一种布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别方法

1.本发明属于细胞生物学、免疫学技术及智能图像处理技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法。具体涉及布鲁氏菌介导小鼠巨噬细胞自噬，用人工智能和图像处理技术对自噬小体和自噬溶酶体进行识别，智能计数自噬小体和自噬溶酶体个数。


背景技术：

2.目前，布鲁氏菌病(brucellosis)是一种具有高度传染性人畜共患传染病，可引起人类波浪热、慢性感染和反刍动物流产、睾丸炎、关节炎等，在世界范围内流行，只有少数国家完成了净化。布鲁氏菌宿主范围很广，包括牛、绵羊、山羊、犬、野生陆生哺乳动物和海洋哺乳动物等，人可以通过直接接触染病动物及其肉、奶产品或吸入病原菌气溶胶感染布病。布鲁氏菌(brucella)是革兰氏阴性、胞内寄生菌，入侵动物机体后首先进入巨噬细胞和树突状细胞等吞噬细胞，并在细胞内完成复制，然后扩散到胎盘滋养层细胞、单核吞噬细胞，形成对宿主的慢性感染。和许多胞内寄生菌一样，布鲁氏菌能够拮抗宿主细胞的捕杀，逃避溶酶体降解，从而实现在其在宿主细胞内的生存和复制。布鲁氏菌刺激巨噬细胞导致的自噬与其在巨噬细胞内的复制密切相关。布鲁氏菌进入巨噬细胞后，藏匿于布氏小体中(brucella-containing vacuole，bcv)，bcv沿着内吞和分泌途径运输，使布鲁氏菌逃避溶酶体的吞噬并在内质网衍生的隔间中复制。在感染晚期，布鲁氏菌在内质网上的隔室转变为具有自噬体特征的大液泡，也称为自噬bcv。
3.自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。自噬小体(autophagosome)是由双层膜将一小部分细胞质包围而成，通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)从而降解其内容物。对自噬的检测有助于本发明了解更加快速直接准确的评估自噬水平的变化情况。
4.常用的细胞自噬检测方法有透射电镜检测、自噬体膜标志性蛋白lc3的检测、激光共聚焦检测、自噬通量的检测等等。其中，透射电镜是检测自噬体的直接方法，也是检测自噬体的金标准。通过制备细胞标本，利用透射电镜观察样品中有无自噬泡可以对细胞自噬进行定性，检测超薄切片中的自噬小体和自噬溶酶体的个数或自噬泡的面积可以对细胞自噬进行定量。该方法的缺点是在样品制备过程中可能出现误差，例如，不同切面自噬泡个数不同，所得结果可能与整个细胞的自噬状况相距较大。想要获得更准确的细胞自噬情况，就必须制备大量的细胞切片，进行人工观察和计数。但是对大量的透射电镜样本照片中的自噬体进行人工计数的方式工作量大、效率低、主观因素多，智能图像处理技术能够很好地解决这一问题。显微图像一直是医学诊断的主要依据，是临床病理分析的重要内容。随着人工智能和计算机图像技术的迅速发展及其在医学上的广泛应用，利用智能图像处理技术实现细菌显微图像的识别与计数已成为可能。细菌种类繁多，形状千奇百怪对细菌的显微图像进行快速、准确的识别、分类、统计在医学检验、农业、畜牧业、食品卫生等等领域均有重要的运用价值。但是，在现实生活中，对细菌的检测、分析和研究，目前很多地方仍然采用人工
分类和统计的方法。这种为一法劳动强度大、工作效率低，更关键的是结果受检验人员的个人经验影响，人为因素太多，缺少客观统一的评测标准，不能真实的反映客观现实情况。采用智能图像处理技术是解决这一问题的有效途径。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术采用人工分类和统计的方法劳动强度大、工作效率低，缺少客观统一的评测标准，不能真实的反映客观现实情况。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：传统的方法都不可避免以上问题，关键是存在着较大的误差，很难准确反映自噬水平变化的显著性，不利于精准的科学研究。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：本发明利用透射电镜进行自噬小体和自噬溶酶体的拍片，然后通过图像识别技术进行编程，利用本发明的程序，能够快速检测并反映大量样本的自噬水平的变化情况，且显著性统计更加精确，为全球首创，将会在自噬研究领域被广泛应用。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法。
9.本发明是这样实现的，一种布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法，所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法，布鲁氏菌感染巨噬细胞24h的细胞样品，进行固定、漂洗、脱水、包埋、固化、切片、染色后，用透射电镜进行拍照；对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，使用全局阈值将显微图像进行二值化处理；再对二值化显微图像进行形态学处理；最后统计显微图像中的自噬小体和自噬溶酶体个数。对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，完成图像平滑，去掉显微图像的噪声；使用全局阈值将显微图像进行二值化处理以便从显微图像中，直接提取出自噬小体和自噬溶酶体；再对二值化显微图像进行形态学处理，来提取二值化显微图像中自噬小体和自噬溶酶体的形状；后统计显微图像中的自噬小体和自噬溶酶体个数。
