一种利用海藻提取液促进决明子种子萌发及生长的方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种促进决明子种子萌发的方法；具体的是，涉及一种利用海藻提取液促进决明子种子萌发及生长的方法。


背景技术：

2.决明子作为常用中药，味甘、咸、苦，微寒；有清热明目、润肠通便等功效，用于目赤涩痛，羞明多泪，头痛眩晕，目暗不明，大便秘结；现代医学研究表明决明子具有降压、调脂、保肝和改善肾功能等功效，是中医药治疗心脑血管疾病、高脂血症、便秘的代表性药物；近年来，随着人们对决明子的化学成分、药理作用和临床作用等方面的深入研究，决明子在医药和食品领域中得到广泛应用。促进种子萌发方法包括采用植物生长调节剂如赤霉素(ga3)、吲哚乙酸(iaa)、萘乙酸(naa)、6-苄基腺嘌呤(6-ba)、激动素(kt)等；环境因子如温度、盐度促进种子萌发。
3.大型海藻富含多种化合物，如蛋白质、脂质、植物激素、碳水化合物、氨基酸、渗透保护剂、抗菌化合物和矿物质；由于有机农业和有机食品的需求极大的刺激了海藻提取物在农业上的应用；如促进种子萌发，增强植物的健康和生长，改善水分和养分的吸收，抗冻和耐盐，生物防治和抵抗植物病原生物，污染土壤中污染物的修复和施肥等作用。
4.我国最新发布相关政策中制定了食品中548种农药的最大残留限量，其中28种为植物生长调节剂，共占了我国已经登记注册的植物生长调节剂的50％以上。在作物种植过程中植物生长调节剂使用频繁，长期不合理使用加上部分植物生长调节剂降解慢、易残留的特性，必然导致植物生长调节剂的残留。目前关于作物中植物生长调节剂的残留状况已有较多报道，其中多效唑的检出率普遍较高。而海藻提取液作为一种新型绿色多功能生物肥料，能够减少化肥农药的使用及残留，同时为石莼及绿潮暴发种浒苔的进一步开发和利用提供新途径。
5.海藻提取物可作为一种安全、有潜力的多功能农业生物肥料，使用海藻提取液作为生物肥料可能有助于减轻主要营养缺乏的不利影响，减少化肥的使用；同时为绿潮暴发种浒苔的进一步开发和利用提供新途径。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的是提供了一种利用海藻提取液促进决明子种子萌发及生长的方法；海藻提取物可作为一种安全、有潜力的多功能农业生物肥料，使用海藻提取液作为生物肥料可能有助于减轻主要营养缺乏的不利影响，减少化肥的使用；同时为绿潮暴发种浒苔的进一步开发和利用提供新途径。
7.技术方案：本发明所述的一种利用海藻提取液促进决明子种子萌发及生长的方法，利用海藻提取液促进决明子种子萌发，其具体操作步骤如下：
8.步骤(1)、原材料的准备；以海藻(浒苔、石莼)为供体植物材料，以决明子种子为生测材料，备用；
9.步骤(2)、制备海藻提取液，将采集的海藻采用物理方法破碎藻体提取海藻提取液，具体的是：将采集的海藻用清水冲洗干净，再用纯水清洗3次，置于70℃烘箱干燥至恒重，将干燥完成的海藻于破壁机打碎成粉末状，为海藻粉；将海藻粉100g加入50％乙醇1000ml,使用超声波清洗机超声提取2h,4℃放置24h；于高速离心机4250rpm离心15分钟，取上清液用whatman 1号滤纸过滤；下层粉末残渣按上述方法提取一次，合并两次提取滤液；将滤液于旋转蒸发仪蒸发至100ml，得到1g/ml海藻提取液，再依次梯度稀释得到0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml海藻提取液，于4℃冷藏，备用；
10.步骤(3)、种子萌发实验，其操作方法是：
11.挑选决明子种子，4％次氯酸钠破除休眠，浸泡于提取的海藻提取液中；
12.具体的：挑选饱满、健康的决明子种子，用4％次氯酸钠浸泡消毒10min，再用纯水清洗3-4次；将清洗过的种子分别加入四种浓度海藻提取液，及纯水作对照组浸泡24h，以淹没种子5cm为准，之后用纯水清洗干净；将处理好决明子种子至于垫两层滤纸的培养皿中，培养皿提前清洗、于高压灭菌锅灭菌、烘箱烘干；每培养皿种子100粒，分别加入0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml海藻提取液、纯水，每个处理3个重复；之后每天视蒸发量分别补充适当体积的海藻提取液和纯水，每三天换滤纸；培养条件为昼夜温度25℃/20℃，光周期14h/10h,光强100μmol photons m-2
