苗和对照组之间的差异减小。经过24 h，疫苗和对照组不是显著不同的(疫苗组具有更低的平均温度升高)。基于这些结果，选择4 h作为限定时间点。使用如上详述形成的标准，毒理学和两个临床疫苗组通过致热原性试验，不需要重复测定。毒理学批次和两个临床批次在施用后前4 h的平均“最大温度升高”分别是0.48℃、0.53℃和0.40℃。对于对照组，所述值是0.27℃。
[0108]
毒理学研究在用1790gahb疫苗或gahb-安慰剂治疗的兔中，没有死亡，没有治疗相关的临床征状，且没有体重或食物消耗的变化。不存在治疗相关的眼科学发现。在第44天或在第56天
(即最后一次疫苗接种以后2或14天)没有观察到被认为与疫苗或安慰剂施用有关的器官重量变化。所述疫苗通过鼻内和肌肉内途径在局部被良好耐受，通过in途径没有观察到局部反应，且在im施用以后在某些兔中观察到非常轻微的(红斑、水肿)直到中等局部反应(水肿)。id施用诱导非常轻微的至中等的局部反应(硬结、红斑和水肿)，这在1790gahb组中比在对应的gahb-安慰剂组中更显著。局部反应原性在肌肉内注射部位处在2周恢复期结束之前已经完全地或部分地消退，但是在id注射部位处没有。但是，对id施用的疫苗的耐受性仍然是可接受的。在组织病理学检查后观察到低严重程度和量级的炎症性变化（包括引流淋巴结和脾的变化）；这些变化与c-反应蛋白和纤维蛋白原的增加有关，并且与对免疫原的该药理学应答相一致。临床病理学参数的变化和微小至中等微观变化在in和id治疗的组中通常已经在恢复期结束之前消退，而在im治疗的组中观察到的那些已经轻微下降，从而指示从炎症性变化的恢复正在进行中。
[0109]
与im安慰剂组相比，在接受im 1790gahb的兔中存在统计上显著的温度增加。这仅对于im组而言观察到，且主要在雄性中。与疫苗接种前相比，第一次im疫苗接种以后，在2小时时对于1790gabh而言存在0.43℃的平均温度升高，与此相比，对于安慰剂而言为0.12℃(p = 0.009，t-检验)，在6 h时对于1790gahb而言为0.64℃，与此相比，对于安慰剂而言为0.38℃(p = 0.005，t-检验)。在注射后24 h，在这些组中不存在差异(与疫苗接种之前的最初温度相比，分别增加0.21和0.22℃)。在第3次和第4次注射以后在im组中观察到类似的温度升高(1790gahb相对于安慰剂，与疫苗接种前相比在6 h时0.44℃相对于0.11℃和0.63℃相对于0.33℃的温度增加)。在第二次免疫接种以后观察到更小的、但是统计上不显著的增加(与疫苗接种前相比在6 h时0.28℃相对于0.14℃)。尽管认为差异是1790gahb相关的，考虑到非常低的变异量级和短增加时间段，不认为所述效应是毒理学上有关的。
[0110]
irwin研究在单次施用1790gahb以后在大鼠中评估in疫苗接种的神经中毒效应的irwin研究没有表明对一系列覆盖主要中枢和周围神经系统功能的行为和生理学参数的有关影响。
[0111]
在小鼠中的免疫原性和效能最初的免疫原性研究评价了腹膜内地注射的7种不同剂量的1790gahb，从29 ng以4倍增加至238
µ
g蛋白(1.75 ng至14.35
µ
g oag)，并表明所述疫苗是高度免疫原性的。抗体在单次注射以后在所有剂量都是可发觉的，并在第二次注射以后强化。1.86
µ
g蛋白(0.11
µ
g oag)触发最大抗体应答。基于这些结果，开发了免疫原性方案以形成效能试验的基础和评估随时间的稳定性（如通过效能判断的）。最终的效能研究设计在8只小鼠的组中使用4种4倍递增剂量的1790gahb，从29 ng至1.86 μg蛋白，在单次免疫接种以后3周通过elisa在具有同源oag的lps上评估血清igg水平。为每个效能研究新鲜配制参照1790gahb制品，并在与试验疫苗相同的剂量施用。对比了由试验疫苗和参照标准引起的抗体水平的剂量-响应曲线。对数转化的抗-lps抗体相对于剂量对数的线性回归的斜率或截距没有显著显著差异，从而表明疫苗稳定性批次具有与新鲜配制的参照物质相同的效能。
[0112]
在兔中的免疫原性在每次疫苗接种以后和在最终放血时，评估来自毒理学研究的兔中的igg应答。所有三个途径给出高水平的循环抗-lps igg (数据未显示)。已经在单次肌肉内注射100
µ
g剂量的1790gahb以后14天实现最大应答。对于in途径，最大抗体应答需要两次免疫接种。最后
一次疫苗接种以后14天的循环igg抗-lps水平没有显著不同于用100
µ
g剂量的1790gahb的im递送实现的水平。10
µ
g id疫苗接种也给出响应于随后疫苗接种的增加(spearman秩检验p 《0.0001)，但是效应不如in途径显著。id途径的最终循环抗-lps igg水平显著高于im途径(对数转化的抗体的t检验，p = 0.002)。
[0113]
