一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法与流程

1.本发明属于生物医学领域，涉及一种外泌体的捕获方法，尤其涉及一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法。


背景技术：

2.外泌体是由细胞分泌的50-200纳米左右的胞外囊泡。它具有脂质双分子膜结构，内部通常还有母细胞的dna片段、microrna、或环状rna等核酸分子。近些年来，它因为细胞间的通讯传递和生物进程而开始被关注，对它的研究涉及多种生理病理领域。
3.外泌体在尿液、血清等各种体液中含量高，对它的分离手段主要有超速离心法/基于分子大小的分离技术(色谱法)、利用多聚物试剂进行沉淀法、免疫吸附磁珠法等。这些方法在回收率、纯度及可操作性上不是非常令人满意。比如其中超速离心效率高，但耗时久，且需依赖大型设备。免疫磁珠法通常是亲和外泌体磷脂膜上的特定蛋白，比如磷酯酰丝氨酸(ps)，捕获效率虽然没有超速离心高，但过程简单，且也能收获足量的外泌体，然而该方法只能捕获个别的、特异性的外泌体，不适用于建立文库、捕获罕见亚型等等场合。因此一套方便快捷方便、非特异性地吸附所有外泌体捕获的方法亟需被开发，这将在广泛的外泌体研究中获得应用。


技术实现要素：

4.本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，以克服现有技术的缺陷。
5.为实现上述目的，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，具有这样的特征：包括以下步骤：
6.步骤一、纳米粒子表面修饰亲和素：将纳米粒子浸泡在氢氧化钠水溶液中(优选的，氢氧化钠水溶液的浓度为0.1wt％，浸泡时间为二十分钟)，完成表面羟基活化；再将表面羟基活化的纳米粒子在氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)溶液中震荡，进行表面氨基化修饰；再将表面氨基化修饰的纳米粒子在吡啶和对苯二异硫氰酸酯的混合溶液中反应，使纳米粒子表面接枝异硫氰酸酯；最后将已接枝异硫氰酸酯的纳米粒子与亲和素混合，孵育，粘附亲和素，即获得捕获粒子；
7.步骤二、外泌体标记生物素：将所需捕获的外泌体样品和磷脂聚乙二醇生物素(dspe-peg-biotin)混合，孵育，dspe会插入外泌体磷脂双分子层中，外露的peg接头的生物素即形成捕获的分子靶点，即得到标记的外泌体；
8.步骤三、外泌体捕获：将标记的外泌体和捕获粒子混合，孵育，捕获粒子的亲和素与标记的外泌体的生物素结合，即完成外泌体的捕获。
9.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三的具体方法为，将标记的外泌体和捕
获粒子分别加入diluent c缓冲液，将两溶液混合，4℃孵育15-75min；标记的外泌体与捕获粒子的比例为10
6-10
13
个∶100-1000nmol。
10.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，孵育后，捕获到外泌体的纳米粒子可以通过离心获得。优选的，8000rpm转速离心10分钟。
11.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二的具体方法为：通过改进的pkh26探针标记流程在diluent c缓冲液中预混所需捕获的外泌体样品和磷脂聚乙二醇生物素乙醇溶液，4℃孵育1h，即得到标记的外泌体；外泌体样品与磷脂聚乙二醇生物素的比例为10
6-10
13
个∶0.02-0.5mg。
12.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，粘附亲和素的具体方法为：将所述已接枝异硫氰酸酯的纳米粒子与亲和素在37℃的去离子水中孵育一小时实现二者链接，再用含有1m/v％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液封闭，再用pbs缓冲液清洗3遍，即得到粘附有亲和素的捕获粒子；已接枝异硫氰酸酯的纳米粒子与亲和素的比例为100-1000nmol∶400-4000μg。
