一种用于动物模型中诱导癌症的组合物及其用途的制作方法

1.本发明属于生命科学技术领域，涉及一种组合物及其用途。


背景技术：

2.目前人类对疾病的认识是随社会发展和科技进步不断提高的，当前许多重大疾病和慢性病几乎都难以治愈，其中大部分疾病只能维持、缓解，控制缓慢发展，从全球来看，癌症、心脑血管疾病、糖尿病等是除传染性疾病以外致死率最高也是最常见的疾病，医药、科研人员都在积极努力突破现有技术，期待早日实现完全彻底解决这些危及人类生命的重大疾病和慢性病。近百年来，虽然对各种疾病的研究和认识不断提高，但主要的关键问题还是没有解决，找不到病因，只能对症治疗，如果从病因学方面入手就会很快得以解决，只有明确疾病的发病机制，才能有效治愈疾病。癌症、心脑血管疾病、糖尿病是世界发病率最高的常见病，这样大的发病概率我们应该能找出规律突破病因，为药物筛选和临床研究奠定基础。
3.为了满足药物筛选和临床的需要，采用准确的完全模拟人类在正常饮食生活习惯中制作的动物疾病模型是决定药物筛选的成败关键所在，同时对人类预防和治愈这些疾病发挥重要作用。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种组合物及其用途，本发明的组合物可以制作成模拟人的多种疾病的动物模型，从而用于预防、治疗人类疾病和筛选药物。本发明的组合物由糖和酸/糖、酸和醇组成，模型动物不限于哺乳动物，本发明的组合物对于糖尿病、癌症、心脑血管疾病、肾病、肝病等人类多种疾病预防和治疗具有重大价值。
5.本发明是通过如下技术方案来实现的。
6.一方面，本发明提供一种组合物，该组合物由糖和酸组成。
7.优选地，所述糖是多羟基(2个或以上)的醛类(aldehyde)或酮类(ketone) 化合物，由碳、氢、氧三种元素构成，优选为葡萄糖。
8.优选地，所述酸为有机酸或无机酸。
9.优选地，所述酸为85％(质量百分浓度)磷酸、37％(质量百分浓度盐酸、99.5％(质量百分浓度)乙酸或85％(质量百分浓度)乳酸。
10.优选地，所述糖与酸之间的质量体积比为1:100-100:1(g/ml)，优选为 1:20-20:1(g/ml)，更优选为1:0.375(g/ml)或5:1(g/ml)。
11.优选地，所述组合物的ph值低于4，优选低于3.22；
12.优选地，所述组合物为食物组合物。
13.在一个具体的实施方案中，所述组合物为：1g葡萄糖 0.375ml盐酸(37％ (质量百分浓度))；
14.50％(质量百分浓度)葡萄糖注射液与乙酸(99.5％(质量百分浓度)) 混合液(体
积比10:1)；
15.50％葡萄糖注射液与乙酸(99.5％(质量百分浓度))混合液(体积比 20:1)；
16.50％葡萄糖注射液与乳酸(85％(质量百分浓度))混合液(体积比10:1)；
17.50％葡萄糖注射液与磷酸(85％(质量百分浓度))混合液(体积比10:1)。优选地，所述组合物还包括醇，即所述组合物由糖、酸与醇组成。
18.优选地，所述醇为乙醇。
19.优选地，所述糖、酸与醇之间的比例为1:100:1-100:1:100(g/ml/ml)，优选为1:20:1-20:1:20(g/ml/ml)，更优选为10:5:5(g/ml/ml)。
20.优选地，所述组合物为食物组合物，在本技术中，所述食物组合物是模拟自然人在正常饮食中所摄入的食物。
21.另一方面，本发明提供一种上述组合物的制备方法，该制备方法包括将糖和酸；或者糖、酸和醇以前述的配方比例进行混合，即可。
22.再一方面，本发明提供上述组合物在制备动物模型中的用途，例如所述组合物可以诱导癌症(例如肺癌)产生，从而作为制备癌症模型的诱导剂。
23.优选地，所述动物模型中使用的模型动物包括但不限于哺乳动物，如：小鼠、大鼠、兔、狗、猴、猫、鸡、猪等。
24.优选地，所述动物模型通过将所述组合物饲喂、灌胃、静脉滴注、静脉注射或皮肤渗透等多种途径施用于所述模型动物。
25.优选地，所述动物模型包括但不限于糖尿病、各种癌症、动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病及其它疾病的动物模型。
26.优选地，所述动物模型用于预防和/或治疗癌症、糖尿病、动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病及其它疾病的药物筛选。
27.又一方面，本发明提供酸在制备动物模型中的用途，例如所述酸可以诱导癌症(例如肺癌)产生，从而作为制备癌症模型的诱导剂。
28.优选地，所述酸为无机酸(例如盐酸)或有机酸；
29.优选地，所述酸为13.88％(质量百分浓度)盐酸、7.73％(质量百分浓度)乳酸、4.74-9.05％(质量百分浓度)乙酸、7.73％(质量百分浓度)磷酸；