使用宋氏志贺氏菌1790gahb的i期临床试验执行该临床试验以评价3剂针对宋氏志贺氏菌的候选疫苗(1790gahb疫苗)当在不同剂量在健康成年人(在登记时18-45岁)中施用时的安全性和免疫原性。相对于安慰剂(gahb-安慰剂)的安全性概况评价1790gahb疫苗的安全性概况，所述安慰剂用具有与研究疫苗制剂相同浓度的氢氧化铝混悬液构建。将主体随机化以接受间隔4周的1790gahb疫苗(在5种抗原浓度)或gahb安慰剂的3次疫苗接种。
[0114]
生产菌株含有以下遗传修饰的宋氏志贺氏菌：δtolr：破坏内膜和外膜之间的联系以给出大量外膜泡(gmma)；δhtrb：以减少lps的反应原性；virg nada/b敲入：稳定编码o抗原(oag)的毒性质粒每0.5 ml剂量的最大量(肌肉内)100 μg蛋白的gmma6.1
µ
g oag0.35 mg铝作为alhydrogel
®
在等渗的tris缓冲盐水中每0.5 ml剂量的安慰剂(肌肉内)0.35 mg铝作为alhydrogel
®
在等渗的tris缓冲盐水中通过在安慰剂中稀释最大剂量制备的用于递送的较低剂量注射体积：肌肉内：0.5 ml
[0115]
所有剂量的1790gahb都被良好耐受，且安全性数据支持当通过im途径递送时每剂≤100 μg 1790gahb蛋白的应用。血清学评估指示在接受25
µ
g、50
µ
g和100
µ
g 1790gahb的主体中在第一次、第二次和第三次疫苗接种以后1个月引起足够的血清igg抗-宋氏志贺氏菌lps水平(图2(a)和(b))。这些组中的抗体的中位水平大于在康复期血清中观察到的水平。这些数据支持1790gahb作为基于gmma的宋氏志贺氏菌疫苗和4-6种不同gmma的组合在多价制剂中的应用，从而呈现与1790gahb类似的反应原性-免疫原性概况。
[0116]
在小鼠中的多价志贺氏菌疫苗(i)免疫原性评估
在该研究中，试验了多价志贺氏菌属gmma疫苗，具体地是含有来自gems研究的4种最流行血清型（宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌2a、3a和6）的gmma的alhydrogel
®
制剂。
[0117]
为此目的，弗氏志贺氏菌菌株的gmma生产由tolr缺失增强（如在宋氏志贺氏菌中），且lps的反应原性通过htrb基因的缺失通过脂质a的遗传修饰来减小。为4-价制剂和单一gmma制剂选择alhydrogel
®
制剂，这基于1790gahb在兔中的以下经验：向氢氧化铝的吸附会增强耐受性。该研究是弗氏志贺氏菌血清型的第一个免疫原性研究。如关于1790gahb使用的，基于蛋白质含量制备制剂。基于生化表征，弗氏志贺氏菌2a gmma含有比1790-gmma多大约10倍的oag /mg蛋白。因而，选择比在常规1790gahb效能研究(29 ng，参见上面)中低10倍的开始浓度。对于弗氏志贺氏菌3a gmma和弗氏志贺氏菌6 gmma，建立类似的定量施用。将对单一gmma制剂(宋氏志贺氏菌或弗氏志贺氏菌2a、3a或6)的oag应答与对4-价制剂引起的相同oag的应答进行对比。在4-价制剂中包括的所有组分的强免疫原性将提供多价制剂的免疫原性的概念的证据，并支持多价oag-gmma制剂的进一步开发。
[0118]
在4-价制剂中，每种组分以与在前述单一制剂中相同的浓度存在。因而，4-价制剂的总蛋白质含量是160
µ
g/ml。对于4-价制剂，将宋氏志贺氏菌gmma、弗氏志贺氏菌2a gmma、弗氏志贺氏菌3a gmma和弗氏志贺氏菌6 gmma在相同浓度混合，然后如上面详细说明的用氢氧化铝配制。gahb alhydrogel
®
diluent placebo（稀释剂安慰剂）含有：与在1790gahb中相同浓度的alhydrogel
®
在tris-缓冲盐水中的溶液(alhydrogel
®
0.7 mg al
3
/ml, 10 mm tris, ph 7.4, 9 g/l氯化钠)。
[0119]
免疫接种在第0天用4种不同剂量的制剂（如在下表中所述）腹膜内地免疫balb/c小鼠(8只/组)。用alhydrogel
®
稀释剂(gahb-安慰剂)作为对照，免疫一组。在免疫接种之前，针对细菌污染试验所有制剂。简而言之，将50
µ
l每种制剂一式三份地铺板在lb琼脂平板上，并在37℃温育24 h以后检查平板的生长。仅不具有细菌生长的制剂用于免疫接种。
组#小鼠#抗原名称抗原剂量(在蛋白中)佐剂(每剂0.35mgal
3
)vpa途径11-8宋氏志贺氏菌(1790gahb)2ngalhydrogel500
µ
lip29-16弗氏志贺氏菌2a2ngalhydrogel500
µ
lip317-24弗氏志贺氏菌3a2ngalhydrogel500
µ
lip425-32弗氏志贺氏菌62ngalhydrogel500
µ
lip533-404-价组合8ngalhydrogel500
µ
lip641-48宋氏志贺氏菌(1790gahb)20ngalhydrogel500
µ
lip749-56弗氏志贺氏菌2a20ngalhydrogel500
µ
lip857-64弗氏志贺氏菌3a20ngalhydrogel500
µ
lip965-72弗氏志贺氏菌620ngalhydrogel500
µ