13.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述亲和素为neutravidin亲和素脂质蛋白。
14.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，接枝异硫氰酸酯的具体方法为：将表面氨基化修饰的纳米粒子在含有10m/v％吡啶和1nm对苯二异硫氰酸酯的n,n-二甲基甲酰胺溶液中搅拌反应两小时，然后依次用n,n-二甲基甲酰胺溶剂、无水乙醇和去离子水清洗，实现纳米粒子表面接枝异硫氰酸酯。其中，对苯二异硫氰酸酯过量，即吡啶和对苯二异硫氰酸酯的n,n-二甲基甲酰胺溶液过量，即远超过浸没粒子的用量。
15.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，氨基化修饰的具体方法为：将表面羟基活化的纳米粒子加入在氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，在300rpm转速下震荡6小时，再用无水乙醇洗涤一次，完成纳米粒子的表面氨基化修饰；氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中氨丙基三乙氧基硅烷与无水乙醇的体积比为100μl∶5ml。其中，氨丙基三乙氧基硅烷过量，即氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液过量，即远超过浸没粒子的用量。
16.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述纳米粒子为二氧化硅纳米粒子或四氧化三铁外包裹二氧化硅层纳米粒子。
17.进一步，本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，还可以具有这样的特征：其中，纳米粒子的直径为80-1000nm。
18.所述二氧化硅纳米粒子采用改进的磺酸化法制备，具体方法为：将二氧化硅晶种、无水乙醇、氨水、超纯水混匀作为母液(其中，二氧化硅晶种、无水乙醇、氨水、超纯水的用量比为6ml∶480ml∶45ml∶75ml)，向其中同时滴加a液和b液，其中，a液为正硅酸四乙酯和无水乙醇的混合液(其中，正硅酸四乙酯和无水乙醇的用量比为960ml∶1200ml)，b液为氨水、无
水乙醇、超纯水的混合液(其中，氨水、无水乙醇、超纯水的用量比为240ml∶1560ml∶360ml)；滴加(a、b液流速分别为7-8秒/滴和4-5秒/滴)完成后离心清洗，从而获得粒径均匀的二氧化硅纳米粒子。
19.所述四氧化三铁外包裹二氧化硅层纳米粒子通过改进的方法制备，具体方法为：无水乙二醇、无水三氯化铁粉末、乙酸钠粉末、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐/4-苯乙烯磺酸∶马来酸粉末、l-抗坏血酸粉末、和水(其中，无水乙二醇、无水三氯化铁粉末、乙酸钠粉末、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐/4-苯乙烯磺酸∶马来酸(摩尔比率1∶1)粉末、l-抗坏血酸粉末、水的用量比为16ml∶0.26g∶1.2g∶0.4g∶4.5mg∶20μl)，混匀两小时后加入氢氧化钠粉末(无水三氯化铁粉末与氢氧化钠粉末的用量比为0.26g∶0.24g)，搅拌混匀两小时；之后将反应液装入聚四氟乙烯内罩的不锈钢反应釜，在马弗炉中煅烧，30分钟从30℃线性均匀升温到190℃；190℃维持540分钟；140分钟从190℃线性均匀降温至30℃；之后，分别用无水乙醇和去离子水清洗所获的fe3o4纳米颗粒三次，最终分散在去离子水中。将纯乙醇、上述的fe3o4纳米颗粒分散液、浓氨水混合(其中，纯乙醇、fe3o4纳米颗粒分散液(0.4-0.8mmol/6ml)、浓氨水的用量比为40ml∶6ml∶2ml)，盖上保险膜超声分散十分钟；在50℃水浴环境中机械搅拌孵育10分钟；以每滴20秒的速度加入300μl的正硅酸乙酯。反应1小时后，用无水乙醇和去离子水清洗纳米颗粒三次，即获得的fe3o4@sio2粒子。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，从构建亲和素和生物素的强力吸附作用入手，分别对外泌体和纳米捕获粒子表面修饰两个脂质分子，实现外泌体高效、无差异地与捕获粒子结合从而被富集分离。