一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法和应用与流程

1.本发明属于植物提取物制备技术领域，具体涉及一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法和应用。


背景技术：

2.我国中药材资源丰富，但在药物或化工原料的制备中，产生的废渣较多，不仅造成环境污染，而且浪费了很多具有药物价值的成分，造成极大的浪费。如药材及饮片加工下脚料，化妆品原料制备后的下脚料等。因此，如何将这些中药材废渣变废为宝，同时减轻对环境的污染，是一个重要的问题。
3.赤灵芝是中药材灵芝的一种，根据颜色来命名，药用价值很高，具有抗炎、补血、治疗久病体虚、失眠等作用。赤灵芝富含多种功效成分，能够起到提高自身免疫力，促进免疫修复的功效，是重要的药物或化工原料成分。赤灵芝渣中除去孢子粉后，仍然还具有很多高药物价值的成分，如灵芝三萜、几丁质(壳聚糖)以及粗多糖、多种类氨基酸等。因此，对赤灵芝渣进行二次利用，提取出活性成分，对中药材资源的利用以及环境的保护均具有重要意义。但是因为赤灵芝渣相较于其他植物，其细胞壁结构紧密，难以破除，这也导致其中的活性成分难以被提取出来。目前的提取方法在提取赤灵芝渣中活性成分时，破壁效率低、速度慢或者破壁率高但是有效成分流失率比较高，对活性成分的损失较大，得到的提取物无法表现出良好的抗氧化、抗炎等性能；同时提取中残留较多对人体影响较大的溶剂，严重影响了提取物的二次利用，尤其是在化妆品领域中的应用。
4.因此，亟需提供一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，能够有效减少灵芝渣中活性成分的流失，提高提取物的抗氧化性和抗炎效果。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出灵芝提取物的制备的方法，能够有效减少灵芝渣中活性成分的流失，提高灵芝提取物的抗氧化性和抗炎效果。
6.本发明第一方面提供了一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法。
7.具体地，一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
8.将灵芝渣粉碎，过筛，加入低共熔溶剂和酶制剂得反应液，然后进行酶解反应，再固液分离得上清液，干燥，制得所述灵芝提取物；
9.所述酶制剂包含纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶。
10.优选地，所述纤维素酶与所述半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的质量比为(8-12)：(0.5-2)：(0.5-2)：(8-12)；进一步优选地，所述纤维素酶与所述半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的质量比为(8-12)：(0.8-1.5)：(0.8-1.5)：(8-12)；更优选地，所述纤维素酶与所述半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的质量比为(9-11)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(9-11)；最优选地，所述纤维素酶与所述半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10。
11.优选地，在所述反应液中，所述酶制剂的质量百分数为0.05％-0.8％；进一步优选地，在所述反应液中，所述酶制剂的质质量百分数为0.1％-0.5％。
12.优选地，所述蛋白酶为中性蛋白酶。采用中性蛋白酶能够避免低共熔溶剂对其酶活力的影响，稳定、持续地发挥酶解作用，有利于提高酶解效率。
13.优选地，所述纤维素酶的酶活力值为2500-3500u/g，所述半纤维素酶的酶活力值为1000-2000u/g，所述蛋白酶的酶活力值为3-6万u/g，所述果胶酶的酶活力值为3-5万u/g。
14.优选地，所述灵芝渣为赤灵芝渣。
15.优选地，所述过筛的过程为过60-120目的筛子；进一步优选地，所述过筛的过程为过80-120目的筛子。
16.优选地，所述低共熔溶剂包括氯化胆碱和羧酸。
17.优选地，所述羧酸选自苹果酸、柠檬酸、乳酸、醋酸或没食子酸中的至少一种。选择天然植物来源的酸，不仅氢键供体效果强，与氯化胆碱组成的低共熔溶剂对灵芝渣中活性成分几丁质、灵芝多糖等的作用力强，萃取效率高；而且安全可靠，可以应用于化妆品中。
18.优选地，所述氯化胆碱与所述羧酸的物质的量的比为1：(0.2-3)；进一步优选地，所述氯化胆碱与所述羧酸的物质的量的比为1：(0.5-3)。
19.优选地，所述低共熔溶剂的制备方法，包括以下步骤：于50-80℃下，将所述氯化胆碱与所述羧酸混合，反应2-5小时，制得所述低共熔溶剂。
20.优选地，所述低共熔溶剂的质量为所述反应液的质量的0.5-5％；进一步优选地，所述低共熔溶剂的质量为所述反应液的质量的0.5-3％；更优选地，所述低共熔溶剂的质量为所述反应液的质量的0.5-1.5％。
21.优选地，所述酶解反应的温度为40-55℃，所述酶解反应的时间为8-15h，进一步优选地，所述酶解反应的温度为45-55℃，所述酶解反应的时间为10-15h。