10.进一步，所述将得到布鲁氏菌感染巨噬细胞24h的样品，切片用透射电镜进行拍照；对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，使用全局阈值将显微图像进行二值化处理具体包括：
11.第一步，对透射电镜拍的图片进行识别，获取图片中的巨噬细胞；
12.第二步，对巨噬细胞图像进行底帽变换，去除不均匀背景；
13.第三步，均值滤波处理：对底帽变换后的巨噬细胞图片进行滤波，滤波掩模大小为5*5的矩阵，里面元素为0.04；
14.第四步，中值滤波处理：用指定大小为[55]的窗口对第三步的得到的图像进行中值滤波处理，去除噪声；
[0015]
第五步，二值化处理：调节第四步中值滤波后图像的亮度，使用最大类间方差法找到中值滤波后图像的合适的阈值，利用这个阈值把图像转换为二值图像，然后反转图像的像素强度，使图像中的前景变为背景，背景变为前景。
[0016]
进一步，所述形态学处理具体包括：
[0017]
第一步，创建一个半径为5的平坦型圆盘结构元素，对生成的二值图像执行形态学打开，平滑生成的二值图像的轮廓，减少生成的二值图像狭窄的部分，删除较细的突出，保
持轮廓不变；
[0018]
第二步，填充生成的二值图像的区域和空洞，创建一个半径为5的平坦型圆盘结构元素，对二值图像做形态学腐蚀处理；
[0019]
第三步，按8连通寻找生成的二值图像中的连通区域，获取生成的二值图像区域中的各个区域中像素总个数，得到生成的二值图像所有连通区域的最小外接矩形位置；
[0020]
第四步，对各个区域中像素总个数进行阈值处理，统计被标记的区域的面积分布，显示区域总数；
[0021]
第五步，对每张图像的自噬小体和自噬溶酶体进行单独计数和标注，计算出每组巨噬细胞图像中自噬小体和自噬溶酶体的总数。
[0022]
进一步，所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法还包括：分别培养目标细胞和目标菌株，铺板培养目标细胞24小时后，用培养好的目标菌株进行攻毒；感染24小时后固定细胞，经过漂洗、脱水、包埋、固化、切片、染色步骤。
[0023]
进一步包括：
[0024]
步骤一：巨噬细胞感染试验
[0025]
raw264.7巨噬细胞细胞培养：利用含有10％胎牛血清fbs的完全培养基，37℃，5％co2常规培养raw264.7巨噬细胞，待对数生长期进行传代接种铺板，备用。
[0026]
菌株培养：利用购于美国bd公司的brucella broth液体培养基，振荡培养b.melitensis m5-90株，37℃培养48h，按照1：2000比例进行传代培养，连续传代第三代菌株，用raw264.7巨噬细胞感染试验。
[0027]
b.melitensis m5-90感染raw264.7巨噬细胞：3000rpm离心3min，弃上清，收集b.melitensis m5-90菌体；用2ml生理盐水，清洗菌体沉淀，3000rpm离心3min，弃上清，收集b.melitensis m5-90菌体。利用比浊仪进行比浊，按感染复数(multiplicity of infection，moi)值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h，对照组添加等量的生理盐水。
[0028]
步骤二：透射电镜检测布鲁氏菌介导raw264.7巨噬细胞的自噬小体和自噬溶酶体
[0029]
固定b.melitensis m5-90感染的raw264.7巨噬细胞：按moi值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h后，倒去培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞层3次，加入2ml冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液(ph7.4)，置于4℃冰箱固定30min。刮取细胞层，收集细胞，置于加满冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液，置于冰箱4℃固定过夜。
[0030]
磷酸漂洗液漂洗：2.5％戊二醛固定好的样品，用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗，每次10min，共洗漂洗5次；继续用2％锇酸固定液固定5h；再次利用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗5次，每次10min。
[0031]
脱水：分别用浓度梯度为50％、70％、90％的乙醇、等比例混合的90％和90％丙酮、90％丙酮，在4℃冰箱环境中，浸泡处理细胞样品，分别处理10min、15min、20min、25min、30min；然后，运用100％丙酮，在37℃条件下，浸泡处理细胞样品35min。
[0032]
浸透和包埋：首先配制包埋液：纯丙酮 包埋液(2:1比例)，在37℃条件下，处理5h；弃去包埋液，重复处理，过夜；然后将细胞样品，包埋于新型树脂中。