具体具有以下优点：一、本发明基于纳米颗粒捕获，操作仅涉及混合、离心等简单过程，不依赖复杂设备，在实验桌条件上简单操作即可完成。二、与依赖特定蛋白吸附的磁珠捕获法相比，本发明能无差别的吸附样品中的各种外泌体，适合所有场景的分离应用。三、本发明通过研究捕获粒子浓度和孵育时间两个主要参数对捕获效率的影响曲线，获得最佳捕获条件，捕获率可以接近60％。这种方便快捷、非特异性的外泌体捕获方法能适配于诊断、建库测序等多方面的外泌体研究中。本发明制备的经修饰后的纳米粒子和外泌体因亲和素和生物素牢固结合作用而完成高效捕捉，这种普适性的捕获更有利于建立外泌体的完整文库等下游分析。
附图说明
22.图1是本实施例1合成的二氧化硅纳米粒子的sem图(左，标尺长度为500nm)和实施例2合成的四氧化三铁包二氧化硅纳米粒子的tem图(右，标尺长度为100nm)；
23.图2是实施例1二氧化硅纳米粒子和实施例2四氧化三铁包二氧化硅纳米粒子逐步表面修饰后的zeta电位变化；
24.图3是实施例1所需捕获的外泌体样本的sem图(标尺长度为100nm)和粒子尺寸分布；
25.图4是实施例1捕获到外泌体的二氧化硅纳米粒子tem图(标尺长度为100nm)；
26.图5是捕获粒子浓度和孵育时间对捕获效率的影响规律图。
具体实施方式
27.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
28.实施例1
29.本实施例提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，包括以下步骤：
30.步骤一、纳米粒子表面修饰亲和素：
31.采用改进的磺酸化法制备二氧化硅纳米粒子：将6ml二氧化硅晶种、480ml无水乙醇、45ml氨水、75ml超纯水混匀作为母液，向其中同时滴加a液和b液，其中，a液为960ml正硅酸四乙酯和1200ml无水乙醇的混合液，b液为240ml氨水、1560ml无水乙醇、360ml超纯水的混合液；滴加(a、b液流速分别为7-8秒/滴和4-5秒/滴)完成后离心清洗，从而获得粒径均匀的二氧化硅纳米粒子。二氧化硅纳米粒子的直径为300纳米，如图1左图所示。
32.将二氧化硅纳米粒子浸泡在0.1wt％氢氧化钠水溶液中二十分钟，完成表面羟基活化。
33.将100μl氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)溶于5ml无水乙醇中，混入0.05g表面羟基活化的二氧化硅纳米粒子在300rpm转速下震荡6小时，再用无水乙醇洗涤一次，完成二氧化硅纳米粒子的表面氨基化修饰。
34.再将0.05g表面氨基化修饰的二氧化硅纳米粒子在20ml含有10m/v％吡啶和1nm对苯二异硫氰酸酯的n,n-二甲基甲酰胺溶液中搅拌反应两小时，然后依次用n,n-二甲基甲酰胺溶剂、无水乙醇和去离子水清洗，实现二氧化硅纳米粒子表面接枝异硫氰酸酯。
35.将400nmol已接枝异硫氰酸酯的二氧化硅纳米粒子与1000μg neutravidin亲和素脂质蛋白在37℃的去离子水中孵育一小时实现二者链接，再用含有1m/v％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液封闭，再用pbs缓冲液清洗3遍，即得到粘附有亲和素的捕获粒子。表面修饰可由通过zeta电位测试验证，如图2所示。
36.步骤二、外泌体标记生物素：
37.通过改进的pkh26探针标记流程在1ml的diluent c缓冲液中预混10μl所需捕获的外泌体样品(1*10
11
个)和50μl 1nmol/μl的磷脂聚乙二醇生物素(dspe-peg-biotin)乙醇溶液(dspe-peg-biotin购于tanshui-tech.，分子量为400-5000mw，本实施例为2000mw，配制方法为0.02mg/2000mw＝0.1nmol的dspe-peg-biotin加到1ml乙醇中)，4℃孵育1h，dspe会插入外泌体磷脂双分子层中，外露的peg接头的生物素即形成捕获的分子靶点，即得到标记的外泌体。
38.步骤三、外泌体捕获：
39.将10μl标记的外泌体(1.6*10
11
