一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法。


背景技术：

2.由病原微生物引起的疾病是世界范围内发病率和死亡率都较高的疾病，每年造成数百万次感染，给社会经济发展造成重大障碍。人类感染细菌后，可引起菌血症、脑膜炎等相关疾病。因此，开发致病菌的快速筛查方法是必要的。近年来基于免疫学和分子生物学的病原微生物检测方法快速发展，但分别存在一定的缺陷，如抗体成本昂贵，存在假阳性扩增等等。鉴于需要建立一种高效、成本低、抗基质干扰性能强的检测方法，基于功能化纳米磁珠的样本前处理技术得到了迅速发展。
3.因此，提供一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法，该试剂盒可以在低梯度磁场下从复杂基质中快速分离细菌，捕获效率高、操作简便、分离时间短。
5.本发明具体是通过如下技术方案实现的：
6.一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于：包括抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物；
7.所述抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物制备方法包括以下步骤：
8.1)将纳米磁珠用无菌pbs溶液洗涤，在磁场的作用下弃去洗涤液后重悬于无菌pbs溶液中，得到纳米磁珠溶液；
9.2)分别将edc和nhss溶解于无菌pbs溶液，得到edc溶液及nhss 溶液；将edc溶液与nhss溶液加入至步骤1)所得的纳米磁珠溶液中， 20～25℃条件下活化1～2h，得活化后的纳米磁珠；将活化后的纳米磁珠用无菌pbs溶液洗涤重悬，得到活化后的纳米磁珠溶液；
10.3)将抗菌肽溶于无菌超纯水，得到抗菌肽溶液；将抗菌肽溶液加入至步骤2)得到的活化后的纳米磁珠溶液中，20～25℃条件下反应3～6h，得到抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物；将抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物用无菌pbs溶液洗涤重悬后得到抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液；
11.将所述抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液加入至含大肠埃希氏菌的样本溶液中，在37℃条件下，以180rpm，混匀孵育20～40min，插入磁力架分离 4～5min，分离产物洗涤后重悬即得大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物。进一步的，步骤1)所述纳米磁珠表面为羧基化，粒径为180nm；
12.所述纳米磁珠的浓度为10mg/ml。
13.进一步的，所述洗涤、重悬均采用无菌pbs溶液；
14.所述无菌pbs溶液的浓度为0.01m，ph为7.4。
15.进一步的，步骤1)所述纳米磁珠与步骤2)所述edc和nhss的质量比为10∶2.90∶3.26。
16.进一步的，步骤2)所述分别将edc和nhss溶解于无菌pbs溶液包括以下步骤：称取2.9mg edc溶于290μl无菌的pbs中；
17.称取3.26mg nhss溶于326μl无菌的pbs中，
18.进一步的，步骤3)所述抗菌肽为硫酸多粘菌素b，其分子量为1301.56。
19.进一步的，步骤1)所述纳米磁珠与步骤3)所述抗菌肽的质量比为5∶1。
20.进一步的，步骤2)所述edc和nhss的质量比为2.90∶3.26。
21.进一步的，包括以下步骤：
22.(1)当样品中含有大肠埃希氏菌时，按抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液与样品体积比为1∶5将抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液加入到样品液中，于旋转混匀仪上，37℃条件下反应30min；
23.(2)将步骤1)中反应结束的样品液置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，弃上清，加入100μl pbs缓冲液重悬大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.1.本试剂盒适用于从尿液样品中分离富集大肠埃希氏菌，可在短时间内富集样本中含量较少的大肠埃希氏菌，从而提高目标菌的浓度，提高后续检测方法的灵敏度。
26.2.本发明采用粒径180nm的纳米磁珠，主要用于基质中目标菌的快速富集，而现有技术采用粒径30nm或者50nm磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。
