一种猕猴桃组织培养方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种猕猴桃组织培养方法。


背景技术：

2.猕猴桃(actinidia chinensis)是一种经济价值较高的木质藤本植物，其果实肉厚汁多，酸甜适度，营养丰富，以其维生素c特高的营养价值而成为当前水果中之珍品，已经成为当今世界的新兴栽培果树。
3.随着消费市场需求不断增加，我国猕猴桃产业已进入高速发展阶段，而高质高效的苗木繁育成为整个产业发展迫切需要突破的关键环节。传统的组织培养技术，可有效获得猕猴桃无性系种苗，但其生根效率较低、生根周期较长，且在生根过程中容易发生微生物污染，严重影响组培苗质量。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猕猴桃组织培养方法，在生根培养过程中不使用糖作为植物碳源，而是采取供应co2促进组培苗进行光合作用，利于诱导根系快速发育，解决了猕猴桃组培苗生根过程容易发生微生物污染、生根周期长、生根率低的技术问题。
5.本发明提供了一种猕猴桃组织培养方法，包括以下步骤：
6.将猕猴桃组培苗接种于生根培养基，于培养容器中、光照条件下进行生根培养，得到猕猴桃幼苗；所述生根培养基中不含糖；所述生根培养的过程中在培养容器中通入co2。
7.优选的，所述通入co2包括：在所述生根培养的第3天开始通入co2；在所述生根培养的第3～7d，所述co2的流量为0.8～1.2l
·
min-1
；在所述生根培养的第8d开始，所述co2的流量为1.8～2.2l
·
min-1
；在培养第3d开始保持所述生根培养的环境中co2浓度为800～1200μmol
·
mol-1
。
8.优选的，所述co2的通入频率为每间隔15～30min通入1次，每次的通入时间为3～8min。
9.优选的，所述光照条件包括：在所述生根培养的第0～7d内，每天光照8h、黑暗16h，光照强度低于1000lx；在所述生根培养的第8d开始，每天光照14h、黑暗10h，光照强度为2500～3000lx。
10.优选的，所述猕猴桃组培苗的培育方法包括以下步骤：
11.1)将猕猴桃茎段置于外植体培养基进行外植体培养，至茎段萌发出腋芽且所述腋芽的长度＞2cm；
12.2)将所述腋芽移植到增殖培养基，进行增殖培养，得到猕猴桃组培苗。
13.优选的，所述外植体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：ms4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.2mg/l和琼脂6～7g/l。
14.优选的，所述外植体培养的光照强度为2500～3000lx；所述外植体培养的温度为
22～26℃。
15.优选的，所述增殖培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.1～0.6mg/l、6-ba0.1mg/l和琼脂6～7g/l。
16.优选的，所述增殖培养的光照强度为2500～3000lx；所述增殖培养的温度为22～26℃。
17.优选的，所述生根培养基包括蛭石基质和营养液；所述生根培养基的湿度≥70％；所述营养液以1/2ms为基础营养液，还包含质量浓度为0.5～2.0mg
·
l-1
的iba。
18.本发明提供了一种猕猴桃组织培养方法。本发明利用光自养微繁殖技术，充分利用植物组织培养技术的快速性和环境调控的整体性，在猕猴桃组培苗生根培养过程中不使用糖作为植物碳源，而是供应co2诱导组培苗进行光合作用。本发明不使用糖作为植物碳源解决了生根培养过程中污染问题，提高了生根率，同时降低了生产成本，供应co2使得组培苗进行光合自养改变了以前由蔗糖供能的异养培养方式，使得组培苗的生长处于接近于自然状态，更有利组培苗适应大田环境，几乎不需要移栽驯化时间。本发明解决了猕猴桃组培苗污染率高、生根难、生根周期长、光合能力弱和幼苗质量差的问题，推动猕猴桃种苗繁育工厂化生产。
19.利用光自养微繁殖技术明显的缩短生根周期，在第7d就可观察到根系，并且根系庞大有利于植株生长发育，在第28天能够形成庞大的根系。
附图说明
20.图1为两种培养方式下
‘
脐红’生根情况，其中，g-i：光异养(传统组培生根方式ck)；j-l：光自养生根方式；g,j：培养第7d；h,k：培养第14d；i,l：培养第28d；
21.图2为两种培养方式下
‘
郁香’的生根情况；其中，a-c：光异养(传统组培生根方式ck)；d-f：光自养生根方式；a,d：培养第7d；b,e：培养第14d；c,f：培养第28d。
具体实施方式
22.本发明提供了一种猕猴桃组织培养方法，包括以下步骤：