30.优选地，所述酸的ph值低于3.22。
31.在一个具体的实施方案中，所述酸为：
32.生理盐水与浓盐酸(37％(质量百分浓度))混合液(体积比5：3)；
33.生理盐水与乙酸(99.5％(质量百分浓度))混合液(体积比10：1)；
34.生理盐水与乳酸(85％(质量百分浓度))混合液(体积比10：1)；
35.生理盐水与磷酸(85％(质量百分浓度))混合液(体积比10：1)；
36.生理盐水(10ml)与乙酸(99.5％(质量百分浓度))(1ml)混合液；
37.生理盐水(10ml)与乙酸(99.5％(质量百分浓度))(0.5ml)混合液；
38.生理盐水(10ml)与乳酸(85％(质量百分浓度))(1ml)混合液；
39.生理盐水(10ml)与磷酸(85％(质量百分浓度))(1ml)混合液；
40.生理盐水(2.5ml)与盐酸(37％(质量百分浓度))(1.5ml)混合液。
41.优选地，所述动物模型中使用的模型动物包括但不限于哺乳动物，如：小鼠、大鼠、
兔、狗、猴、猫、鸡、猪等；
42.优选地，所述动物模型通过将所述组合物饲喂、灌胃、静脉滴注、静脉注射或皮肤渗透等多种途径施用于所述模型动物；
43.优选地，所述动物模型包括但不限于糖尿病、各种癌症、动脉粥样硬化和其导致的心脑血管疾病及其它疾病的动物模型。
44.优选地，所述动物模型用于预防和/或治疗癌症、糖尿病、动脉粥样硬化和其导致的心脑血管疾病及其它疾病的药物筛选。
45.与现有技术相比较，本发明具有如下有益的技术效果：
46.(1)本发明的组合物应用于制备动物模型，为人类预防、治疗重大疾病提供理论依据。
47.(2)本发明完全模拟人类正常饮食生活习惯制作的动物疾病模型，无需其它化学物质，适用制作多种人类疾病的动物模型。
48.(3)本发明组合物是筛选人和/或动物用药物的精准动物模型。
49.当前，国内外研究已经证明炎症会诱发癌症。在本发明中，所述糖与酸是所有动物生命体存在所必须的，不可否认的是两者进入体内后除机体正常代谢需要外，有部分还会形成醛类化合物附着在细胞外膜，当组织出现炎症时，附着在细胞外膜的醛类化合物达到阈值时就会使炎症点位细胞坏死，坏死后的醛类化合物形成堆积，更加剧细胞坏死及浸润正常组织细胞，逐渐形成坏死点、结节、小肿块、肿瘤。在本发明中可见穿刺点都见炎症，癌变处也见不同程度坏死，与注入的液体导致刺激性坏死不同，多个模型病理图片可见注入的液体在组织间快速坏死、水肿、纤维组织增生、伴癌、至癌组织形成，癌变处也见不同程度坏死在癌组织形成时是可见的，并非注射液体形成刺激性坏死，从液体注入至癌组织形成这个过程一般在96小时完成，而后肿瘤组织继续生长。因此，本发明在穿刺和注射进入体内的多种酸和糖酸混合物共同作用下，实现了大鼠和兔肺癌动物模型，众所周知，炎症可以出现在机体多个组织，多种酸及糖酸混合物摄入后通过循环系统也会进入机体各个组织，所以，这种模型并非限于单独的肺癌动物模型，也是其它各种癌症动物模型的制作通用方法，也就是说本发明所述各种酸及糖酸混合物可以制作全部癌症动物模型包括白血病。
50.除制作癌症动物模型外也可以制作人类其它多种疾病动物模型，因为醛类化合物在体内长期蓄积会使细胞膜通透性降低，跨膜阻抗增大，影响各种细胞正常代谢，导致不同组织病变，例如：附着在血细胞外膜，血细胞坏死后就会沉积形成血栓、心脑血管疾病，附着在胰腺胰岛β细胞外膜，会使胰岛素分泌障碍，导致糖尿病。因此，有机酸和无机酸单独或与葡萄糖组合物可以制作多种人类疾病的动物模型。
附图说明
51.图1：实验例1中对照组1病理染色结果(10
×
10)；实验为14d后取材，各大鼠肺组织病理学结果，其中，1：未见癌、轻度炎症；2：未见癌、出血； 3：未见癌、轻度炎症；4：未见癌、轻度炎症；5：未见癌、轻度炎症；6：未见癌、轻度炎症；
52.图2：实验例1中对照组2病理染色结果(10
×
10)；实验方案原预计第 14d取材，大鼠注射后状态不佳，其中第6只提前死亡，预期次配方不能在大鼠健康情况下稳定诱导肺部癌变，随提前至36h取材，结束实验，以下为本组大鼠病理分析结果：1：可疑癌；2：未见癌；3：
未见癌；4：未见癌；5：未见癌；
53.图3：实验例1中实验组1病理染色结果(10
×
10)；诱导剂注射96h(4d) 后病理分析结果为：1：腺癌，癌腺体少；2：腺癌，穿刺点在肺尖处；3：腺癌，癌腺体少；4：腺癌，癌腺体多；5：腺癌，癌腺体多；6：腺癌，穿刺点浅，肺膜下癌；
54.图4实验例1中实验组2病理染色结果(10
×
10)；诱导剂注射168h(7d) 后病理分析结果：1：腺癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：可疑腺癌，穿刺点直径约3毫米；6：腺癌；