[0033]
固化：包埋于新型树脂中的样品，置于37℃烘箱内，烘烤过夜；再置于45℃烘箱内，烘烤6h；最后再置于60℃烘箱内，烘烤12h。
[0034]
切片：利用进口的超薄切片机，进行固化树脂的切片，厚度为70nm。
[0035]
双染色：将70nm的切片，用5％醋酸铀-枸橼酸铅，同时进行双染色。
[0036]
拍片：利用进口透射电镜，拍摄放大两万倍的照片。
[0037]
进一步，所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像，进行人工智能识别，方法具体包括以下步骤：
[0038]
(1)采集布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像；
[0039]
(2)对布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体，进行空间域滤波处理；空间滤波器由一个邻域和对邻域所包围图像像素执行的预定义操作组成；滤波产生一个新像素，新像素的坐标等于邻域中心的坐标，像素的值是滤波操作的结果；滤波器的中心访问输入图像中的每个像素后，生成了出了滤波后的图像；空间域滤波增强采用模板处理方法对图像进行滤波，去除图像噪声或增强图像的细节使用大小为m*n的滤波器，对大小为m*n的图像进行空间滤波，由下式表示：
[0040][0041]
其中，m＝2a 1，n＝2b 1，w(s，t)是滤波器系数，f(x，y)是图像值；
[0042]
对待处理的当前像素点(x，y)，选择一个模板，该模板由其近邻的若干像素组成，求模板中所有像素的均值，再把均值赋予当前像素点(x，y)，作为处理后图像在该点上的灰度g(x，y)；
[0043]
g(x，y)＝∑f(x，y)/m；
[0044]
m为该模板中包含当前像素在内的像素总个数；
[0045]
以当前像素为中心的小窗口内的所有像素的灰度按从小到大排序，取排序结果的中间值作为该像素的灰度值；二维中值滤波输出为：
[0046]
g(x，y)＝med{f(x-k，y-i)，(k，i∈w)}；
[0047]
其中，f(x，y)，g(x，y)分别为原始图像和处理后图像，w为二维模板；
[0048]
对布鲁氏菌布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行中值滤波和均值滤波处理，去掉显微图像采集过程中产生的图像噪声；
[0049]
(3)使用全局阈值将布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行二值化处理，使细胞区域和背景区域分开；t为前景与背景的分割阈值，前景点数占图像比例为w0，平均灰度为u0；背景点数占图像比例为w1，平均灰度为u1，图像的总平均灰度为u，前景和背景图象的方差，则有：
[0050]
u＝w0*u0 w1*u1；
[0051]
g＝w0*(u
0-u)2 w1*(u
1-u)2；
[0052]
联立得：
[0053]
g＝w0*w1*(u
0-u1)2；
[0054]
当方差g最大时，此时的灰度t是最佳阈值；
[0055]
(4)对布鲁氏菌布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的二值化显微图像，进行形态学处理，进行布鲁氏菌数目统计；对二值化图像进行边界识别，采用8连通识别，向当前像素点的8个方向分别进行识别，得到布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶
酶体的二值化显微图像的连通域，计算连通域便可得到布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体个数。
[0056]
本发明的另一目的在于提供一种计算机设备，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，使得所述处理器执行所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法的步骤。
[0057]
本发明的另一目的在于提供一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，使得所述处理器执行所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法的步骤。
[0058]
本发明的另一目的在于提供一种实施所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像，人工智能识别方法的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别系统，所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别系统包括：
[0059]
图像预处理模块，用于对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，使用全局阈值将显微图像进行二值化处理；
[0060]
形态学处理模块，用于对二值化显微图像进行形态学处理；
[0061]