lip1073-804-价组合80ngalhydrogel500
µ
lip1181-88宋氏志贺氏菌(1790gahb)200ngalhydrogel500
µ
lip1289-96弗氏志贺氏菌2a200ngalhydrogel500
µ
lip1397-104弗氏志贺氏菌3a200ngalhydrogel500
µ
lip14105-112弗氏志贺氏菌6200ngalhydrogel500
µ
lip15113-1204-价组合800ngalhydrogel500
µ
lip16121-128宋氏志贺氏菌(1790gahb)2000ngalhydrogel500
µ
lip17129-136弗氏志贺氏菌2a2000ngalhydrogel500
µ
lip18137-144弗氏志贺氏菌3a2000ngalhydrogel500
µ
lip19145-152弗氏志贺氏菌62000ngalhydrogel500
µ
lip
20153-1604-价组合8000ngalhydrogel500
µ
lip21161-168gahb-安慰剂-alhydrogel500
µ
lip
[0120]
为血清学抽取的血液：在第21天从所有动物得到血液，收集血清，并在试验之前在2-8℃储存血清。
[0121]
elisa执行elisa以确定小鼠的抗-宋氏志贺氏菌lps、抗-弗氏志贺氏菌2a oag、抗-弗氏志贺氏菌3a oag、抗-弗氏志贺氏菌6 oag抗体水平，所述小鼠分别用alhydrogel
®
配制的来自宋氏志贺氏菌、弗氏志贺氏菌2a、弗氏志贺氏菌3a和弗氏志贺氏菌6的gmma免疫，它们单独施用或作为4-价疫苗的部分施用。宋氏志贺氏菌、弗氏志贺氏菌2a和弗氏志贺氏菌3a的结果显示在图3和4中。
[0122]
用递增浓度的1790gahb免疫并产生特异性的抗-宋氏志贺氏菌lps抗体(在elisa单元中测量)的小鼠给出具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.86的相关系数的显著spearman秩，用递增浓度的4-价制剂免疫的小鼠产生特异性的抗-宋氏志贺氏菌lps抗体(在elisa单元中测量)，具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.86的相关系数的显著spearman秩。
[0123]
用递增浓度的弗氏志贺氏菌3a免疫的小鼠产生特异性的抗-弗氏志贺氏菌3a oag抗体和具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.84的相关系数的显著spearman秩。类似地，用递增浓度的4-价制剂免疫的小鼠产生特异性的抗-弗氏志贺氏菌3a oag抗体，具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.73的相关系数的显著spearman秩。用来自递增浓度的弗氏志贺氏菌2a免疫的小鼠的血清得到的抗-弗氏志贺氏菌2a oag elisa od产生具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.75的相关系数的显著spearman秩。用递增浓度的4-价制剂免疫的小鼠也产生抗-弗氏志贺氏菌2a oag抗体，其具有p 《 0.0001 (α=0.05)和0.75的相关系数的显著spearman秩。各个剂量-响应曲线对比的结果显示在图4中。在单一gmma制剂和4-价制剂之间没有观察到关于任何血清变型特异性应答的显著差异，从而指示不存在干扰。
[0124]
facs分析针对4-价gmma制剂产生的抗血清会识别野生型宋氏志贺氏菌、弗氏志贺氏菌2a、弗氏志贺氏菌3a和弗氏志贺氏菌6。而各种gmma抗血清识别同源的细菌菌株。
[0125]
结论针对由4-价志贺氏菌属制剂引起的特定志贺氏菌属血清变型的血清抗体应答没有不同于各种组分。因而，不存在干扰的证据。
[0126]
多价志贺氏菌疫苗(ii)举例说明了一种多价志贺氏菌属gmma疫苗，具体地是含有来自宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌1b、2a、3a和6的gmma的alhydrogel
®
制剂。
[0127]
弗氏志贺氏菌菌株的gmma生产由tolr缺失增强（如在宋氏志贺氏菌中），且lps的反应原性通过msbb或htrb基因的缺失通过脂质a的遗传修饰来减小。象前面一样，为5-价制剂和单一gmma制剂选择alhydrogel
®
制剂，这基于1790gahb在兔中的以下经验：向氢氧化铝的吸附会增强耐受性。
[0128]
在5-价制剂中，每种组分以与在前述单一制剂中相同的浓度存在。对于5-价制剂，将宋氏志贺氏菌gmma、弗氏志贺氏菌1b gmma、弗氏志贺氏菌2a gmma、弗氏志贺氏菌3a gmma和弗氏志贺氏菌6 gmma在相同浓度混合，然后如上面详细说明的用氢氧化铝配制。
[0129]