27.3.本发明采用的大肠埃希氏菌识别分子(抗菌肽)是硫酸多粘菌素b，一种阳离子多肽。硫酸多粘菌素b是革兰氏阴性菌的强效广谱抗生素。硫酸多粘菌素b含有丰富的氨基官能团，可通过氨基与纳米磁珠表面的羧基相连，硫酸多粘菌素b通过从细菌细胞膜脂的带负电荷的磷酸基团中竞争性置换二价阳离子，与革兰氏阴性菌的外膜发生静电相互作用，从而结合在大肠埃希氏菌表面，达到本发明富集分离的目的。相较于免疫磁分离使用的抗体，本发明采用的硫酸多粘菌素b具有稳定性好、成本低、质量可控等优点。
28.4.本发明合成的抗菌肽-纳米磁珠复合物是先通过edc和nhss将纳米磁珠表面的羧基活化，再利用活化后的羧基与抗菌肽上的氨基进行共价结合，将抗菌肽偶联到纳米磁珠表面。相比于牛血清蛋白或者聚乙二醇介导偶联的方法，本发明的抗菌肽-纳米磁珠复合物合成方法更为简单，耗时更短且成本更低。
29.5.本发明合成抗菌肽-纳米磁珠复合物是通过抗菌肽(硫酸多粘菌素b) 从细菌细胞膜脂的带负电荷的磷酸基团中竞争性置换二价阳离子，与革兰氏阴性菌的外膜发生静电相互作用，从而结合在大肠埃希氏菌表面，相较于抗体的识别方式，本发明的抗菌肽-纳米磁珠复合物与细菌相互作用力更强，分离细菌的能力更强，性质更稳定，特别适用于复杂样品中细菌的富集分离。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
31.图1为本发明试剂盒示意图。
32.图中1为磁力架摆放位置，2、3、4、5、6、7均为放置试剂瓶的凹槽。
具体实施方式
33.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.本发明所选纳米磁珠(180nm)购买于上海奥润有限公司。
36.本发明所选硫酸多粘菌素b(分子量1301.56)购自上海阿拉丁生化科技有限公司。
37.nhss(n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)，edc(乙基3-(3-二甲氨基) 碳二亚胺盐酸盐)等均为常规试剂，不再赘述。
38.本发明所用0.01m pbs配制方法为：8.0g nacl、0.2g kcl、0.24gkh2po4、1.44g na2hpo4溶解于800ml蒸馏水中，用5m naoh调整ph至 7.4，再定容至1000ml即得。
39.实施例1
40.一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法，按照如下步骤进行：
41.(1)吸取1ml纳米磁珠(10mg/ml)，加入到9ml ph 7.4的无菌的pbs 溶液中，在外加磁场的作用下，对纳米磁珠进行洗涤，弃去洗涤液，洗涤步骤共重复3次，将洗涤后的纳米磁珠重悬于9ml无菌的pbs溶液中；
42.(2)称取2.9mg edc溶于290μl无菌的pbs中，称取3.26mg nhss 溶于326μl无菌的pbs中，将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的纳米磁珠溶液中，再加入9ml无菌pbs，20℃活化1h；
43.将活化后纳米磁珠用无菌的pbs洗涤3次，重悬于9.8ml无菌的pbs 溶液中；
44.(3)称取抗菌肽(硫酸多粘菌素b)2mg，溶解到200μl无菌超纯水中，加入到活化后的纳米磁珠溶液中，反应3h，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于 10ml无菌的pbs溶液中，得到终浓度为1mg/ml的抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液，用于富集分离大肠埃希氏菌。
45.(4)富集捕获：取1ml含有大肠埃希氏菌的待测样品溶液，加入100μg 抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液，置于恒温摇床振荡器上，以180rpm的转速37℃孵育20min，形成大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物；将离心管插入磁力架分离4min，磁力分离后，用无菌的pbs洗涤后重悬，即得大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物。
46.实施例2
47.一种分离尿液中大肠埃希氏菌的试剂盒及制备方法，按照如下步骤进行：
48.(1)吸取1ml纳米磁珠(10mg/ml)，加入到9ml ph 7.4的无菌的pbs 溶液中，在外加磁场的作用下，对纳米磁珠进行洗涤，弃去洗涤液，洗涤步骤共重复3次，将洗涤后的纳米磁
珠重悬于9ml无菌的pbs溶液中；
