一种超声和近红外光激发的相变磁性纳米溶栓药物及其制备方法与流程

1.本发明属于医药材料技术领域，具体涉及一种超声和近红外光激发的相变磁性纳米溶栓药物及其制备方法。


背景技术：

2.目前，静脉血栓栓塞已成为全球医疗体系的主要负担，每年约有1000万例，是继脑卒中和急性心肌梗死之后最常见的心血管疾病。深静脉血栓的幸存者预后较差，其死亡率每年约10%。超过50%的深静脉血栓患者将会发展为血栓后综合症，表现为血栓部位疼痛、水肿和溃疡，严重降低患者的生活质量。在全世界引起心血管疾病的死亡因素中，深静脉血栓排第三，仅次于冠状动脉疾病和卒中。
3.现在临床上的溶栓药物主要包括链激酶、尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等。其中链激酶和尿激酶价格便宜，在发展中国家如中国、印度被大量使用。而阿替普酶和瑞替普酶作为新一代溶栓药物价格昂贵但疗效较好，在欧美发达国家使用较为频繁。目前所有的溶栓药物都存在大量消耗内源性的凝血因子问题，从而导致出血副作用。血栓形成后，人体本身能产生内源性的纤溶酶原激活剂来溶栓，但是在临床溶栓治疗中，为了达到快速溶栓以疏通血管降低致死率和致残率的目的，所使用的溶栓药的浓度比内源性纤溶酶原激活剂浓度高20～40倍。短时间内高浓度的溶栓药浓度可能会降低凝血系统的功能，导致各种出血副作用。溶栓药激活产生的纤溶酶，随着血液流动离开血栓部位分布到其它血管从而产生脱靶效应，血液中的纤溶酶抑制剂不足以快速完全抑制其活性。纤溶酶作为一种广谱的蛋白酶，能作用于纤维蛋白原vwf、fviii、fv、fva、fix、fx等，从而破坏了血液的凝血功能，提高了出血风险。
4.中国专利cn 106620677 b公开了一种基于高分子载体的尿激酶制剂及其制备方法。所述尿激酶制剂载体为聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物中空凝胶颗粒，装载物为聚乙二醇交联尿激酶纳米凝胶。该发明将超声诱导释放与环境ph响应诱导释放相结合，以应对供血动脉发生堵塞而产生的循环障碍和大血管血栓溶解后产生的二次小栓塞导致的微循环障碍。但是该制剂缺乏主动靶向和多模成像能力，在实际临床应用中不能主动靶向到血栓部位。此外，其设计的ph响应释放功能也可能在人体其他低ph部位提前释放药物从而破坏非病灶部位血液的凝血功能，提高了出血风险。再如中国专利cn 109157513 b公开了一种血栓靶向长循环缓释脂质体及其制备方法。所述血栓靶向长循环缓释脂质体包括由溶栓药物、星型胆酸功能化聚乳酸、大豆磷脂、胆固醇所构成的载药缓释脂质体及在其表面交错覆盖的血小板膜和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。制得的血栓靶向长循环缓释脂质体虽然克服了当前血栓药物需要大量频繁给药和缺乏靶向性的问题，但是作为一种缓释药剂，不能迅速定点清除大块血栓，这限制了它在临床上的应用。
5.

