一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法。
技术背景
2.欧夏至草(marrubium vulgare) 又名悦芙草，隶属唇形科欧夏至草属(marrubium)，单种属，多年生草本，高30~40 厘米，其茎宽阔，气味宛如百里香。欧夏至草属约40种，主要分布于欧亚大陆温带及非洲北部，以地中海地区为多，特别是阿尔卑斯山区生长的欧夏至草品质优良。我国欧夏至草主要分布于新疆伊犁地区，是一种常见中药材，在医药上常用于治疗呼吸器官慢性病。欧夏至草提取物能够镇静安抚，解毒排毒，降低血管充血现象，重塑肌肤健康活力，有效对抗组胺，减少皮脂生成，帮助舒缓肌肤不适状态。连翘酯苷为欧夏至草中的活性成分之一，具有极大的应用潜能。有研究表明，连翘酯苷可有效抑制环氧合酶（cox）活性，降低花生四烯酸导致的炎症反应发生的概率。已有研究者将欧夏至草提取物添加到漱口水中，用于口腔消炎杀菌，也有研究者将欧夏至草提取物连翘酯苷成功应用于护肤品中用以改善肌肤毛孔。然而，欧夏至草中连翘酯苷含量较低，从欧夏至草中获取高活性成分连翘酯苷的研究相对较少，极大的限制了其使用。
3.植物愈伤组织培养法作为一种富集植物体内活性成分的有效方法，不仅可大大加快植物细胞的生长，而且可通过改变诱导因子的种类与含量调节目标物质的合成，此外，该方法不受自然环境地理、季节和气候的限制，节省了野生植物和土地资源，具有生长周期短，经济效益显著等优点。杨瑞仪通过在虎杖愈伤组织培养过程中加入水杨酸、茉莉酸甲酯等诱导子，以及改变温度、紫外辐射、无机盐等胁迫条件，促进了其活性成分白藜芦醇的合成。毛美琴以朱砂根愈伤组织为研究材料，系统性的研究了酵母提取物、黑曲霉、稀土元素镧（la）、钴离子（co
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）等不同诱导因子对活性成分三萜皂苷合成的影响并对诱导因子进行了筛选。结果显示，几种诱导因子均能提高朱砂根中三萜皂苷的含量，其中100mg/l的黑曲霉最有利于三萜皂苷的生产，稀土元素中，la对三萜皂苷合成的促进作用最强。目前，对于提高提高欧夏至草中连翘酯苷含量的方法未见报道。基于现状与前人研究，如何提高欧夏至草中连翘酯苷的含量具有重要意义与应用价值。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种能够提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法，该方法可以将连翘酯苷的产量提升14~25倍。
5.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法，其特征在于采用以下步骤：a、选出适量充实饱满的欧夏至草种子用砂纸磨破种皮，自来水冲洗20分钟，然后用质量浓度为0.1% 的hgcl2溶液浸泡30min；采用灭菌滤纸吸干种子表面水分，然后接种于含有30g/l蔗糖与7g/l琼脂的 ms 基础培养基中，在以下条件下培养：昼夜温度 25℃/18
℃, 每天光照时间12h，光照强度为1600 lx, 光照培养8d；培养完成得无菌幼苗；b、将步骤a所得无菌幼苗上的胚轴接种到愈伤组织诱导培养基上，黑暗培养5天；待所述胚轴的切痕边缘出现膨大后给予光照，每日光照12h，光照强度为1600 lx，光照培养14天后得到愈伤组织；所述诱导培养基为含有0.25 mg/l 6-糖基氨基嘌呤（6-kt）、0. 4 mg/l 6-苄氨基嘌呤（6-ba）、0. 