一种紫海杂交扇贝与紫扇贝回交制种方法与流程

1.本发明涉及经济海产贝类优良苗种制备技术领域，特别是一种紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”或“青农2号”)与紫扇贝回交制种方法。


背景技术：

2.海湾扇贝(argopecten irradians irradians)原产于美国大西洋沿岸，自1982年引进中国并人工繁育成功后，已在我国北方沿海推广养殖了40年之久。然而，海湾扇贝引种后长期只养不育，导致商品贝规格越来越小，育苗、养殖过程中死亡率高、生长缓慢、性早熟等种质退化问题突出，已严重制约了我国扇贝养殖业的健康、可持续发展。为了改良海湾扇贝的种质，团队引进了紫扇贝(argopecten purpuratus)并自繁成功，紫扇贝是原产于南太平洋的一种中型扇贝，生长13～18个月可达商品规格，最大壳长可达15cm，且具有壳肌肥大、出肉率高、味道鲜美等优点。此外，紫扇贝与海湾扇贝同为argopecten属，具有相同的核型(5st 11t)和染色体数(32条)，这使得二者进行种间杂交育种成为可能。
3.杂交育种是重要的育种方法，可有效利用杂种优势将双亲优良性状结合于一体，或将双亲中控制同一优良性状的不同微效基因积累起来。2007年以来，团队将海湾扇贝与紫扇贝进行杂交，首次成功培育出经济性状优势极其显著的杂交一代，产量比同期养殖的海湾扇贝提高约100％。随后，我们在紫扇贝与海湾扇贝杂交一代的基础上进行群体自繁或回交后进行群体自繁选育，经过6代连续选育，团队成功培育出生长快、个体大、出柱率高的杂交扇贝新品种扇贝“渤海红”和“青农2号”，产量比同期养殖的海湾扇贝提高40％以上。自推广以来，扇贝“渤海红”和“青农2号”深受养殖户的欢迎，现已成为我国北方沿海地区主要养殖贝类之一。
4.显然，扇贝“渤海红”和“青农2号”的产量明显低于紫海杂交一代扇贝的产量。但利用扇贝“渤海红”或“青农2号”的卵子与紫扇贝的精子回交所培育出的回交一代苗种存活率高、生长优势显著，养成后回交扇贝具明显的外形特点，且因其个体重、出柱率和抗逆性均显著优于扇贝“渤海红”和“青农2号”，扇贝养殖户称之为“超级贝”或“咖啡贝”。近三年的中试推广发现，咖啡贝在回交后代中比例达到30％，苗种价格提高50～100％，深受扇贝养殖户的青睐。因此，规模化生产、养殖紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”或“青农2号”)与紫扇贝的回交一代苗种可有效促进扇贝养殖业提质增效，具有广阔的应用前景。此外，扇贝“渤海红”和“青农2号”均为雌雄同体型扇贝，诱导催产时容易发生自体受精或种内受精，因而采用常规产卵方法与紫扇贝回交后代比例低于3％，严重影响了回交一代扇贝的制种效率及养殖扇贝的总体产量，因此需要攻克雌雄同体扇贝种间回交后代的比例低的技术瓶颈。


技术实现要素：

5.本发明目的在于解决现有雌雄同体扇贝种间回交制种效率低及养殖扇贝的总体产量低的问题，而提出的一种紫海杂交扇贝与紫扇贝回交制种方法。
6.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
7.一种紫海杂交扇贝与紫扇贝回交制种方法，利用紫海杂交扇贝与紫扇贝进行种间回交，进而提高回交一代扇贝的制种效率和产率，获得生长快、个体大、出柱率高、抗逆性强的优质回交一代扇贝苗种。
8.所述紫海杂交扇贝为扇贝“渤海红”或“青农2号”。
9.进一步的说：
10.a.以连续选育的紫海杂交扇贝和紫扇贝自交品系作为亲贝；
11.b.通过人工控制培育条件使两亲贝性腺趋于同步成熟；
12.c.催产获得紫扇贝高浓度(大于105个/ml)的纯精液；
13.d.对步骤b性腺发育成熟的紫海杂交扇贝自交品系进行诱导催产，大量获得未受精或受精率很低的卵子，将其与步骤c获得的紫扇贝高浓度精液受精，进而获得生长快、个体大、出柱率高、抗逆性强的回交一代扇贝苗种，该方法可显著提高雌雄同体扇贝回交一代苗种的制种效率和产率。