多价志贺氏菌疫苗(iii)举例说明了一种多价志贺氏菌属gmma疫苗，具体地是含有来自宋氏志贺氏菌和弗氏志贺氏菌1b、2a、2b、3a和6的gmma的alhydrogel
®
制剂。
[0130]
弗氏志贺氏菌菌株的gmma生产由tolr缺失增强（如在宋氏志贺氏菌中），且lps的反应原性通过msbb或htrb基因的缺失通过脂质a的遗传修饰来减小。象前面一样，为6-价制剂和单一gmma制剂选择alhydrogel
®
制剂，这基于1790gahb在兔中的以下经验：向氢氧化铝的吸附会增强耐受性。
[0131]
在6-价制剂中，每种组分以与在前述单一制剂中相同的蛋白或o-抗原浓度存在。对于6-价制剂，将宋氏志贺氏菌gmma、弗氏志贺氏菌1b gmma、弗氏志贺氏菌2a gmma、弗氏志贺氏菌2b gmma、弗氏志贺氏菌3a gmma和弗氏志贺氏菌6 gmma在相同浓度混合，然后如上面详细说明的用氢氧化铝配制。
[0132]
具体组合a)一种免疫原性组合物，其包含(a)从宋氏志贺氏菌53gδtolr、δhtrb、virg::nadab突变体纯化的gmma，(b)从弗氏志贺氏菌2a 2457tδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(c)从弗氏志贺氏菌3a 6885δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(d)从弗氏志贺氏菌6 10.8537δtolr、δhtrbδmsbb1突变体纯化的gmma，和(e)铝佐剂，其中所述gmma包含经修饰的脂质a，且其中所述弗氏志贺氏菌菌株是毒性质粒消除的。
[0133]
b)一种免疫原性组合物，其包含(a)从宋氏志贺氏菌53gδtolr、δhtrb、virg::nadab突变体纯化的gmma，(b)从弗氏志贺氏菌2a 2457tδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(c)从弗氏志贺氏菌3a 6885δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(d)从弗氏志贺氏菌6 10.8537δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(e)从弗氏志贺氏菌1b stansfieldδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，和(f)铝佐剂，其中所述gmma包含经修饰的脂质a，且其中所述弗氏志贺氏菌菌株是毒性质粒消除的。
[0134]
c)一种免疫原性组合物，其包含(a)从宋氏志贺氏菌53gδtolr、δhtrb、virg::nadab突变体纯化的gmma，(b)从弗氏志贺氏菌2a 2457tδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(c)从弗氏志贺氏菌3a 6885δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(d)从弗氏志贺氏菌6 10.8537δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(e)从弗氏志贺氏菌2b 69/50δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，和(f)铝佐剂，其中所述gmma包含经修饰的脂质a，且其中所述弗氏志贺氏菌菌株是毒性质粒消除的。
[0135]
d)一种免疫原性组合物，其包含(a)从宋氏志贺氏菌53gδtolr、δhtrb、virg::nadab突变体纯化的gmma，(b)从弗氏志贺氏菌2a 2457tδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(c)从弗氏志贺氏菌3a 6885δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(d)从弗氏志贺氏菌6 10.8537δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(e)从弗氏志贺氏菌1b stansfieldδtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，(f)从弗氏志贺氏菌2b 69/50δtolr、δmsbb1突变体纯化的gmma，和(g)铝佐剂，其中所述gmma包含经修饰的脂质a，且其中所述弗氏志贺氏菌菌株是毒性质粒消除的。
[0136]
e)(a)、(b)、(c)或(d)的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝，例如，alhydrogel
®
。
[0137]
f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的任一项的免疫原性组合物，其包含至少一种药用载