结果统计模块，用于统计显微图像中的自噬小体和自噬溶酶体个数。
[0062]
本发明的另一目的在于提供一种所述布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别方法在细胞生物学、免疫学或智能图像处理中的应用。
[0063]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供一种利用智能图像处理技术对布鲁氏菌介导小鼠巨噬细胞自噬后，巨噬细胞中自噬小体和自噬溶酶体个数的计数方法。本发明为首创，将会颠覆传统的自噬分析方法，具有很大的商业价值和潜在的技术革新价值。本发明提供的基于智能图像处理技术对布鲁氏菌介导小鼠巨噬细胞自噬后，巨噬细胞中自噬小体和自噬溶酶体个数的计数方法效率高、正确率高。人工统计的方式劳动强度大、工作效率低，缺少客观统一的评测标准，相比与人工计数的方式，智能图像处理技术能够更快更好地性识别超过1个数量级的照片，更准确地量化细胞自噬的程度。
附图说明
[0064]
图1是本发明实施例提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别方法的流程图。
[0065]
图2是本发明实施例提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别系统的结构示意图；
[0066]
图2中：1、图像预处理模块；2、形态学处理模块；3、结果统计模块。
[0067]
图3是本发明实施例提供的滤波示意图。
[0068]
图4是本发明实施例提供的模糊化示意图。
[0069]
图5是本发明实施例提供的锐化示意图。
[0070]
图6是本发明实施例提供的二值化图。
[0071]
图7是本发明实施例提供的图片统计示意图。
具体实施方式
[0072]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0073]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0074]
如图1所示，本发明提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法包括以下步骤：
[0075]
s101：分别培养目标细胞和目标菌株，铺板培养目标细胞24小时后，用培养好的目标菌株进行攻毒；
[0076]
s102：感染24小时后固定细胞，经过漂洗、脱水、包埋、固化、切片、染色等步骤后，将得到的样品切片用透射电镜进行拍照；
[0077]
s103：对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，使用全局阈值将显微图像进行二值化处理；对二值化显微图像进行形态学处理；
[0078]
s104：最后统计显微图像中的自噬小体和自噬溶酶体个数。
[0079]
本发明提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像，人工智能识别方法业内的普通技术人员，还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬的图像人工智能识别方法仅仅是一个具体实施例而已。本发明的布鲁氏菌菌种由北纳生物购买。
[0080]
如图2所示，本发明提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别系统包括：
[0081]
图像预处理模块1，用于对拍到的显微图像进行空间域滤波处理，使用全局阈值将显微图像进行二值化处理；
[0082]
形态学处理模块2，用于对二值化显微图像进行形态学处理；
[0083]
结果统计模块3，用于统计显微图像中的自噬小体和自噬溶酶体个数。
[0084]
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0085]
本发明提供的布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像人工智能识别方法，首先，对布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行一系列的图像预处理操作，其中包括图像灰度化、空间域滤波、形态学的基本操作、阈值分割等处理，将前景从背景中提取出来；其次，基于细胞形态特征学提取连通区域的特征，对连通区域进行筛选，再通过模板匹配、聚类分析和凹点检测的方法。具体包括以下步骤：(1)采集布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像；(2)对布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行空间域滤波处理，如图3所示；空间滤波器由一个邻域(通常是一个较小的矩形)和对该邻域所包围图像像素执行的预定义操作组成。滤波产生一个新像素，新像素的坐标等于邻域中心的坐标，像素的值是滤波操作的结果。滤波器的中心访问输入图像中的每个像素后，就生成了出了(滤波)后的图像。空间域滤波增强采用模板处理方法对图像进行滤波，去除图像噪声或增强图像的细节一般来说，使用大小为m*n的滤波器，对大小为m*n的图像进行空间滤波，可由下式表示：
[0086][0087]