55.图5实验例1中实验组3病理染色结果(10
×
10)；诱导剂注射336h(14d) 后病理分析结果：1：腺癌，肉芽肿性炎症；2：未见癌，肉芽肿性炎症，穿刺点表浅；3：未见癌，穿刺点2毫米；4：未见癌，未见穿刺点；5：腺癌，轻度炎症；6：腺癌，未见明确穿刺点，肺内出血严重，肺膜下癌；
56.图6实验例2中试验组1病理染色结果(10
×
10)；实验为14d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌，中度炎症；2：未见癌，轻度炎症； 3：未见癌，轻度炎症；4：未见癌，轻度炎症；5：未见癌，轻度炎症；
57.图7实验例2中试验组2病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌；
58.图8实验例2中试验组3病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：大约12小时死亡未及时取材；2：腺癌；3：腺癌；4：未见癌，穿刺点周围见肺泡上皮不典型增生；5：腺癌；
59.图9实验例2中试验组4病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：未见癌，支气管腔内炎性分泌物，重度炎症；
60.图10实验例2中试验组5病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌，肿瘤坏死伴多核巨细胞反应； 3：未见癌，重度炎症；4：未见癌，轻度炎症未见明确穿刺点；5：腺癌，见肿瘤细胞坏死；
61.图11实验例2中试验组6病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：未见癌，未见穿刺点；3：腺癌；4：大约16小时死亡未及时取材；5：腺癌；
62.图12实验例2中试验组7病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌，穿刺点明确(46小时死亡)；2：未见癌，轻度炎症；3:腺癌；4：腺癌；5：腺癌；
63.图13实验例2中试验组8病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌轻度炎症，未见明确穿刺点；2：腺癌；3：腺癌，局灶见肺泡上皮不典型增生；4：未见癌，局灶见肺泡上皮不点型增生；5：腺癌；
64.图14实验例2中试验组9病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：腺癌；2：腺癌，膈肌萎缩，纤维组织增生； 3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌；
65.图15实验例2中试验组10病理染色结果(10
×
10)；实验为7d后取材，各肺组织病理学检测如下：1：未见癌；2：腺癌；3：腺癌；4：腺癌；5：腺癌，见肿瘤坏死。
66.具体实施例方式
67.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
68.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
69.以下实施例中实验材料、来源如下：
70.葡萄糖：(≥99.5％)，国药集团化学试剂有限公司、批号：20140821。
71.乙酸：(≥99.5％)，国药集团化学试剂有限公司、批号：20160920。
72.乙醇：(≥95％)，国药集团化学试剂有限公司、批号：20200810。
73.实施例1本发明的组合物
74.配方：葡萄糖10g乙酸1ml；
75.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸ml混合均匀后备用。
76.实施例2本发明的组合物
77.配方：葡萄糖10g乙酸2ml；
78.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸2ml混合均匀后备用。
79.实施例3本发明的组合物
80.配方：葡萄糖10g乙酸3ml；
81.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸3ml混合均匀后备用。
82.实施例4本发明的组合物
83.配方：葡萄糖10g乙酸4ml；
84.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸4ml混合均匀后备用。
85.实施例5本发明的组合物
86.配方：葡萄糖10g乙酸5ml；