5 mg/l吲哚乙酸（iba）、25g/l蔗糖与10g/l琼脂的 ms 基础培养基;c、将步骤b所得愈伤组织转入继代培养基中，25oc下进行培养，每14天继代一次，继代培养2次，得稳定的欧夏至草愈伤组织；所述继代培养基由步骤b中诱导培养基添加连二亚硫酸钠后所得，其中连二亚硫酸钠的终含量为20~55 mg/l，所述继代培养基的ph为5.8；d、在ms基础培养基加入1.0~2.0mg/l6-ba、0.5~1.0mg/l iba、20g/l2，4-二氯苯氧乙酸和适量蔗糖配制成液体培养基，将步骤c所得稳定的欧夏至草愈伤组织移植到液体培养基中悬浮振荡培养，接种量为40~100g/l，g/l=愈伤组织鲜重/液体培养基体积，摇床转速60~150 rpm，光照强度1500~2000 lx，光照时间8~16 h/day，液体培养基ph为5.6~6.8；每21天继代培养1次，继代培养2~5次；在继代培养周期的第6~12天开始，外加紫外线照射，光强度为：800~1600 lx，每天照射8~10h，在继续培养3~5天后取消紫外线照射，继续培养直至该培养周期结束；在紫外线开始照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的0.8~2.2mg/l玉米赤霉烯酮，在取消紫外线照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的60~150mg/l羧甲基脱乙酰壳多糖，悬浮振荡培养结束得富含连翘酯苷的欧夏至草愈伤组织。
6.本发明中加入到培养基中的各物质浓度均为在培养基中的终点浓度。
7.通过本发明方法培养的欧夏至草愈伤组织，其连翘酯苷的含量可以达到14~25mg/g，占愈伤组织细胞干重的1.4%~2.5%，相较于一般的培养方法连翘酯苷占细胞干重的0.103%的对照组，目标产物连翘酯苷的产量提升了约14~25倍，很大程度上改善了欧夏至草中连翘酯苷含量较低的情况。
8.本发明在欧夏至草愈伤组织的诱导与继代培养过程中，加入连二亚硫酸钠，可增加愈伤组织出愈率，提高连翘酯苷产量。本发明通过在愈伤组织悬浮振荡培养过程中，阶段性地外加紫外线辐照，营造强光胁迫环境，以启动欧夏至草的自身抗逆性防御机制；同时加入诱导因子玉米赤霉烯酮，通过短期内激发细胞的防御性应答反应而产生氧迸发，改变植物体内活性氧的代谢平衡，诱发自由基防御体系中酶保护系统的显著变化以实现对细胞自身的保护。玉米赤霉烯酮的加入有效促进欧夏至草中活性成分合成过程中所需关键酶的生成，实现次生代谢产物的快速合成。本发明在结束紫外线胁迫后，于培养液中加入羧甲基脱乙酰壳多糖，协助细胞内信号的转导，使连翘酯苷的生物合成持续而快速的进行，从而大大提高提高次生代谢产物的产量。
9.综上所述，本发明方法具有提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的有益效果。
具体实施方式
10.实施例1（对照组）：欧夏至草愈伤组织培养方法： 1）欧夏至草愈伤组织的诱导与继代培养：选取饱满的欧夏至草种子，在含有30g/
lx, 光照培养8d；培养完成得无菌幼苗；b、将步骤a所得无菌幼苗上的胚轴接种到愈伤组织诱导培养基上，黑暗培养5天；待所述胚轴的切痕边缘出现膨大后给与光照，每日光照12h，光照强度为1600 lx，光照培养14天后得愈伤组织；所述诱导培养基为含有0.25 mg/l 6-糖基氨基嘌呤（6-kt）、0. 4 mg/l 6-苄氨基嘌呤（6-ba）、0. 5 mg/l吲哚乙酸（iba）、25g/l蔗糖与10g/l琼脂的 ms 基础培养基;c、将步骤b所得愈伤组织转入继代培养基中，25oc下进行培养，每14天继代一次，继代培养2次。