其中，m＝2a 1，n＝2b 1，w(s，t)是滤波器系数，f(x，y)是图像值。
[0088]
均值滤波是典型的线性滤波算法，其采用的主要方法为邻域平均法。其基本原理是用均值代替原图像中的各个像素值，即对待处理的当前像素点(x，y)，选择一个模板，该模板由其近邻的若干像素组成，求模板中所有像素的均值，再把该均值赋予当前像素点(x，y)，作为处理后图像在该点上的灰度g(x，y)。
[0089]
即：
[0090]
g(x，y)＝∑f(x，y)/m；
[0091]
m为该模板中包含当前像素在内的像素总个数。
[0092]
中值滤波是一种非线性滤波，它能在滤除噪声的同时很好的保持图像边缘.中值滤波的原理：把以当前像素为中心的小窗口内的所有像素的灰度按从小到大排序，取排序结果的中间值作为该像素的灰度值。二维中值滤波输出为：
[0093]
g(x，y)＝med{f(x-k，y-i)，(k，i∈w)}；
[0094]
其中，f(x，y)，g(x，y)分别为原始图像和处理后图像。w为二维模板，通常为3*3，5*5区域，也可以是不同的的形状，如线状，圆形，十字形，圆环形等。
[0095]
对布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行中值滤波和均值滤波处理，去掉显微图像采集过程中产生的图像噪声。为了更好地给布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行分割时，需要减低显微镜图像的噪声，本发明利用滤波器进行模糊化处理和锐化处理，分别图4和图5所示。
[0096]
(3)使用全局阈值将布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的显微图像，进行二值化处理，如图6所示，使细胞区域和背景区域分开。本发明使用的是著名的最大类间方差法计算出最佳的全局阈值。最大类间方差法是1979年由日本学者大津提出的，是一种自适应阈值确定的方法，又叫大津法，简称otsu，是一种基于全局的二值化算法，它是根据图像的灰度特性，将图像分为前景和背景两个部分。当取最佳阈值时，两部分之间的差别应该是最大的，在otsu算法中所采用的衡量差别的标准就是较为常见的最大类间方差。前景和背景之间的类间方差如果越大，就说明构成图像的两个部分之间的差别越大，当部分目标被错分为背景或部分背景被错分为目标，都会导致两部分差别变小，
[0097]
当所取阈值的分割使类间方差最大时就意味着错分概率最小。
[0098]
记t为前景与背景的分割阈值，前景点数占图像比例为w0，平均灰度为u0；背景点数占图像比例为w1，平均灰度为u1，图像的总平均灰度为u，前景和背景图象的方差，则有：
[0099]
u＝w0*u0 w1*u1；
[0100]
g＝w0*(u
0-u)2 w1*(u
1-u)2；
[0101]
联立上面两式可得：
[0102]
g＝w0*w1*(u
0-u1)2；
[0103]
当方差g最大时，可以认为此时前景和背景差异最大，此时的灰度t是最佳阈值。
[0104]
(4)对羊布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的二值化显微图像，进行形态学处理，如图7所示，进行自噬小体和自噬溶酶体数目统计。通常，由于噪声的影响，布
鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的二值化显微图像，在阈值化后所得到边界往往是很不平滑的，二值化显微图像具有一些噪声孔，背景区域上散布着一些小的噪声。连续的开和闭运算可以有效地改善这种情况。开运算的结果是使二值化显微图像边界平滑，去除二值化显微图像中不包含结构信息的对象区域，断开窄小的链接，而保留二值化显微图像中的包含结构元素的对象区域，并且保持其形状和大小均不变。
[0105]
进行开运算后，对二值化图像进行边界识别，便于后续自噬小体和自噬溶酶体数目统计。本发明采用8连通来识别，即向当前像素点的8个方向分别进行识别，得到布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的二值化显微图像的连通域，计算连通域便可得到自噬小体和自噬溶酶体个数。
[0106]
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0107]
1、试验材料：
[0108]
表1试剂
[0109]
[0110]
[0111][0112]
2、试验耗材及仪器：
[0113]
表2耗材
[0114]
耗材名称耗材来源catno.6cm培养皿corning 10cm培养皿corning43016715cm培养皿corning4305991.5ml离心管corning430828过滤器sartorius stedim16533
[0115]
表3仪器
[0116]
[0117][0118]
细胞株：raw264.7为贴壁细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，购自中国科学院细胞库，常规培养使用含10％fbs的dmem(含4.0m ml-glutamine，100u/ml penicillin，100ug/ml streptomycin)中，37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中培养。