23.将猕猴桃组培苗接种于生根培养基，于培养容器中、光照条件下进行生根培养，得到猕猴桃幼苗；所述生根培养基中不含糖；所述生根培养的过程中在培养容器中通入co2。
24.在本发明中，在将猕猴桃组培苗接种于生根培养基前，优选的还包括切除猕猴桃组培苗底部的愈伤组织，造成伤口利于根的形成。
25.在本发明中，所述生根培养基优选的包括蛭石基质和营养液；所述生根培养基的湿度≥70％；所述营养液以1/2ms为基础营养液，还包含质量浓度为0.5～2.0mg
·
l-1
的iba。在本发明中，所述蛭石优选的经过灭菌处理；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为20min。
26.在本发明中，所述生根培养采用的培养容器优选为光自养培养盒；所述光自养培养盒的规格优选为长
×
宽
×
高：25cm
×
20cm
×
14cm，每个光自养培养盒内接种的组培苗的数量优选为30～35株。
27.在本发明中，蛭石疏松多孔，本发明以蛭石作为基质，配合光自养生根培养能够明显改善组培苗地下环境，更有利猕猴桃根系的生长，根系更加发达有利于组培苗移栽。
28.在本发明中，所述通入co2优选的包括：在所述生根培养的第3天开始通入co2；在所述生根培养的第3～7d，所述co2的流量为0.8～1.2l
·
min-1
；在所述生根培养的第8d开始，所述co2的流量为1.8～2.2l
·
min-1
；在培养第3d开始保持所述生根培养的环境中co2浓度为800～1200μmol
·
mol-1
。
29.在本发明中，当所述猕猴桃的品种为
‘
郁香’时，所述co2的浓度优选为1200μmol
·
mol-1
，当所述猕猴桃的品种为
‘
脐红’时，所述co2的浓度优选为800μmol
·
mol-1
。
30.在本发明中，所述co2的通入频率优选为每间隔15～30min通入1次，当所述猕猴桃的品种为
‘
郁香’时，所述co2的通入频率优选为每间隔15min通入1次；当所述猕猴桃的品种为
‘
脐红’时，所述co2的通入频率优选为每间隔30min通入1次；每次co2的通入时间优选为3～8min，更优选为5min。
31.本发明根据不同猕猴桃品种选择不同co2浓度和通气频率，能够显著提高猕猴桃幼苗的生根率。
32.在本发明中，所述光照条件包括：在所述生根培养的第0～7d内，优选的每天光照8h、黑暗16h，光照强度优选的低于1000lx；在所述生根培养的第8d开始，优选的每天光照14h、黑暗10h，光照强度优选为2500～3000lx。
33.在本发明中，所述生根培养的温度优选为22～26℃，更优选为24℃。在本发明中，所述生根培养优选的于光自养培养室中进行。
34.本发明不使用糖作为植物碳源解决了生根培养过程中污染问题，提高了生根率，同时降低了生产成本，供应co2使得组培苗进行光合自养改变了以前由蔗糖供能的异养培养方式，使得组培苗的生长处于接近于自然状态，更有利组培苗适应大田环境，几乎不需要移栽驯化时间。
35.在本发明中，所述猕猴桃组培苗的培育方法优选的包括以下步骤：
36.1)将猕猴桃茎段置于外植体培养基进行外植体培养，至茎段萌发出腋芽且所述腋芽的长度＞2cm；
37.2)将所述腋芽移植到增殖培养基，进行增殖培养，得到猕猴桃组培苗。
38.本发明首先将猕猴桃茎段置于外植体培养基进行外植体培养，至茎段萌发出腋芽且所述腋芽的长度＞2cm。
39.在本发明中，所述猕猴桃的品种优选为
‘
郁香’和
‘
脐红’；所述猕猴桃茎段优选的取自猕猴桃新梢；所述猕猴桃新梢的采集时间优选为春季4～5月；所述猕猴桃新梢优选的依次经过第一消毒、冷藏、清洗和第二消毒处理；所述第一消毒优选的采用体积百分比为75％的酒精对猕猴桃新梢进行喷洒；所述冷藏的时间优选为5～8h；所述冷藏的温度优选为0℃；所述冷藏后，优选的还包括将所述冷藏后的猕猴桃新梢剪成带腋芽的小段；所述小段的长度优选为3～5cm；所述清洗优选的采用含有清洗剂的水溶液浸洗后，再采用清水冲洗；所述冲洗的时间优选的＞3h；所述第二消毒优选的依次采用体积百分比为75％的的酒精对所述清洗后的猕猴桃新梢进行冲洗后再用1％的次氯酸钠水溶液进行浸泡，所述冲洗的时间优选为10～20s，所述浸泡的时间优选为5～7min；在所述第二消毒后，优选的还包括将所述第二消毒后的猕猴桃茎段进行冲洗，所述冲洗优选的采用灭菌的纯净水进行，所述冲洗的次数优选为5～7次。将所述第二消毒后的猕猴桃新梢进行冲洗后，优选的包括吸干冲洗后的猕猴桃新梢表面的水分后，切除顶端和底端，保证腋芽的完整性。
℃。
55.实施例2
56.2.1外植体建立
57.春季4～5月，在果园收集
‘