s-1
.；
13.每天固定时间记录种子发芽情况，以连续48h种子发芽粒数不再增加视为种子萌发实验结束；测定发芽势、发芽指数、活力指数、发芽率；相关计算公式如下：
14.发芽势：初次记录时间内发芽的种子数占供试种子数的百分率；
15.发芽指数＝∑(g
t
/d
t
)，其中：g
t
为t时间内的发芽数，d
t
为相应的发芽日数；
16.活力指数＝发芽指数
×
单株重(g)；
17.发芽率(％)＝发芽个数
÷
接种个数
×
100；
18.步骤(4)、决明子幼苗生长实验，将海藻提取液浸泡过的决明子种子种于育苗盘，每天浇灌2次，试验开始两周后，每个处理选取长势一致的决明子幼苗进行叶绿素、株高、根长的测定，具体的是；
19.在决明子于对于海藻提取液浸泡24h种于育苗盘，每天浇灌2次，每株10ml，每个处理设置3个重复，每个重复为3个穴盘，随机排列；试验开始两周后，每个处理选取10株长势一致的决明子幼苗进行各项指标的测定；
20.chla(mg/g fw)＝13.95*od
665-6.88*od
649
；
21.chlb(mg/g fw)＝24.96*od
649-7.32*od
665
；
22.株高(cm)：直尺测量从露地到幼苗直立时幼苗顶部到根部的距离；
23.主根长(cm)：游标卡尺测量根茎到主根根尖的距离步骤；
24.(5)、数据统计与分析；所有数据用excel进行整理和初步分析；运用spss进行单因素anova方差分析和lsd多重比较以及沃勒-邓肯检验，并使用origin绘制柱状图。
25.有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点：1、海藻提取液是一种安全、有潜力的多功能农业生物肥料；2、绿潮、金潮等大型藻华暴发为制备海藻提取液提供充足的原材料；3、为绿潮暴发种浒苔的进一步开发和利用提供新途径；4、制备海藻提取液成本较低、可以短时间制备大量海藻提取液；5、相较于化肥农药使用，海藻提取液绿色无残留。
附图说明
26.图1是本发明的制备流程图；
27.图2是本发明实施例中不同海藻提取液对决明子植株叶片chla的影响对比图；
28.图3是本发明实施例中不同浓度海藻提取液对决明子植株叶片chlb的影响对比图；
29.图4是本发明实施例中不同浓度海藻提取液对决明子植株株高的影响对比图；
30.图5是本发明实施例中不同浓度海藻提取液对决明子植株根长的影响对比图。
具体实施方式
31.下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
32.本发明所述的一种利用海藻提取液促进决明子种子萌发及生长的方法，利用海藻提取液促进决明子种子萌发，其具体操作步骤如下：
33.步骤(1)、原材料的准备；以海藻(浒苔、石莼)为供体植物材料，以决明子种子为生测材料，备用；
34.步骤(2)、制备海藻提取液，将采集的海藻采用物理方法破碎藻体提取海藻提取液，具体的是：将采集的海藻用清水冲洗干净，再用纯水清洗3次，置于70℃烘箱干燥至恒重，将干燥完成的海藻于破壁机打碎成粉末状，为海藻粉；将海藻粉100g加入50％乙醇1000ml,使用超声波清洗机超声提取2h,4℃放置24h；于高速离心机4250rpm离心15分钟，取上清液用whatman 1号滤纸过滤；下层粉末残渣按上述方法提取一次，合并两次提取滤液；将滤液于旋转蒸发仪蒸发至100ml，得到1g/ml海藻提取液，再依次梯度稀释得到0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml海藻提取液，于4℃冷藏，备用；
35.步骤(3)、种子萌发实验，其操作方法是：
36.挑选决明子种子，4％次氯酸钠破除休眠，浸泡于提取的海藻提取液中。
37.具体的：挑选饱满、健康的决明子种子，用4％次氯酸钠浸泡消毒10min，再用纯水清洗3-4次；将清洗过的种子分别加入四种浓度海藻提取液，及纯水作对照组浸泡24h，以淹没种子5cm为准，之后用纯水清洗干净；将处理好决明子种子至于垫两层滤纸的培养皿中，培养皿提前清洗、于高压灭菌锅灭菌、烘箱烘干；每培养皿种子100粒，分别加入0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml海藻提取液、纯水，每个处理3个重复；之后每天视蒸发量分别补充适当体积的海藻提取液和纯水，每三天换滤纸；培养条件为昼夜温度25℃/20℃，光周期14h/10h,光强100μmol photons m-2