技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种超声和近红外光激发的相变磁性纳米溶栓
药物及其制备方法。通过fe3o4的使用，该纳米电机可以用于磁导和磁共振成像。将pfh包裹在脂质体中，在超声环境下产生气体，使血栓表面破裂。同时，通过引入pfh实现了光声（pa）和超声（us）成像。此外，uk被包裹在脂质体中，可以协同破坏血栓并加速溶栓。详细地说，设计的纳米马达预期通过磁场引导和驱动在血栓表面定向。pfh在超声和808 nm近红外光激光的作用下发生相变，释放大量气体侵蚀血栓。同时，纳米马达快速扩张所产生的动量推动uk进一步渗透到血栓中，扩大了脂质体与血栓的接触面积，从而提高了溶栓效果。我们的综合研究表明，相变磁性纳米运动具有良好的细胞相容性、血栓靶向性和多模态成像能力，在lifu的帮助下，纳米马达可以加速溶栓过程。我们设想，我们的智能纳米马达为深静脉溶栓提供了一个有前景的平台。
6.为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种超声和近红外光激发的相变磁性纳米溶栓药物的制备方法，包括以下步骤：（1）将纳米级fe3o4分散在甲醇中并进行超声预处理；（2）将二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、叠氮磷酸二苯酯（dppa）、1，2-双（二苯膦）乙烷（dppe）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（dspe-mpeg-2000）溶于氯仿中；（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜；（4）配置水合液，然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中；（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，并在破碎中逐滴加入pfh液体。
7.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒；（7）将步骤（6）中离心得到脂质体悬浮液用透析袋透析，以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
8.优选地，步骤（1）中所述的分散在甲醇中的fe3o4的量为5～15 mg，甲醇的量为5 ml，超声时间为20 min。
9.优选地，步骤（2）中所述的配置dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000的质量比分别为（5～35 mg）：（2～10 mg）：（2～10 mg）：（2～10 mg）。氯仿的量为10 ml。
10.优选地，步骤（3）中进行的旋蒸操作，设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
11.优选地，步骤（4）中所述的水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和5～50 mg。
12.优选地，步骤（5）中细胞破碎仪功率为100～500 w，持续时间30 min。
13.优选地，步骤（5）中所述的逐滴加入pfh的量为0.2～0.8 ml。
14.优选地，步骤（6）中所述的离心操作，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。
15.优选地，步骤（7）中所述的透析，选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析时间为2～10 h。
16.与现有技术相比，本发明的创新之处在于：
我们设计了一种集磁靶向驱动、相变溶栓、药物治疗、光热治疗、超声溶栓和多模态成像功能于一体的用于深静脉溶栓的多功能纳米材料。
17.（1）通过fe3o4的使用，该纳米马达可以进行磁场引导和驱动，解决了传统uk药物缺乏靶向功能的弊端和易导致全身出血并发症的风险。另外，脂质体材料本身是类细胞结构，具备良好的生物安全性，表面的peg链可以使脂质体在体内的存留时间更长，更不易被免疫系统清除。
18.（2）纳米材料在近红外光下通过landau阻尼效应将光能快速转化为热疗法，表现出优异的光热效应。近红外激光的光热效应联合超声热效应，可以导致局部温度升高的更快，并更有效地损伤红细胞、血小板和纤维蛋白。
19.（3）将pfh包裹在脂质体中，在超声环境下产生气体，气体膨胀破裂从而可以快速释放药物。产生的气体在超声的空化作用下可迅速侵蚀血栓，通过药物和超声场的协同效应可以大大提高溶栓效率。
附图说明
20.图1为光声信号检测溶栓图；图2为细胞死活染色图；图3为大鼠内脏切片h&e染色图。
具体实施方式
21.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
22.本发明公开了一种超声和近红外光激发的相变磁性纳米溶栓药物及其制备方法，主要包括以下步骤：（1）将纳米级fe3o4分散在甲醇中并进行超声预处理；（2）将dppc、dppa、dppe和dspe-mpeg-2000溶于氯仿中；（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜；（4）配置水合液，然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中；（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，并在破碎中逐滴加入pfh液体。
23.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒；（7）将步骤（6）中离心得到脂质体悬浮液用透析袋透析，以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
24.需要说明的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，本领域的技术人员可通过不同方式修改所描述的实施例。因此，实施例是为了对本发明的技术特征和有益效果有更好的理解，不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
25.以下，结合具体实施例、对比例对本发明做进一步说明。
26.实施例1（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
27.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
28.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
29.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
30.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
31.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
32.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
33.实施例2（1）将5 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
34.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
35.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
36.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
37.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
38.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
39.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
40.实施例3（1）将15 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
41.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