脐红’猕猴桃新梢，将剪下的新梢喷洒75％进行消毒后放入0℃冰箱冷藏5～8h，冷藏后取出将其剪成3～5cm带叶芽的小段放入容器内，在容器内挤入5滴清洁剂后加入清水，充分摇匀，然后放在水龙头下用流水冲洗3h以上。将冲洗好的猕猴桃茎段放在超净工作台进行消毒处理，用体积百分比为75％的酒精冲洗10～20s后，用1％的次氯酸钠浸泡5～7min，然后用灭菌后的纯净水冲洗5～7遍。将消毒处理后的猕猴桃茎段，放入灭过菌的滤纸上吸干水分，切除顶端和底端，保证腋芽的完整性，将其放置在外植体培养基内，培养基：ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.2mg/l、琼脂6～7g/l，光照强度为2500～3000lx；培养温度为24
±
2℃。
58.2.2增殖培养
59.茎段腋芽7天左右开始萌发，待其生长到2cm以上，在超净工作台切除茎段，将腋芽移植到增殖培养基。每350ml组培瓶可栽种3～5株组培苗，经过增殖培养后，每株幼苗可增殖分化3～5株。增殖培养基：培养基：ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.1～0.6mg/l、6-ba0.1mg/l、琼脂6～7g/l，光照强度为2500～3000lx；培养温度为24
±
2℃。
60.2.3生根培养
61.将蛭石基质450g分装入灭菌袋，放入高压灭菌锅121℃、20min后分装入光自养培养盒，并搭配1/2ms 0.5～2.0mg
·
l-1
iba的溶液，保持蛭石基质湿度达到70％以上。将高度达到3cm以上的组培苗，切除底部的愈伤组织，并用无菌水进行清洗底部，每盒内接种30～35株苗，进行光自养生根培养。脐红生根过程参见图1。
62.光自养培养室内，通过控制器设置co2浓度为800～1200μmol
·
mol-1
，利用控制器设定时间采取15～30min换气/次。从第3天开始通气，通气流量(1.0
±
0.2)l
·
min-1
，生根培养后期：通气流量(2.0
±
0.2)l
·
min-1
。生根前期光周期为8h/16h，生根后期光周期为14h/10h，生根前期光照强度低于1000lx，生根后期光照强度为2500～3000lx；培养温度为24
±
2℃。
63.表1不同培养方式对猕猴桃组培苗根系指标的影响
[0064][0065][0066]
实施例3
[0067]
3.1外植体建立
[0068]
春季4～5月，在果园收集
‘
郁香’猕猴桃新梢，将剪下的新梢喷洒75％进行消毒后放入0℃冰箱冷藏5～8h，冷藏后取出将其剪成3～5cm带叶芽的小段放入容器内，在容器内挤入5滴清洁剂后加入清水，充分摇匀，然后放在水龙头下用流水冲洗3h以上。将冲洗好的猕猴桃茎段放在超净工作台进行消毒处理，用体积百分比为75％的酒精冲洗10～20s后，用
1％的次氯酸钠浸泡5～7min，然后用灭菌后的纯净水冲洗5～7遍。将消毒处理后的猕猴桃茎段，放入灭过菌的滤纸上吸干水分，切除顶端和底端，保证腋芽的完整性，将其放置在外植体培养基内，培养基：ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.2mg/l、琼脂6～7g/l
[0069]
3.2增殖培养
[0070]
茎段腋芽7天左右开始萌发，待其生长到2cm以上，在超净工作台切除茎段，将腋芽移植到增殖培养基。每350ml组培瓶可栽种3～5株组培苗，经过增殖培养后，每株幼苗可增殖分化3～5株。增殖培养基：培养基：ms 4.43g/l、蔗糖30g/l、naa0.1～0.6mg/l、6-ba0.1mg/l、琼脂6～7g/l
[0071]
3.3生根培养
[0072]
将蛭石基质450g分装入灭菌袋，放入高压灭菌锅121℃20min后分装入光自养培养盒，并搭配1/2ms 0.5～2.0mg
·
l-1
iba的溶液，保持蛭石基质湿度达到70％以上。将高度达到3cm以上的组培苗，切除底部的愈伤组织，并用无菌水进行清洗底部，每盒内接种30～35株苗，进行光自养生根培养。郁香生根过程实物图参见图2。
[0073]
光自养培养室内，通过控制器设置co2浓度为800～1200μmol
·
mol-1
，利用控制器设定时间采取15～30min换气/次。从第3天开始通气，通气流量(1.0
±
0.2)l
·
min-1
，生根培养后期：通气流量(2.0
±
0.2)l
·
min-1
。生根前期光周期为8h/16h，生根后期光周期为14h/10h，生根前期光照强度低于1000lx，生根后期光照强度为2500～3000lx；培养温度为24
±
2℃。
[0074]
表2不同培养方式对猕猴桃组培苗根系指标的影响
[0075][0076]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。