s-1
.；
38.每天固定时间记录种子发芽情况，以连续48h种子发芽粒数不再增加视为种子萌发实验结束；测定发芽势、发芽指数、活力指数、发芽率；相关计算公式如下：
39.发芽势：初次记录时间内发芽的种子数占供试种子数的百分率；
40.发芽指数＝∑(g
t
/d
t
)，其中：g
t
为t时间内的发芽数，d
t
为相应的发芽日数；
41.活力指数＝发芽指数
×
单株重(g)；
42.发芽率(％)＝发芽个数
÷
接种个数
×
100；
43.步骤(4)、决明子幼苗生长实验，将海藻提取液浸泡过的决明子种子种于育苗盘，每天浇灌2次，试验开始两周后，每个处理选取长势一致的决明子幼苗进行叶绿素、株高、根长的测定，具体的是；
44.在决明子于对于海藻提取液浸泡24h种于育苗盘，每天浇灌2次，每株10ml，每个处理设置3个重复，每个重复为3个穴盘，随机排列；试验开始两周后，每个处理选取10株长势一致的决明子幼苗进行各项指标的测定；
45.chla(mg/g fw)＝13.95*od
665-6.88*od
649
；
46.chlb(mg/g fw)＝24.96*od
649-7.32*od
665
；
47.株高(cm)：直尺测量从露地到幼苗直立时幼苗顶部到根部的距离；
48.主根长(cm)：游标卡尺测量根茎到主根根尖的距离步骤；
49.(5)、数据统计与分析；所有数据用excel进行整理和初步分析；运用spss进行单因素anova方差分析和lsd多重比较以及沃勒-邓肯检验，并使用origin绘制柱状图；如表1及表2所示，
50.表1不同浓度海藻提取液ph、电导率测量结果
[0051][0052]
海藻提取液的ph大部分较低于对照组，随着海藻提取液的浓度倍数增加，电导率也呈现明显的倍数关系，其中任意浓度海藻提取液电导率均大于对照组。
[0053]
表2不同浓度海藻提取液对决明子种子萌发的影响
[0054][0055][0056]
相较于对照组而言，除了0.4％石莼提取液无显著差异外，其他不同浓度海藻提取液均能提高决明子种子发芽势；不同浓度浒苔提取液较于对照组均能提到决明子种子发芽指数，0.05％石莼提取液显著提高决明子发芽指数，0.1％、0.2％、0.4％相较于对照组无显著差异；总而言之，浒苔提取液促进决明子种子萌发效果较优于石莼提取液，其中0.05％浒苔提取液促进决明子萌发效果最好。
[0057]
具体实施例如图2-3所示，由图2，图3可以看出，与清水对照组相比，施用海藻提取液浇灌决明子幼苗，可以有效促进叶绿素含量的生成，随着海藻提取液浓度的增高，呈现先增长后降低的趋势，且0.05％、0.1％浒苔提取液、0.1％、0.2％石莼提取液与对照组相比，chla含量分别增长128.10％、98.53％，248.12％、183.49％，chlb含量分别增长79.72％、200.83％、127.87％、91.67％，呈及显著相关关系。
[0058]
由图4可以看出，与对照组相比，施用海藻提取液株高较大于对照组，但大部分无显著差异，其中0.05％浒苔提取液、0.1％、0.2％、石莼提取液较对照组相比，株高分别增加25.8％，14.49％，19.14％，呈显著差异。
[0059]
由图5可以看出，与对照组相比，施用海藻提取液在根系生长，从根长看0.05％浒苔提取液有显著增加，其他浓度海藻提取液均无显著差异。
[0060]
结合决明子种子萌发试验及幼苗生长试验可以看出，浒苔提取液和石莼提取液对决明子种子萌发及幼苗生长有一定的促进作用，其中较合适的施用海藻提取液浓度范围在0.05％-0.2％之间。
[0061]
本发明的创新点：1、制备海藻提取液除物理破碎外，仅需50％乙醇提取，工艺简单；2、海藻提取液对决明子种子影响，结合萌发指数、生长指数，最佳施用浓度在0.05％-0.2％；3、为绿潮暴发种浒苔的进一步开发和利用提供新途径；4、海藻提取液作为促进种子萌发方法可以减少化肥农药的使用。
[0062]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护
范围。