42.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温
度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
43.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
44.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
45.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
46.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
47.实施例4（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
48.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：12mg溶于10 ml氯仿中。
49.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
50.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
51.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
52.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
53.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
54.实施例5（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
55.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：3mg溶于10 ml氯仿中。
56.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
57.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
58.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
59.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时
间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
60.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
61.实施例6（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
62.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
63.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
64.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和30 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
65.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
66.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
67.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
68.实施例7（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
69.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
70.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
71.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和10 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
72.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
73.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
74.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
75.实施例8（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
76.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
77.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
78.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
79.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.2 ml pfh液体。
80.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
81.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
82.实施例9（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
83.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
84.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
85.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
86.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.8 ml pfh液体。
87.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
88.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
89.实施例10（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
90.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
91.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
92.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
93.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率
为100 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
94.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
95.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
96.对比例1（1）将5 ml甲醇超声处理，超声时间为20 min。
97.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
98.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
99.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
100.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
101.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
102.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
103.对比例2（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
104.（2）将dppc、dppa、dppe分别称取质量20 mg：6mg：6 mg溶于10 ml氯仿中。
105.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
106.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
107.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
108.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
109.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
110.对比例3（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
111.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于
10 ml氯仿中。
112.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
113.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
114.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。并且在破碎中逐滴加入0.5 ml pfh液体。
115.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
116.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
117.对比例4（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
118.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
119.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
120.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
121.（5）将步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液用细胞破碎仪破碎，细胞破碎仪功率为300 w，持续时间30 min。
122.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
123.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
124.对比例5（1）将10 mg fe3o4分散在5 ml甲醇中，超声时间为20 min。
125.（2）将dppc、dppa、dppe、dspe-mpeg-2000分别称取质量20 mg：6mg：6 mg：6mg溶于10 ml氯仿中。
126.（3）将步骤（1）中得到的分散在甲醇中的纳米级fe3o4加入到步骤（2）中得到的氯仿溶液中，并用旋转蒸发仪蒸干溶剂使旋蒸瓶内表面形成一层均匀的脂膜。旋蒸操作设置温度为55℃，真空度为200 bar，转速为300 rpm，旋蒸时间持续30 min。
127.（4）配制水合液，水合液成分为pbs缓冲溶液、甘油和嵌段式聚醚f-68和uk。配制的量分别为5 ml、0.5 ml、3 mg和20 mg。然后将水合液加入步骤（3）中的旋蒸瓶内，超声将脂膜剥离并分散在水合液中。
128.（5）在步骤（4）中得到的分散有脂膜的水合液中滴加0.5 ml pfh液体。
129.（6）将步骤（5）中得到的液体移至离心管内离心，设置离心转速800 r/min，离心时间为15 min。离心后取上层液体，以除去未包封的fe3o4和粒径较大的脂质体颗粒。
130.（7）选择透过分子量为1000 kda的透析带，透析离心后的上层液体4 h以除去未包封的uk。之后将其移至棕色的西林瓶内置于4℃冰箱保存。
131.根据实施例1至实施例10，对比例1至对比例5，将制备得到的15种型号各异的纳米溶栓材料进行表征和测试，得到如下表1中的数据。
132.从表1可以看出，与实施例1相比，实施例2减少了fe3o4在总材料中的占比，而实施例3又增加了fe3o4的用量。在实施例2中，大鼠断尾出血时间明显比实施例1、实施例3的长。这是因为fe3o4主要是给纳米材料提供磁靶向功能。fe3o4的用量越多，纳米材料的顺磁性越强，磁靶向能力也越强，从而越不容易造成溶栓药物脱靶情况。同样在静态、动态模型实验中证明了靶向性强的实施例3可以更高效率的溶解血栓。与实施例5相比，实施例1与实施例4增加了dspe-mpeg-2000的比重。dspe-mpeg-2000可以有效降低纳米材料在体内被免疫系统清除的风险，可以增加我们材料在体内的停留时间。所以在dspe-mpeg-2000比例较低的实施例5中，体内溶栓效率明显下降。与实施例7相比，实施例1与实施例6增加了包载药物uk的浓度。uk浓度的增加确实可以提高体外和体内的溶栓效率，但是过高的uk浓度也同样影
响实施例6中的大鼠体内凝血功能。实施例9相比于实施例1和实施例8增加了pfh的用量。在超声和近红外激光叠加升温中，实施例9的升温速度最慢，因为超声场和激光场需要先消耗一部分能量来气化pfh液体。此外，pfh的气化膨胀可以有效的促进药物释放，而气化后的pfh气体在超声的空化作用下可以更好的侵蚀血栓。因此实施例9的体内和体外溶栓效率要明显由于实施例1和实施例8。实施例10相比与实施例1，实施例10没有使用细胞破碎仪，粒径比较大，没有有效的包覆uk和pfh。所以相比于实施例10的出血风险高于实施例1，溶血效率也不及实施例1。从表2还可以看出，与实施例1相比，对比例1中未添加fe3o4；与实施例1相比，对比例2中未添加dspe-mpeg-2000；与实施例1相比，对比例3中未添加uk；与实施例1相比，对比例4中未添加pfh；与实施例1相比，对比例5中未采用细胞破碎仪破碎。相应的实验结果表明，在缺少上述任一助剂或条件的情况下，溶血效率和体内凝血功能均受到不良影响。我们的多功能材料可明显反射光声信号。在光声成像中，血红蛋白氧饱和度（so2）水平是临床诊断溶栓的重要功能生物标志物之一。有文献报道正常血管中so2水平高于血栓区。因此，我们通过观察血栓内的so2水平来观察血栓的破坏程度，并根据同一时间段so2的变化情况计算不同组的溶栓速度（图1）。 nm-mnu组（对纳米材料lip（fe3o4/pfh/uk）施加磁场、激光和超声场）明显发现血栓区光声信号变化较其他组明显（由红转蓝）。 这种信号变化可能是由于血栓逐渐溶解，使血管内氧含量升高，为溶栓过程铺平了道路。 更有趣的是，虽然nm（纳米材料lip（fe3o4/pfh/uk））和nm-mnu组在前1 h内溶栓能力较好，但只有nm-mnu组在3 h后仍保持一定比例的溶栓速度，说明近红外激光、磁体和超声场极大地提高了纳米马达的体内留存率，并确保了像早期阶段一样强有力的长时间溶栓作用。显著的强度差异显示，nm-mnu组比其他组更容易实现血管再通程度。 总之，这些观察结果与体内溶栓评价一致，从医学影像学角度进一步证实了nm-mnu组加速溶栓的可行性，也为近期潜在的临床前试验提供了有力的证据。
133.良好的细胞毒性和生物安全性是溶栓药物所必须具备的一个特性。在倒置荧光显微镜下，用calcein-am（绿色，活细胞）和pi（红色，死细胞）对纳米马达进行活/死染色，验证体外细胞毒性（图2）。从视觉上看，纳米材料处理后的细胞增殖与对照组相似，说明纳米马达具有令人信服的细胞相容性。图3展示的是对小鼠注射给药后处死后做的生物安全性评估，通过对小鼠心肝脾肺肾器官的h&e染色分析与对照组无明显差别。总之这些结果表明纳米材料无明显细胞毒性，生物安全性良好，可在体内应用。
134.以上所述的实施例仅出于示范的目的，并非对本发明作任何形式上的限制。应当了解，凡在不越过本发明的精神和技术范围的条件下，本发明的技术人员可在范围内做出各种替换、改进，这些替换、改进均在本发明的保护范围之内。