[0119]
本试验具体包括以下步骤：
[0120]
步骤一：raw264.7巨噬细胞感染试验
[0121]
1、raw264.7巨噬细胞细胞培养：利用含有10％胎牛血清fbs的完全培养基，37℃，5％co2常规培养raw264.7巨噬细胞，待对数生长期进行传代接种铺板，备用。
[0122]
2、菌株培养：利用购于美国bd公司的brucella broth液体培养基，振荡培养b.melitensis m5-90株，37℃培养48h，按照1：2000比例进行传代培养，连续传代第三代菌株，用raw264.7巨噬细胞感染试验。
[0123]
3、b.melitensis m5-90感染raw264.7巨噬细胞：3000rpm离心3min，弃上清，收集b.melitensis m5-90菌体；用2ml生理盐水，清洗菌体沉淀，3000rpm离心3min，弃上清，收集b.melitensis m5-90菌体。利用比浊仪进行比浊，按感染复数(multiplicity of infection，moi)值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h，对照组添加等量的生理盐水。
[0124]
步骤二：透射电镜检测布鲁氏菌介导raw264.7巨噬细胞的自噬小体和自噬溶酶体
[0125]
1、固定b.melitensis m5-90感染的raw264.7巨噬细胞：按moi值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h后，倒去培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞层3次，加入2ml冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液(ph7.4)，置于4℃冰箱固定30min。刮取细胞层，收集细胞，置于加满冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液，置于冰箱4℃固定过夜。
[0126]
2、磷酸漂洗液漂洗：2.5％戊二醛固定好的样品，用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗，每次10min，共洗漂洗5次；继续用2％锇酸固定液固定5h；再次利用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗5次，每次10min。
[0127]
3、脱水：分别用浓度梯度为50％、70％、90％的乙醇、等比例混合的90％和90％丙
酮、90％丙酮，在4℃冰箱环境中，浸泡处理细胞样品，分别处理10min、15min、20min、25min、30min；然后，运用100％丙酮，在37℃条件下，浸泡处理细胞样品35min。
[0128]
4、浸透和包埋：首先配制包埋液：纯丙酮 包埋液(2:1比例)，在37℃条件下，处理5h；弃去包埋液，重复处理，过夜；然后将细胞样品，包埋于新型树脂中。
[0129]
5、固化：包埋于新型树脂中的样品，置于37℃烘箱内，烘烤过夜；再置于45℃烘箱内，烘烤6h；最后再置于60℃烘箱内，烘烤12h。
[0130]
6、切片：利用进口的超薄切片机，进行固化树脂的切片，厚度为70nm。
[0131]
7、双染色：将70nm的切片，用5％醋酸铀-枸橼酸铅，同时进行双染色。
[0132]
8、拍片：利用进口透射电镜，拍摄放大两万倍的照片。
[0133]
步骤三：布鲁氏菌介导巨噬细胞自噬小体和自噬溶酶体的图像智能识别
[0134]
1、对透射电镜拍的图片进行识别，获取图片中的raw264.7巨噬细胞。
[0135]
2、对巨噬细胞图像进行底帽变换，去除不均匀背景。
[0136]
3、均值滤波处理：对底帽变换后的raw264.7巨噬细胞图片进行滤波，滤波掩模大小为5*5的矩阵，里面元素为0.04。
[0137]
4、中值滤波处理：用指定大小为[55]的窗口对对得到的图像进行中值滤波处理，去除噪声。
[0138]
5、二值化处理：调节值滤波后图像的亮度，使用最大类间方差法找到中值滤波后图像的合适的阈值，利用这个阈值把图像转换为二值图像，然后反转图像的像素强度，使图像中的前景变为背景，背景变为前景。
[0139]
形态学处理：
[0140]
6、创建一个半径为5的平坦型圆盘结构元素，对第五步生成的二值图像执行形态学打开，平滑生成的二值图像的轮廓，减少生成的二值图像狭窄的部分，删除较细的突出，保持轮廓不变。
[0141]
7、填充生成的二值图像的区域和空洞，创建一个半径为5的平坦型圆盘结构元素，对二值图像做形态学腐蚀处理。
[0142]
8、按8连通寻找第七步生成的二值图像中的连通区域，获取生成的二值图像区域中的各个区域中像素总个数，得到生成的二值图像所有连通区域的最小外接矩形位置。
[0143]
9、对各个区域中像素总个数进行阈值处理，统计被标记的区域的面积分布，显示区域总数。
[0144]
10、对每张图像的自噬溶酶体进行单独计数和标注，计算出每组raw264.7巨噬细胞图像中自噬溶酶体的总数。
[0145]
下面结合试验对本发明的技术效果作详细的描述。
[0146]
本试验包括以下步骤：
[0147]