14.所述步骤a自交品系亲贝的获得为分别建立多个紫海杂交扇贝和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的自交家系选优后将幼虫混合培养至成体，并用同样的方法连续选育、纯化3代以上，即实现连续选育获得各自自交品系，进而作为亲贝。
15.进一步的说，所述a步骤如下：所用紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”和“青农2号”)和紫扇贝为连续选育的自交品系，即每年3月中下旬分别在紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”和“青农2号”)自交群体和紫扇贝自交群体中各选取500个性状优良的扇贝作为亲贝，分别建立200个以上紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”和“青农2号”)和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的所有家系选优后将幼虫混合培养至成体，并用同样的方法连续选育、纯化3代以上，用于后续规模化生产回交一代扇贝商品苗种。
16.所述步骤b使两亲贝性腺趋于同步成熟为将紫扇贝种贝暂养于15℃的海水中适应1周，紫海杂交扇贝种贝暂养于10℃的海水中适应1周，暂养后首先对紫海杂交扇贝种贝以0.5℃/天的升温速率升温，待紫海杂交扇贝的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温后适应2周，随后对两种亲贝分别以每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，当养殖水温升至20℃时，停止升温并保持水温恒定(20
±
0.5℃)，使二者性腺成熟度趋于同步。
17.上述升温过程中持续观察上述两亲贝的性腺发育情况，若其中一种扇贝性腺发育明显加快，则停止升温并减少微藻饵料和补充饵料的投喂量，使上述两亲贝的性腺成熟度趋于同步。
18.所述步骤c性腺发育成熟后将紫扇贝种贝阴干刺激30分钟，然后将其置于加入25℃过滤海水的水槽中产卵排精，待水槽中海水呈乳白色时，利用500目筛绢过滤，获得紫扇贝高浓度(大于105个/ml)的纯精液。
19.所述步骤d回交一代扇贝苗种的获得将步骤c获得高浓度的紫扇贝精液经25℃过滤海水稀释至其5-10倍备用；将单个紫海杂交扇贝亲贝置于加有25℃过滤海水的1l烧杯中催产，直到扇贝产卵，将卵倒入含有上述紫扇贝精液的塑料桶中进行回交制种，受精卵的孵化密度达在30～40个/ml为宜，孵化后选育d型幼虫的时候控制养殖密度8～12个/ml。
20.按照上述方式较高的紫扇贝精液既能提高与紫海杂交扇贝回交后代的比例，又不会导致胚胎畸形率和死亡率的升高。该方法的优点在于回交一代苗种所占比例高，达到
60％～80％，显著提高回交扇贝商品苗种的价格。
21.本发明所具有的优点：
22.本发明方法可显著提高雌雄同体的紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”或“青农2号”)与紫扇贝回交后代的比例，从而规模化制备生长优势显著、成活率高、抗逆性强、产量高的回交扇贝苗种；且，该方法可用于规模化制备杂种优势极其显著的雌雄同体型扇贝种间杂交商品苗种。具体表现为：
23.1.本发明方法中选择紫海杂交扇贝新品种“渤海红”或“青农2号”作为回交的种贝，其是经过系统选育的新品种，具有生长快、遗传稳定的特点，且具有较好的产业基础；
24.2.本发明方法采用紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”或“青农2号”)和紫扇贝的自交品系作为种贝，可显著提高回交一代扇贝的杂种优势，苗种的生长、产量与抗逆性能显著提高；
25.3.采用预先准备高浓度紫扇贝精液(大于104个/ml)，然后加入扇贝“渤海红”或“青农2号”的卵子进行种间回交，一方面可显著提高后代的回交率，又不会导致胚胎畸形率和死亡率的升高；另一方面由于操作过程中控制了紫扇贝的精液浓度，规模化生产过程中无需洗卵；