22.优选地，在加入低共熔溶剂进行酶解反应之前，先加入酶制剂反应0.2-3h，再加入低共熔溶剂共同反应。先采用单独的酶制剂进行酶处理，然后与所述低共熔溶剂共同酶解，更有利于灵芝渣中活性物质的溶出以及减少活性物质的流失。需要说明的是，单独酶解处理时所用到的酶制剂也包含纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶，与共同酶解时的酶制剂可以保持一致。
23.优选地，在进行粉碎的步骤之前，还包括将所述灵芝渣进行灭菌、干燥处理，以确保林芝提取物的品质。
24.优选地，所述干燥的方式为冷冻干燥或喷雾干燥。
25.本发明第二方面提供了一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法的应用。
26.具体的，上述利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法在制备化妆品中的应用。
27.本发明采用纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶四种混合酶对灵芝渣进行处理，并辅以低共熔溶剂进行催化，由于低共熔溶剂含有可移动质子，可以加速介质的迁移速度，从而提高酶解速率和转化率，有利于灵芝中活性物质，如壳聚糖、灵芝多糖的溶出，以及活性的保留，使制备的灵芝提取物具有高抗炎和抗氧化性。
28.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
29.(1)本发明提供了利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，采用低共熔溶剂和酶制剂共同对废弃的灵芝渣进行处理，并通过纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的配合使
用，能够温和地提高破壁率，有效减少灵芝渣中活性成分的流失，提高灵芝提取物的抗氧化性和抗炎效果。
30.(2)本发明提供的方法，操作简单，且制备中不添加任何香精、防腐剂、增稠剂和乳化剂等化学添加物，所用试剂均为化妆品可使用的原料，制备的灵芝提取物能够直接应用于化妆品中，对皮肤安全、无刺激，具有较高的抗炎、抗氧化的功效。
具体实施方式
31.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
32.以下实施例中纤维素酶：品牌ssolarbio，货号c8270，cas号：9012-54-8，3000u/g；半纤维素酶：品牌ssolarbio，货号h8110，cas号：9025-56-3，1500u/g；中性蛋白酶：品牌ssolarbio，货号z8031，cas号：9068-59-1，5万u/g；果胶酶：品牌ssolarbio，货号p8181，cas号：9032-75-1，4万u/g；赤灵芝：吉林长白山赤灵芝；赤灵芝渣为大药厂、药店的赤灵芝废弃物；氯化胆碱和各类羧酸均来自药品级别的麦克林试剂。其他原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
33.实施例1
34.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
35.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
36.(2)制备低共熔溶剂：在水浴70℃左右，加入物质的量比约1：2左右的氯化胆碱液体和苹果酸粉末，反应4个小时左右，制得氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂。
37.(3)制备赤灵芝提取物
38.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，再于45℃下进行酶解反应，待酶解反应进行半个小时后，加入氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂(氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂的质量为反应液质量的1％)进行酶解反应；待酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
39.实施例2
40.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
41.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
42.(2)制备低共熔溶剂：在水浴70℃左右，加入物质的量比约1：3左右的氯化胆碱液体和柠檬酸粉末，反应4个小时左右，制得氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂。
43.(3)制备赤灵芝提取物
44.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过
100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，再于45℃下进行酶解反应，待酶解反应进行半个小时后，加入氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂(氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂的质量为反应液的1％)进行酶解反应；待酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
45.实施例3
46.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