1、raw264.7巨噬细胞细胞培养：利用含有10％胎牛血清fbs的完全培养基，37℃，5％co2常规培养raw264.7巨噬细胞，待对数生长期进行传代接种铺板，备用。
[0148]
2、菌株培养：利用购于美国bd公司的brucella broth液体培养基，振荡培养b.melitensis m5-90株，37℃培养48h，按照1：2000比例进行传代培养，连续传代第三代菌株，用raw264.7巨噬细胞感染试验。
[0149]
3、b.melitensis m5-90感染raw264.7巨噬细胞：3000rpm离心3min，弃上清，收集
b.melitensis m5-90菌体；用2ml生理盐水，清洗菌体沉淀，3000rpm离心3min，弃上清，收集b.melitensis m5-90菌体。利用比浊仪进行比浊，按感染复数(multiplicity of infection，moi)值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h，对照组添加等量的生理盐水。
[0150]
4、主要溶液配制方法
[0151]
(1)10％胎牛血清fbs的完全培养基和不完全培养基：每100ml fbs中添加10ml fbs，完全培养基含有双抗，不完全培养基则不含双抗。
[0152]
(2)0.25％胰酶-0.02％edta，配制量100ml：用电子天平称取0.25g胰酶和0.02g细胞培养级别的edta，加pbs定容至100ml，振荡混匀后，用0.22μm过滤膜过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存。
[0153]
(3)0.1mol/l磷酸缓冲液，运用电子天平称取na2hpo4
·
2h2o 17.81g至容量瓶中，加入双蒸水500ml，磁力搅拌器上充分混匀；再用电子天平称取nah2po4
·
h2o 13.8g至容量瓶中，加入双蒸水500ml，磁力搅拌器上充分混匀。使用时分别将上述溶液40.5ml、9.5ml混合，而成0.2mol/l的磷酸缓冲液，且调整ph值为7.4使用。
[0154]
(4)2.5％戊二醛固定液，配制量200ml：用移液器取50ml的0.2mol/l磷酸缓冲液，加入20ml电镜专用预冷的25％戊二醛储液，加双蒸水定容至200ml，调整ph为7.4备用。
[0155]
5、实验方法
[0156]
5.1细胞培养
[0157]
与1-3相同。
[0158]
5.2菌种培养与感染
[0159]
与1-3相同。
[0160]
5.3透射电镜检测自噬小体和自噬溶酶体
[0161]
本发明将b.melitensis m5-90、生理盐水分别感染raw264.7巨噬细胞24h，经过固定细胞、漂洗、脱水、包埋、固化、切片、染色后，进行透射电镜拍照实验，进行自噬小体和自噬溶酶体的显微成像，细胞的铺板与感染与前述部分一致，透射电镜实验详细操作流程如下：
[0162]
1、固定b.melitensis m5-90感染的raw264.7巨噬细胞：按moi值为100：1，感染对数生长期的raw264.7巨噬细胞24h后，倒去培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞层3次，加入2ml冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液(ph7.4)，置于4℃冰箱固定30min。刮取细胞层，收集细胞，置于加满冰浴中预冷的2.5％戊二醛固定液，置于冰箱4℃固定过夜。
[0163]
2、磷酸漂洗液漂洗：2.5％戊二醛固定好的样品，用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗，每次10min，共洗漂洗5次；继续用2％锇酸固定液固定5h；再次利用0.2mol/l磷酸漂洗液漂洗5次，每次10min。
[0164]
3、脱水：分别用浓度梯度为50％、70％、90％的乙醇、等比例混合的90％和90％丙酮、90％丙酮，在4℃冰箱环境中，浸泡处理细胞样品，分别处理10min、15min、20min、25min、30min；然后，运用100％丙酮，在37℃条件下，浸泡处理细胞样品35min。
[0165]
4、浸透和包埋：首先配制包埋液：纯丙酮 包埋液(2:1比例)，在37℃条件下，处理5h；弃去包埋液，重复处理，过夜；然后将细胞样品，包埋于新型树脂中。
[0166]
5、固化：包埋于新型树脂中的样品，置于37℃烘箱内，烘烤过夜；再置于45℃烘箱
内，烘烤6h；最后再置于60℃烘箱内，烘烤12h。
[0167]
6、切片：利用进口的超薄切片机，进行固化树脂的切片，厚度为70nm。
[0168]
7、双染色：将70nm的切片，用5％醋酸铀-枸橼酸铅，同时进行双染色。
[0169]
8、拍片：利用进口透射电镜，拍摄放大两万倍的照片。
[0170]
本试验生成数据如下：
[0171]
[0172][0173]
应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、cd或dvd-rom的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。
[0174]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。