lerner-geva l, 等人. age-related efficacy of shigella o-specific polysaccharide conjugates in 1-4-year-old israeli children. vaccine. 2010;28: 2231-2235.11. susanna esposito , roman prymula , gian vincenzo zuccotti , fang xie , michelangelo barone , peter m dull , daniela toneatto, a phase ii randomized controlled trial of a multicomponent meningococcal serogroup b vaccine, 4cmenb, in infants (ii). human vaccines & immunotherapeutics第10卷, 第7期, 2014.12. erlandson and mackey (1958) j bacteriol 75(3): 253-7.13. us-5681736.14. uyttendaele等人(2001) international journal of food microbiology 70(3):255-65.15. formal sb, kent th, may hc, palmer a, falkow s, labrec eh. protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. j bacteriol. 1966;92: 17-22.16. makino s, sasakawa c, kamata k, kurata t, yoshikawa m. a genetic determinant required for continuous reinfection of adjacent cells on large plasmid in s. flexneri 2a. cell. 1986;46: 551-555.17. berlanda scorza f, colucci am, maggiore l, sanzone s, rossi o, ferlenghi i, 等人. high yield production process for shigella outer membrane particles. plos one. 2012;7: e35616.18. prunier a-l, schuch r, fernandez re, mumy kl, kohler h, mccormick ba, 等人. nada and nadb of shigella flexneri 5a are antivirulence loci responsible for the synthesis of quinolinate, a small molecule inhibitor of shigella pathogenicity. microbiology. 2007;153: 2363-2372.19. clementz t, bednarski jj, raetz cr. function of the htrb high temperature requirement gene of escherchia coli in the acylation of lipid a. j biol chem. 1996;271: 12095-12102.20. rossi o, pesce i, giannelli c, aprea s, caboni m, citiulo f, 等人. modulation of endotoxicity of shigella generalized modules for membrane antigens (gmma) by genetic lipid a modifications: relative activation of tlr4 and tlr2 pathways in different mutants. j biol chem. 2014;289: 24922-24935.21. micoli f, rondini s, gavini m, pisoni i, lanzilao l, colucci am, 等人. a scalable method for o-antigen purification applied to various salmonella serovars. anal biochem. 2013;434: 136-145.22. robbins jb, kubler-kielb j, vinogradov e, mocca c, pozsgay v, shiloach j, 等人. synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of shigella sonnei o-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. proc natl acad sci u s a. 2009;106: 7974-7978.