得稳定的欧夏至草愈伤组织；所述继代培养基为含有30 mg/l 连二亚硫酸钠的诱导培养基，其ph为 5.8；d、在ms基础培养基加入1.3 mg/l 6-ba、0.8 mg/l iba、0.7 mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸与20g/l蔗糖配制成液体培养基，将步骤c所得稳定的欧夏至草愈伤组织移植到液体培养基中悬浮振荡培养，接种量60g/l，摇床转速120 rpm，光照强度1600 lx，光照时间16h/day，液体培养基ph = 6；每21天继代培养1次，继代培养3次；在继代培养周期的第8天开始，外加紫外线照射，光强度为1000 lx，每天照射8h，在继续培养5天后取消紫外线照射，继续培养直至该培养周期结束；在紫外线开始照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的1.2mg/l玉米赤霉烯酮，在取消紫外线照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的100mg/l羧甲基脱乙酰壳多糖，悬浮振荡培养结束得富含连翘酯苷的欧夏至草愈伤组织。
15.培养结束后，测定连翘酯苷含量，结果表明连翘酯苷含量占细胞干重的1.96%。
16.实施例4（实验组）：一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法，采用以下步骤：a、选取饱满充实干净的欧夏至草种子接种于含有30g/l蔗糖与7g/l琼脂的 ms 基础培养基，在以下条件下培养：昼夜温度 25℃/18℃, 每天光照时间12h，光照强度为1600 lx, 光照培养8d；培养完成得无菌幼苗；b、将步骤a所得无菌幼苗上的胚轴接种到愈伤组织诱导培养基上，黑暗培养3~5天；待所述胚轴的切痕边缘出现膨大后给与光照，每日光照12h，光照强度为1600 lx，光照培养14天后得愈伤组织；所述诱导培养基为含有0.25 mg/l 6-糖基氨基嘌呤（6-kt）、0. 4 mg/l 6-苄氨基嘌呤（6-ba）、0. 5 mg/l吲哚乙酸（iba）、25g/l蔗糖与10g/l琼脂的 ms 基础培养基;c、将步骤b所得愈伤组织转入继代培养基中，25℃下进行培养，每14天继代一次，继代培养2次。得稳定的欧夏至草愈伤组织；所述继代培养基为含有40 mg/l 连二亚硫酸钠的诱导培养基，其ph为 5.8；d、在ms基础培养基加入1.5 mg/l 6-ba、0.7 mg/l iba、0.6 mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸与20g/l蔗糖配制成液体培养基，将步骤c所得稳定的欧夏至草愈伤组织移植到液体培养基中悬浮振荡培养，接种量80g/l，摇床转速150 rpm，光照强度1500 lx，光照时间10h/day，液体培养基ph = 6.4；每21天继代培养1次，继代培养2次；在继代培养周期的第9天开始，外加紫外线照射，光强度为1200 lx，每天照射8.5h，在继续培养4天后取消紫外线照射，继续培养直至该培养周期结束；在紫外线开始照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的1.6mg/l玉米赤霉烯酮，在取消紫外线照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的90 mg/l羧甲基脱乙酰壳多糖，悬浮振荡培养结束得富含连翘酯苷的欧夏至草愈伤组织。
17.培养结束后，测定连翘酯苷含量，结果表明连翘酯苷含量占细胞干重的2.52%。
18.实施例5（实验组）：一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法，采用以下步骤：a、选取饱满充实干净的欧夏至草种子接种于含有30g/l蔗糖与7g/l琼脂的 ms 基础培养基，在以下条件下培养：昼夜温度 25℃/18℃, 每天光照时间12h，光照强度为1600lx, 光照培养8d；培养完成得无菌幼苗；b、将步骤a所得无菌幼苗上的胚轴接种到愈伤组织诱导培养基上，黑暗培养3~5天；待所述胚轴的切痕边缘出现膨大后给与光照，每日光照12h，光照强度为1600 lx，光照培养14天后得愈伤组织；所述诱导培养基为含有0.25 mg/l 6-糖基氨基嘌呤（6-kt）、0. 