49.(2)称取2.9mg edc溶于290μl无菌的pbs中，称取3.26mg nhss 溶于326μl无菌的pbs中，将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的纳米磁珠溶液中，再加入9ml无菌pbs，25℃活化2h；
50.将活化后纳米磁珠用无菌的pbs洗涤3次，重悬于9.8ml无菌的pbs 溶液中；
51.(3)称取抗菌肽(硫酸多粘菌素b)2mg，溶解到200μl无菌超纯水中，加入到活化后的纳米磁珠溶液中，反应6h，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到终浓度为1mg/ml的抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液，用于富集分离大肠埃希氏菌。
52.(4)富集捕获：取1ml含有大肠埃希氏菌的待测样品溶液，加入100μg 抗菌肽修饰的纳米磁珠复合物溶液，置于恒温摇床振荡器上，以180rpm的转速37℃孵育40min，形成大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物；将离心管插入磁力架分离5min，磁力分离后，用无菌的pbs洗涤后重悬，即得大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物。
53.富集效果实验
54.(1)取1ml浓度为104cfu/ml的大肠埃希氏菌于1.5ml无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，用等体积无菌pbs溶液重悬。
55.(2)分别设置本发明技术方案组：纳米磁珠组、抗菌肽-纳米磁珠组富集大肠埃希氏菌。
56.(3)磁分离后，将上清液转入无菌离心管中，而分离得到的大肠埃希氏菌-纳米磁珠或大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物则用pbs清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬大肠埃希氏菌-纳米磁珠或大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物。
57.所述功能化纳米磁珠指纳米磁珠、抗菌肽-纳米磁珠。
58.(4)捕获率计算：将各组富集的目标菌重悬液进行梯度稀释后，用琼脂平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算目标菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：[被富集吸附的菌落总数/(上清液中菌落总数 被富集吸附的菌落总数)]
×
100％。
[0059]
所述各组富集捕获目标菌的方案如下：
[0060]
a.本发明技术方案组(抗菌肽-纳米磁珠)富集捕获目标菌方案如实施例1，具体如下：将100μg抗菌肽-纳米磁珠复合物加入到含有目标菌离心管中，置于恒温摇床振荡器上，以180rpm的转速37℃孵育20～40min。将离心管置于常规磁力架分离4～5min。
[0061]
b.纳米磁珠组富集捕获目标菌方案具体如下：
[0062]
将100μg纳米磁珠加入到含有目标菌的离心管中，置于恒温摇床振荡器上，以180rpm的转速37℃孵育20～40min。最后将离心管置于常规磁力架分离4～5min。
[0063]
各组捕获效率如表1所示。
[0064]
表1
[0065][0066]
实验结果表明，抗菌肽-纳米磁珠组对大肠埃希氏菌的捕获效率明显高于纳米磁
珠组，这说明抗菌肽与大肠埃希氏菌表面的静电相互作用具有较强的亲和力，因此能够在短时间内分离富集更多的目标菌。
[0067]
尿液样品使用试剂盒性能评估
[0068]
将无菌尿液样品，加入大肠埃希氏菌调节菌落浓度至10
1-105cfu/ml备用。
[0069]
将制备好的抗菌肽-纳米磁珠(100μg)分别加入到含有不同浓度大肠埃希氏菌的样品溶液中，置于恒温摇床振荡器上，以180rpm的转速37℃孵育 20～40min。置于常规磁力架上磁分离4～5min。将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有大肠埃希氏菌-抗菌肽-纳米磁珠复合物则用无菌pbs洗涤两次，用1ml无菌pbs重悬并混合均匀。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例1。
[0070]
不同浓度大肠埃希氏菌的捕获效率如表2所示。
[0071]
表2
[0072][0073]
结果显示抗菌肽-纳米磁珠对尿液中不同浓度的大肠埃希氏菌均具有较为理想的捕获效率，表明本方案能够应用于实际。
[0074]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。