26.4.回交一代扇贝表现为雄性不育且其卵子受精率和孵化率均低，不适合用作种贝繁育后代，有利于保持回交扇贝的杂种优势、防止近交衰退，促进产业的可持续发展；
27.5.紫海杂交扇贝与紫扇贝回交一代苗种具有生长快、变态率高、成活率高、抗逆性强、产量高等优势，深受扇贝养殖户的青睐，苗种和商品贝价格均显著高于扇贝“渤海红”或“青农2号”，可显著提高养殖扇贝的产量和产值。
具体实施方式
28.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
29.本发明方法提高杂交扇贝制种效率和产率，采用大量获得紫海杂交扇贝(扇贝“渤海红”或“青农2号”)未受精或受精率极低的卵，并用紫扇贝高浓度的精液授精，显著提高紫海杂交扇贝和紫扇贝回交效率，从而培育生长快、成活率高、抗逆性强、产量高的回交扇贝苗种，养成后回交扇贝具明显的外形特点，且其个体重、出柱率和抗逆性均显著优于扇贝“渤海红”或“青农2号”；因此，本发明方法适合规模化生产雌雄同体型扇贝种间杂交商品苗种，可有效促进扇贝养殖业提质增效，具有广阔的应用前景。
30.下述实施例中所用的扇贝“渤海红”为本团队选育的国家级水产新品种，连续自交纯化3代以上作为生产用亲贝，且，该品种以为市购产品，按照selection of a new scallop strain,the bohai red,from the hybrid between the bay scallop and the peruvian scallop(wang et al.,2017)文献中记载可获得。
31.扇贝“青农2号”为本团队选育的国家级水产新品种，连续自交纯化3代以上作为生产用亲贝，且，该品种以为市购产品，同时可按照selection of a new scallop strain,qn-2,from the backcross of peruvian scallop
×
bay scallop f
1 hybrids with bay scallops(xu et al.,2019)文献中记载获得。
32.实施例：
33.2019年12月将扇贝“渤海红”和紫扇贝种贝各2000枚纳入山东烟台莱州育苗场育肥，上述扇贝“渤海红”和紫扇贝种贝为连续选育的自交品系，即每年3月中旬分别在扇贝“渤海红”自交群体和紫扇贝自交群体中各取500枚性状优良的扇贝作为种贝，分别建立200个以上扇贝“渤海红”和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的所有家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用同样的方法连续选育、纯化3代以上作为自交品系；
34.而后，将上述获得各自交品系的亲贝进行暂养，将扇贝“渤海红”亲贝(10℃的海水)和紫扇贝亲贝(15℃的海水)分别在海水中暂养1周，然后优先给扇贝“渤海红”升温，以0.5℃/天的升温速率升温，待扇贝“渤海红”的养殖水温达到紫扇贝的暂养水温后适应2周，随后按照如下升温策略为两亲贝升温：每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定2天，以促进扇贝精卵充分成熟，当养殖水温升至20℃时，停止升温并保持水温恒定(20
±
0.5℃)。升温过程中持续观察上述两亲贝的性腺发育情况，如果其中一种扇贝的性腺成熟度明显变快，则停止其升温并减少微藻饵料和补充饵料如鸡蛋黄的投喂量，使二者性腺成熟度趋于同步。
35.2020年3月，挑选个体大、性腺发育良好的紫扇贝自交品系亲贝200枚，阴干刺激30分钟后置于事先加入25℃海水的400l水槽中集中排精，待海水呈乳白色时利用500目筛绢过滤获得紫扇贝的纯精液；预先将紫扇贝的精液稀释到104个/ml，然后取500ml稀释后的精液倒入10l塑料桶中备用；