4 mg/l 6-苄氨基嘌呤（6-ba）、0. 5 mg/l吲哚乙酸（iba）、25g/l蔗糖与10g/l琼脂的 ms 基础培养基;c、将步骤b所得愈伤组织转入继代培养基中，25℃下进行培养，每14天继代一次，继代培养2次。得稳定的欧夏至草愈伤组织；所述继代培养基为含有45 mg/l 连二亚硫酸钠的诱导培养基，其ph为 5.8；d、在ms基础培养基加入1.7 mg/l 6-ba、0.6 mg/l iba、0.5 mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸与20g/l蔗糖配制成液体培养基，将步骤c所得稳定的欧夏至草愈伤组织移植到液体培养基中悬浮振荡培养，接种量90g/l，摇床转速60 rpm，光照强度1800 lx，光照时间14h/day，液体培养基ph = 5.6；每21天继代培养1次，继代培养5次；在继代培养周期的第10天开始，外加紫外线照射，光强度1400 lx，每天照射9h，在继续培养3天后取消紫外线照射，继续培养直至该培养周期结束；在紫外线开始照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的1.8mg/l玉米赤霉烯酮，在取消紫外线照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的120 mg/l羧甲基脱乙酰壳多糖，悬浮振荡培养结束得富含连翘酯苷的欧夏至草愈伤组织。
19.培养结束后，测定连翘酯苷含量，结果表明连翘酯苷含量占细胞干重的2.31%。
20.实施例6（实验组）：一种提高欧夏至草愈伤组织中连翘酯苷含量的方法，采用以下步骤：a、选取饱满充实干净的欧夏至草种子接种于含有30g/l蔗糖与7g/l琼脂的 ms 基础培养基，在以下条件下培养：昼夜温度 25℃/18℃, 每天光照时间12h，光照强度为1600 lx, 光照培养8d；培养完成得无菌幼苗；b、将步骤a所得无菌幼苗上的胚轴接种到愈伤组织诱导培养基上，黑暗培养3~5天；待所述胚轴的切痕边缘出现膨大后给与光照，每日光照12h，光照强度为1600 lx，光照培养14天后得愈伤组织；所述诱导培养基为含有0.25 mg/l 6-糖基氨基嘌呤（6-kt）、0. 4 mg/l 6-苄氨基嘌呤（6-ba）、0. 5 mg/l吲哚乙酸（iba）、25g蔗糖与10g琼脂的 ms 基础培养基;c、将步骤b所得愈伤组织转入继代培养基中，25oc下进行培养，每14天继代一次，继代培养2次。得稳定的欧夏至草愈伤组织；所述继代培养基为含有55mg/l 连二亚硫酸钠的诱导培养基，其ph为 5.8；d、在ms基础培养基加入2.0mg/l 6-ba、0.5 mg/l iba、1.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸与20g/l蔗糖配制成液体培养基，将步骤c所得稳定的欧夏至草愈伤组织移植到液体培养基中悬浮振荡培养，接种量100g/l，摇床转速80 rpm，光照强度2000 lx，光照时间12h/day，
液体培养基ph = 5.8；每21天继代培养1次，继代培养4次；在继代培养周期的第12天开始，外加紫外线照射，光强度为1600 lx，每天照射10h，在继续培养3天后取消紫外线照射，继续培养直至该培养周期结束；在紫外线开始照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的2.2mg/l玉米赤霉烯酮，在取消紫外线照射时，往液体培养基中加入经过滤灭菌的150 mg/l羧甲基脱乙酰壳多糖，悬浮振荡培养结束得富含连翘酯苷的欧夏至草愈伤组织。
21.培养结束后，测定连翘酯苷含量，结果表明连翘酯苷含量占细胞干重的1.41%。
22.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。