个)加入1ml的diluent c缓冲液中，0.05g捕获粒子混入另外1ml的diluent c缓冲液中，将两溶液混合，4℃孵育75min，捕获粒子的亲和素与标记的外泌体的生物素结合，即完成外泌体的捕获。然后，8000rpm转速离心10分钟获得捕获到外泌体的二氧化硅纳米粒子，捕获率约为40％。其中，捕获前外泌体样品如图3所示，二氧化硅纳米粒子捕获到的外泌体如图4所示，图中箭头所指的即为捕获到的外泌体。
40.实施例2
41.本实施例提供一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法，包括以下步骤：
42.步骤一、纳米粒子表面修饰亲和素：
43.通过改进的方法制备四氧化三铁外包裹二氧化硅层纳米粒子：16ml无水乙二醇、0.26g无水三氯化铁粉末、1.2g乙酸钠粉末、0.4g聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐/4-苯乙烯磺酸∶马来酸(摩尔比率1∶1)粉末、4.5mg l-抗坏血酸粉末、20μl水，混匀两小时后加入0.24g氢氧化钠粉末，搅拌混匀两小时；之后将反应液装入聚四氟乙烯内罩的不锈钢反应釜，在马弗炉中煅烧，30分钟从30℃线性均匀升温到190℃；190℃维持540分钟；140分钟从190℃线性均匀降温至30℃；之后，分别用无水乙醇和去离子水清洗所获的fe3o4纳米颗粒三次，最终分散在去离子水中。将40ml纯乙醇、6ml上述fe3o4纳米颗粒分散液(0.4-0.8mmol/6ml)、2ml浓氨水混合，盖上保险膜超声分散十分钟；在50℃水浴环境中机械搅拌孵育10分钟；以每滴20秒的速度加入300μl的正硅酸乙酯。反应1小时后，用无水乙醇和去离子水清洗纳米颗粒三次，即获得fe3o4@sio2粒子。fe3o4@sio2粒子的直径为300纳米，如图1右图所示。
44.将fe3o4@sio2纳米粒子浸泡在0.1wt％氢氧化钠水溶液中二十分钟，完成表面羟基活化。
45.将100μl氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)溶于5ml无水乙醇中，混入0.05g表面羟基活化的fe3o4@sio2纳米粒子在300rpm转速下震荡6小时，再用无水乙醇洗涤一次，完成fe3o4@sio2纳米粒子的表面氨基化修饰。
46.再将0.010g的表面氨基化修饰的fe3o4@sio2纳米粒子在20ml含有10m/v％吡啶和1nm对苯二异硫氰酸酯的n,n-二甲基甲酰胺溶液中搅拌反应两小时，然后依次用n,n-二甲基甲酰胺溶剂、无水乙醇和去离子水清洗，实现fe3o4@sio2纳米粒子表面接枝异硫氰酸酯。
47.将0.005g的已接枝异硫氰酸酯的fe3o4@sio2纳米粒子与1000μg的neutravidin亲和素脂质蛋白在37℃的去离子水中孵育一小时实现二者链接，再用含有1m/v％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)缓冲液封闭，再用pbs缓冲液清洗3遍，即得到粘附有亲和素的捕获粒子。表面修饰可由通过zeta电位测试验证，如图2所示。
48.步骤二、外泌体标记生物素：
49.通过改进的pkh26探针标记流程在1ml的diluent c缓冲液中预混10μl所需捕获的外泌体样品(1.5*10
11
个)和50μl 1nmol/μl的磷脂聚乙二醇生物素(dspe-peg-biotin)乙醇溶液，4℃孵育1h，dspe会插入外泌体磷脂双分子层中，外露的peg接头的生物素即形成捕获的分子靶点，即得到标记的外泌体。
50.步骤三、外泌体捕获：
51.将10μl标记的外泌体(1.5*10
11
个)加入1ml的diluent c缓冲液中，0.005gg捕获粒子混入另外1ml的diluent c缓冲液中，将两溶液混合，4℃孵育75min，捕获粒子的亲和素与标记的外泌体的生物素结合，即完成外泌体的捕获。然后，8000rpm转速离心10分钟获得捕获到外泌体的fe3o4@sio2纳米粒子，捕获率约为35％。
52.其中，步骤三外泌体捕获的捕获粒子使用浓度和孵育时间是通过研究捕获粒子浓度和孵育时间对捕获效率的影响规律获得的，如图5所示。从图中可以看出捕获粒子浓度和孵育时间的最佳操作范围，对初始外泌体输入量在10
11
个量级时，400nmol的二氧化硅纳米粒子能较快和有效的吸附，进一步提高粒子量不会明显的改善捕获率。fe3o4@sio2纳米粒子规律图趋势类似。
53.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。