87.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸5ml混合均匀后备用。
88.实施例6本发明的组合物
89.配方：葡萄糖10g乙酸6ml；
90.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸6ml混合均匀后备用。
91.实施例7本发明的组合物
92.配方：葡萄糖10g乙酸7ml；
93.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸7ml混合均匀后备用。
94.实施例8本发明的组合物
95.配方：葡萄糖10g乙酸8ml；
96.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸8ml混合均匀后备用。
97.实施例9本发明的组合物
98.配方：葡萄糖10g乙酸9ml；
99.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸9ml混合均匀后备用。
100.实施例10本发明的组合物
101.配方：葡萄糖10g乙酸10ml；
102.制备方法：将配方葡萄糖10g乙酸10ml混合均匀后备用。
103.实施例11本发明的组合物
104.配方：葡萄糖10g、乙酸1ml、乙醇1ml
105.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸1ml、乙醇1ml混合均匀后备用。
106.实施例12本发明的组合物
107.配方：葡萄糖10g、乙酸2ml、乙醇2ml
108.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸2ml、乙醇2ml混合均匀后备用。
109.实施例13本发明的组合物
110.配方：葡萄糖10g、乙酸3ml、乙醇3ml
111.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸3ml、乙醇3ml混合均匀后备用。
112.实施例14本发明的组合物
113.配方：葡萄糖10g、乙酸4ml、乙醇4ml
114.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸4ml、乙醇4ml混合均匀后备用。
115.实施例15本发明的组合物
116.配方：葡萄糖10g、乙酸5ml、乙醇5ml
117.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸5ml、乙醇5ml混合均匀后备用。
118.实施例16本发明的组合物
119.配方：葡萄糖10g、乙酸6ml、乙醇6ml
120.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸6ml、乙醇6ml混合均匀后备用。
121.实施例17本发明的组合物
122.配方：葡萄糖10g、乙酸7ml、乙醇7ml
123.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸7ml、乙醇7ml混合均匀后备用。
124.实施例18本发明的组合物
125.配方：葡萄糖10g、乙酸8ml、乙醇8ml
126.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸8ml、乙醇8ml混合均匀后备用。
127.实施例19本发明的组合物
128.配方：葡萄糖10g、乙酸9ml、乙醇9ml
129.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸9ml、乙醇9ml混合均匀后备用。
130.实施例20本发明的组合物
131.配方：葡萄糖10g、乙酸10ml、乙醇10ml
132.制备方法：将葡萄糖10g、乙酸10ml、乙醇10ml混合均匀后备用。
133.实验例1本发明的组合物诱导大鼠形成肺癌的研究
134.1.实验目的：
135.试验并验证本发明的组合物不同时间点在大鼠模型上诱导形成肺部癌变的情况。
136.2.材料与方法
137.2.1实验材料与试剂
138.2.1.1主要实验试剂：
[0139][0140]
2.1.2主要实验设备：
[0141][0142][0143]
2.2实验动物
[0144]
种属&品系：sd大鼠；
[0145]
动物等级：spf级；
[0146]
性别：雄性；
[0147]
实验动物来源：辽宁长生生物技术股份有限公司；
[0148]
日龄或体重：200g
±
20g；
[0149]
数量：30只；
[0150]
2.3实验方法
[0151]
2.3.1实验动物饲养：