47.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
48.(2)制备低共熔溶剂：在水浴70℃左右，加入物质的量比约1：1左右的氯化胆碱液体和乳酸粉末，反应4个小时左右，制得氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂。
49.(3)制备赤灵芝提取物
50.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，再于45℃下进行酶解反应，待酶解反应进行半个小时后，加入氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂(氯化胆碱-乳酸低共熔溶剂的质量为反应液的1％)进行酶解反应；待酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
51.实施例4
52.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
53.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
54.(2)制备低共熔溶剂：在水浴70℃左右，加入物质的量比约1：1左右的氯化胆碱液体和没食子酸粉末，反应4个小时左右，制得氯化胆碱-没食子酸低共熔溶剂。
55.(3)制备赤灵芝提取物
56.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，再于45℃下进行酶解反应，待酶解反应进行半个小时后，加入氯化胆碱-没食子酸低共熔溶剂(氯化胆碱-没食子酸低共熔溶剂的质量为反应液的1％)进行酶解反应；待酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
57.实施例5
58.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
59.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：
1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
60.(2)制备低共熔溶剂：在水浴70℃左右，加入物质的量比约1：3左右的氯化胆碱液体和柠檬酸粉末，反应4个小时左右，制得氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂。
61.(3)制备赤灵芝提取物
62.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，再加入1g氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂(氯化胆碱-柠檬酸低共熔溶剂的质量为反应液质量的1％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，并同时加入，在45℃下进行酶解反应；待酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
63.对比例1
64.一种利用灵芝渣制备灵芝提取物的方法，包括以下步骤：
65.(1)称取酶制剂：按照纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的质量比为10：1：1：10，分别称取酶制剂混合，其中，纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶的活力分别为：3000u/g、1500u/g、5万u/g和4万u/g。
66.(2)制备赤灵芝提取物
67.将赤灵芝渣进行灭菌、干燥处理，对于大块或者结块的赤灵芝渣进行粉碎研磨，过100目的筛，得赤灵芝渣粉。然后称取29.9g赤灵芝渣粉，加入69.8g水和0.3g步骤(1)制备的酶制剂(酶制剂的质量浓度为0.3％)，采用柠檬酸缓冲溶液控制ph值在6.0左右，再于酶解反应12小时后，得到的酶解液；将酶解液离心过滤，取上层清液，得到赤灵芝渣酶解提取液。将得到的提取液进行高温喷雾干燥处理，得到粉末状的赤灵芝提取物，将其真空灭菌密封保存。
68.产品效果测试
69.1.dpph抗氧化实验
70.对实施例1-5和对比例1制备的赤灵芝提取物进行dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力测试。
71.目前对于抗氧化测试研究方法主要有两类，一类是体外模型，另一类是体内模型。其中，dpph法是体外模型中最常用的方法。dpph又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，其稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不对称的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇乳液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或者替代dpph自由基，使得自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力，即通过在517nm波长处检测样品清楚dpph自由基的效果来计算抗氧化能力。dpph法测定赤灵芝渣酶解物的抗氧化活性的作用机理可以是直接作用在自由基或者间接消耗容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。