36.同时，挑选扇贝“渤海红”自交品系亲贝200枚，100枚置于1个干净网箱中，阴干刺激30分钟后，将单个扇贝“渤海红”亲贝置于事先加入25℃过滤海水的1l烧杯中，若先排精则将之倒掉，将扇贝和烧杯浸入淡水桶中3秒钟杀精，然后再加入约500ml、25℃的过滤海水催产，直到扇贝产卵，将卵倒入上述含有紫扇贝精液的10l塑料桶中受精，卵液倒满桶转移至100l塑料桶中受精10分钟后将其倒入孵化池中孵化。利用该方法培育回交一代扇贝2池，每池卵量控制在10～12个/ml。此后，参照普通海湾扇贝的培育流程进行回交扇贝苗种培育。
37.扇贝“渤海红”与紫扇贝回交一代扇贝在幼虫和稚贝阶段均表现出显著的生长优势、成活率及变态率。在生长方面，回交扇贝幼虫期的壳长生长速度平均比扇贝“渤海红”幼虫快2μm/天，至附着前回交一代扇贝苗种比扇贝“渤海红”幼虫大约15～20μm。2020年11月于山东烟台养马岛海区进行了现场验收，共获得回交扇贝约2000笼(400枚/笼)，其中回交扇贝比例在72％。此外，扇贝“渤海红”与紫扇贝回交一代商品贝规格和贝柱出肉率(壳高69.85
±
3.38mm，湿重58.59
±
9.70g，柱重5.47
±
0.87g)均显著优于扇贝“渤海红”(壳高54.62
±
5.10mm，湿重31.58
±
5.81g，柱重2.50
±
0.76g)，增产效果极其显著。
38.实施例2
39.2020年12月将扇贝“青农2号”和紫扇贝自交品系各3000枚纳入山东烟台莱州育苗场育肥，上述扇贝“青农2号”和紫扇贝种贝为连续选育的自交品系，即每年3月中旬分别在扇贝“青农2号”自交群体和紫扇贝自交群体中各取500枚性状优良的扇贝作为种贝，分别建立200个以上扇贝“青农2号”和紫扇贝的自交家系，同种扇贝的所有家系选优后将幼虫混合培养至成体，并采用同样的方法连续选育、纯化3代以上作为自交品系；
40.而后，将上述获得各自交品系的亲贝进行暂养，将扇贝“青农2号”和紫扇贝分别在12℃和15℃的海水中暂养2周，然后先给扇贝“青农2号”升温，以0.5℃/天的升温速率升温，待扇贝“青农2号”的养殖水温达到15℃后适应2周。随后，按照如下升温策略为两种贝升温：
每天升温0.5℃，连续升温2℃后稳定3天，以促进扇贝精卵充分成熟，当养殖水温升至19℃时，停止升温并保持水温恒定(19
±
0.5℃)。升温过程中持续观察上述两种贝的性腺发育情况，若其中一种扇贝的性腺发育明显变快，则停止升温并减少微藻饵料和补充饵料的投喂量，使两种贝性腺的成熟度趋于同步。
41.2021年3月，挑选个体大、性腺发育良好的紫扇贝自交品系200枚，阴干刺激30分钟后置于事先加入24℃海水的500l水槽中产卵排精，待海水浑浊、呈乳白色时，利用500目筛绢过滤获得紫扇贝高浓度的纯精液。预先取紫扇贝的精液500ml倒入10l塑料桶中备用。
42.同时，挑选性状优良的扇贝“青农2号”自交品系种贝400枚，阴干刺激30分钟，将单个扇贝“青农2号”种贝置于事先加入24℃过滤海水的1l烧杯中，若扇贝“青农2号”先排精则将之倒掉，将扇贝和烧杯浸入淡水桶中3秒钟杀精，然后再向烧杯中加入约500ml、24℃过滤海水催产，直到扇贝产卵，将卵倒入上述含有紫扇贝精液的10l塑料桶中受精，卵液倒满桶后将其倒入100l塑料桶中受精10分钟，然后将受精卵倒入孵化池中孵化。利用该方法培育回交一代扇贝1池，每池的卵量控制在12～14个/ml。此后，参照普通海湾扇贝的培育流程进行回交扇贝苗种培育。
43.扇贝“青农2号”与紫扇贝回交一代扇贝在浮游幼虫和稚贝阶段均表现出显著的生长优势及高成活率和变态率。在生长方面，回交扇贝浮游幼虫的平均壳长比扇贝“青农2号”的幼虫大1.5μm/天，投放附着基前回交一代扇贝苗种比扇贝“青农2号”幼虫大约12～15μm。2021年11月于山东烟台养马岛海区进行了现场验收，采用上述方法共获得扇贝800笼(400枚/笼)，其中回交扇贝比例在62％。此外，扇贝“青农2号”与紫扇贝回交一代商品贝规格和贝柱出肉率(壳高66.92
±
2.49mm，湿重57.33
±
7.25g，柱重5.27
±
1.18g)均显著优于扇贝“青农2号”(壳高55.22
±
4.86mm，湿重32.68
±
4.67g，柱重2.64
±
0.87g)，增产效果极其显著。