[0152]
饲养室温度18-22℃，湿度40-70％，换气次数不少于20次/h，每笼饲养不超过6只，光照12小时明暗交替。动物给予合格的鼠料，动物均自由摄食。动物给予纯化水，用饮水瓶供应，自由摄水。
[0153]
2.3.2诱导注射：
[0154]
实验动物分组及给药情况如下：
[0155]
采用随机分组法，根据体重将动物分为5组，每组6只动物。各组动物给予诱导剂情况及剂量如下表：
[0156][0157][0158]
注：上表中诱导剂制备方法为：1g葡萄糖加入到0.375ml盐酸中，低温加热搅拌至无色透明状黏稠性液体。
[0159]
异氟烷将大鼠麻醉，在大鼠的左侧腋窝剃毛备皮，碘伏消毒，用微量注射器吸取50μl造模药物，大鼠侧卧，左侧向上，左前肢自然弯曲，在大鼠左前肢肘关节侧后方的肋骨之间与水平面夹角为45
°
进针，深度为1cm，即可进入肺部，注射50μl造模药物，分别在不同时间点检测肺癌模型形成情况。
[0160]
2.3.3病理检测：
[0161]
静脉注射水合氯醛，麻醉处死大鼠，剖开胸腔，根据肺给药部位，观察给药部位病变，并取材固定，经程序化脱水、包埋、切片、摊片、烤片，入二甲苯中脱蜡5分钟
×
3次，100％乙醇2分钟
×
2次，自来水冲洗2分钟，苏木素染色3分钟，自来水2分钟，1％盐酸酒精溶液分化2秒，自来水冲洗2分钟，返兰液1秒，自来水2分钟，伊红染色10秒，50％乙醇脱水10 秒，70％乙醇脱水10秒，无水乙醇1分钟
×
2次，二甲苯中透明3分钟
×
2 次，中性树胶封片。显微镜拍照，阅片。
[0162]
2.4实验结果
[0163]
各实验组he病理染色结果如图1-至图5。
[0164]
3结论
[0165]
由本研究可知，对照组1葡萄糖和生理盐水未能诱导癌变，对照组2生理盐水和盐酸毒性较强、短时间内未见明确诱导癌变，而诱导剂在优化配比之后，实验组在第4d即检测出注射区域出现癌变，且7d及14d病理检测进一步证实了诱导剂诱导大鼠肺部出现腺癌癌变的效果。证明该种方式配制的诱导剂可在短期内诱导大鼠肺部癌变。
[0166]
实验例2本发明的组合物诱导兔肺组织形成癌变的研究
[0167]
1.实验目的：
[0168]
试验并验证本发明的组合物不同时间点、在实验兔模型上诱导形成肺部癌变的情况。
[0169]
2.材料与方法
[0170]
2.1实验材料与试剂
[0171]
2.1.1主要实验试剂：
[0172][0173]
2.1.2主要实验设备：
[0174][0175][0176]
2.2实验动物
[0177]
种属&品系：新西兰白兔；
[0178]
动物等级：spf级；
[0179]
性别：雄性；
[0180]
实验动物来源：中国食品药品检定研究院；
[0181]
日龄或体重：1.8～2.2kg；
[0182]
数量：50只；
[0183]
2.3实验方法
[0184]
2.3.1实验动物饲养：
[0185]
饲养室温度18-22℃，湿度40-70％，换气次数不少于20次/h，每笼饲养不超过2只，光照12小时明暗交替。动物给予合格的饲料，动物均自由摄食。动物给予纯化水，用饮水瓶供应，自由摄水。
[0186]
2.3.2诱导注射:
[0187]
模型制备方法如下：采用随机分组法，根据体重将动物分为10组，每组5只动物。各组动物给予诱导剂情况及剂量如下表：
[0188]
[0189][0190]
将实验兔侧卧保定，左侧向上，在左侧腋窝剃毛备皮，碘伏消毒，从肋骨下缘向前数其肋骨，在第7-8肋骨之间，距离脊柱2指宽的位置进针，1ml 注射器吸取造模药物300ul，进针深度为注射器针头的全部，约2.5cm，即可将药物注射入肺部。
[0191]
2.3.3病理检测：
[0192]
静脉注射水合氯醛，麻醉处死实验兔，剖开胸腔，根据肺给药部位，观察给药部位病变，并取材固定，经程序化脱水、包埋、切片、摊片、烤片，入二甲苯中脱蜡5分钟
×
3次，100％乙醇2分钟
×
2次，自来水冲洗2分钟，苏木素染色3分钟，自来水2分钟，1％盐酸酒精溶液分化2秒，自来水冲洗2分钟，返兰液1秒，自来水2分钟，伊红染色10秒，50％乙醇脱水10 秒，70％乙醇脱水10秒，无水乙醇1分钟
×
2次，二甲苯中透明3分钟
×
2 次，中性树胶封片。显微镜拍照，阅片。
[0193]
2.4实验结果
[0194]
各实验组he病理染色结果如图6至图15。
[0195]
3结论
[0196]
由本研究可知，除实验组1对照组外，其余各组组方均可以在7d内诱导出癌变，更进一步的兼顾安全性及诱导效率，实验组2组方(生理盐水与浓盐酸混合液(体积比5:3))及实验组9组方(50％葡萄糖注射液与乳酸混合液(体积比10:1))最优。组方中加入葡萄糖可有效降低局部的急性刺激程度，减少实验动物死亡。