23. westphal o, jann k. bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure. 1965;5: 83-91.24. stoddard mb, pinto v, keiser pb, zollinger w. evaluation of a whole-blood cytokine release assay for use in measuring endotoxin activity of group b neisseria meningitidis vaccines made from lipid a acylation mutants. clin vaccine immunol. 2010;17: 98-107.25. pyrogens. in: european pharmacopoeia. 第8版strasbourg, cedex: directorate for the quality of medicines & healthcare of the council of europe (edqm). 2013. 第2.6.8章.26. moscardo e, maurin a, dorigatti r, champeroux p, richard s. an optimised methodology for the neurobehavioural assessment in rodents. j pharmacol toxicol methods. 2007;56: 239-255.27. jiang y, yang f, zhang x, yang j, chen l, yan y, 等人. the complete sequence and analysis of the large virulence plasmid pss of shigella sonnei. plasmid. 2005;54: 149-159.28. rossi o, maggiore l, necchi f, koeberling o, maclennan ca, saul a, 等人. comparison of colorimetric assays with quantitative amino acid analysis for protein quantification of generalized modules for membrane antigens (gmma). mol biotechnol. 2014;出版中.29. [a]. maggiore l, yu l, omasits u, rossi o, dougan g, thomson nr, saul a, choudhary js, gerke c. quantitative proteomic analysis of shigella flexneri and shigella sonnei generalized modules for membrane antigens (gmma) reveals highly pure preparations. int j med microbiol. 2016 feb;306(2):99-10830. [b]. christiane gerke, anna maria colucci, carlo giannelli, silvia sanzone, claudia giorgina vitali, luigi sollai, omar rossi, laura b. martin, jochen auerbach, vito di cioccio, allan saul. production of a shigella sonnei vaccine based on generalized modules for membrane antigens (gmma), 1790gahb.31. plos one. 2015; 10(8): e013447831. zhu d, huang s, gebregeorgis e, mcclellan h, dai w, miller l, saul a. development of a direct alhydrogel
®
formulation immunoassay (dafia). j immunol methods. 2009 may 15;344(1):73-832. datsenko等人(proc natl acad sci u s a. 2000年6月6日; 97(12):6640-5.