72.(1)dpph储备液的制备
73.准确称取dpph试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10ml容量瓶中，用无水乙
醇定容至刻度，取2ml至100ml的容量瓶中，摇匀得到浓度为0.0178mmol/l的dpph储备液，置于冰箱中冷藏备用。
74.(2)试液的制备
75.分别准确称取5ml实施例1-5和对比例1中的赤灵芝提取物，用无水乙醇溶解，并定量转入100ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，得到5％的试液。
76.(3)dpph自由基清除率的测定
77.在10ml比色管中加入4.0ml的dpph溶液和1ml赤灵芝渣酶解物，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(a)，吸光值为ai，然后在室温避光30min后测吸光值为aj，对照组只加入dpph的乙醇溶液，其吸光值为ac。
78.按照公式计算自由基清除率(k)：k(％)＝[1-(ai-aj)/ac]
×
100％，实施例1-5和对比例1的dpph自由基清除结果如下表1所示。
[0079]
表1
[0080]
样品dpph自由基清除率(％)实施例185.91％实施例290.15％实施例388.34％实施例489.11％实施例587.28％对比例165.01％
[0081]
从以上结果可以看出，实施例2的dpph自由基清除率最高，氯化胆碱-柠檬酸组合的低共熔溶剂对于赤灵芝渣酶解反应催化得到的提取物抗氧化活性最高，而没有加入低共熔溶剂的对比例1得到的提取物的抗氧化活性最低。
[0082]
2.抗炎实验
[0083]
对实施例1-5和对比例1制备的灵芝提取物进行透明质酸酶抑制率测试。
[0084]
透明质酸酶是i型过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，研究报告各种肥大细胞的释放组胺的药物能够调节透明质酸酶的活性，一些抗敏药物具有强的抑制透明质酸酶活性，因此，抑制透明质酸酶活性可以作为研究过敏作用的指标。
[0085]
(1)试剂准备：
[0086]
透明质酸酶：浓度为500u/ml，现配现用，不能过夜，用醋酸缓冲液做溶剂；
[0087]
透明质酸钠：0.5mg/ml，一次配制，多次使用，用醋酸缓冲液做溶剂；
[0088]
buffer：溶液a(0.2mol/l醋酸，11.55ml冰醋酸溶于1l蒸馏水中)4.8ml，
[0089]
溶液b(0.2mol/l醋酸钠，16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1l蒸馏水中)45.2ml，混合稀释至100ml，配制成ph＝5.6的醋酸缓冲液；
[0090]
乙酰丙酮溶液：50ml 1.0mol/l碳酸钠溶液和3.5ml乙酰丙酮溶液混合均匀(现配现用)；
[0091]
dab显色剂：0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇混合均匀；
[0092]
氯化钙溶液cacl2：2.5mol/l；
[0093]
氢氧化钠溶液naoh：5mol/l；
[0094]
分别将实施例1-5和对比例1制备的灵芝提取物溶于水中，制备浓度为1.2mg/ml的
样品溶液备用。
[0095]
(2)实验步骤：
[0096]
准备四个试管a、b、c、d：
[0097]
试管a加入样品溶液0.5ml，0.5ml透明质酸酶；试管b加入0.5ml的样品溶液和0.5ml的醋酸缓冲液；试管c加入0.5ml的去离子水和0.5ml透明质酸酶；试管d加入0.5ml去离子水和0.5ml醋酸缓冲液；将四个试管在37℃下保温20min；
[0098]
试管a-d分别加入cacl2溶液0.1ml在37℃下保温20min；
[0099]
试管a和c加入0.5ml的透明质酸钠，试管b和试管d加入0.5ml的醋酸缓冲液，将四个试管在37℃下保温40min，放置室温10min；
[0100]
试管a-d分别加入0.5ml去离子水、0.1mlnaoh溶液和0.5ml乙酰丙酮溶液，沸水浴15min，冰浴10min；放置室温10min；
[0101]
试管a-d分别加入p-dab试剂1ml，各管充分震荡后加入无水乙醇至8ml，放置室温30min，在530nm处测试吸光值。
[0102]
(3)计算透明质酸酶抑制率：
[0103]
透明质酸酶抑制率(％)＝[(c-d)-(a-b)]/(c-d)
×
100％，
[0104]
其中：a—(透明质酸酶 样品 透明质酸钠)试样溶液的od值，
[0105]
b—(醋酸缓冲液 样品 醋酸缓冲液)试样空白的od值，
[0106]
c—(透明质酸酶 去离子水 透明质酸钠)对照溶液的od值，
[0107]
d—(醋酸缓冲液 去离子水 醋酸缓冲液)对照空白的od值。
[0108]
测试结果见表2。
[0109]
表2
[0110]
样品透明质酸酶抑制率(％)实施例189.27％实施例292.07％实施例385.00％实施例490.12％实施例588.68％对比例175.33％
[0111]
从以上结果可以看出，实施例2对于透明质酸酶抑制率最高氯化胆碱-柠檬酸组合的低共熔溶剂对于赤灵芝渣酶解反应催化得到的提取物抗炎活性最高，而没有加入低共熔溶剂的对比例1得到的提取物抗炎活性最低。
[0112]
此外，在研究中发现，酶制剂组分的选择也是至关重要的，当仅含有上述四种酶中的三种、两者或一种，或替换为其他酶制剂时，制备的灵芝提取物的抗氧化和抗炎效果都不及实施例1-5。